Generación y caracterización de organoides de útero de rata a partir de células madre epiteliales endometriales de rata

Resumen

En este trabajo se presenta un protocolo para aislar y cultivar células madre epiteliales endometriales (reESCs) de rata, generando organoides endometriales de rata. Este método facilita los estudios in vitro de las enfermedades endometriales, permitiendo la edición génica y otras manipulaciones celulares.

Resumen

Los organoides endometriales ofrecen información valiosa sobre el desarrollo y la fisiopatología de las enfermedades endometriales y sirven como plataformas para las pruebas de fármacos. Si bien se han desarrollado organoides endometriales humanos y de ratón, la investigación sobre los organoides endometriales de rata sigue siendo limitada. Dado que las ratas pueden simular mejor ciertas patologías endometriales, como las adherencias intrauterinas, este estudio tuvo como objetivo establecer organoides endometriales en ratas. Presentamos un protocolo detallado para el aislamiento y cultivo de células madre epiteliales endometriales de rata (reESCs) y la generación de organoides endometriales de rata. Utilizando un medio de expansión de reESCs refinado, aislamos con éxito y expandimos de manera estable las reESC, demostrando su potencial de cultivo a largo plazo. Los organoides generados por reESC exhibieron características estructurales y funcionales típicas del endometrio, incluida la capacidad de respuesta hormonal. Nuestros resultados mostraron que los organoides endometriales de rata podían cultivarse a largo plazo con proliferación estable, manteniendo la estructura glandular, la polaridad celular y las características funcionales del epitelio endometrial. Este novedoso modelo de organoide endometrial derivado de ratas proporciona una valiosa plataforma para estudiar las enfermedades endometriales y probar intervenciones terapéuticas, con posibles aplicaciones en varias especies de mamíferos.

Introducción

El endometrio, un tejido versátil y regenerativo en el cuerpo humano, experimenta una muda, regeneración y diferenciación periódicas bajo la influencia de las^hormonas ováricas. Las anomalías en el endometrio están relacionadas con diversas enfermedades del sistema reproductivo femenino, como la endometriosis, el cáncer de endometrio y la infertilidad². La falta de modelos de investigación fiables para el endometrio dificulta los estudios en profundidad de la patogenia, el diagnóstico clínico y el tratamiento de estas enfermedades. Si bien las líneas celulares y los modelos animales se utilizan comúnmente para la investigación endometrial, desafíos como la inestabilidad fenotípica en las líneas celulares, las diferencias entre especies en modelos animales y otras limitaciones dificultan la replicación de la compleja estructura fisiológica y los cambios funcionales dinámicos en el endometrio humano^.

Los organoides son estructuras tridimensionales formadas por el cultivo de células madre en un entorno extracelular, que poseen capacidades de autorrenovación y autoorganización. Pueden imitar la estructura y función de los tejidos fisiológicos y patológicos y son reconocidos como modelos preclínicos de enfermedades humanas⁴. En 2017, se logró la construcción exitosa de organoides endometriales de ratón y humanos mediante la incorporación de tejido endometrial libre fragmentado obtenido a través de la digestión enzimática en un andamio de matriz extracelular, seguido de la adición de una mezcla de factores de crecimiento específicos y factores de señalización para el cultivo⁵. Los resultados demostraron que los organoides endometriales ex vivo exhiben una capacidad proliferativa estable y a largo plazo, manteniendo la estructura glandular, la polaridad celular y las características funcionales del epitelio endometrial, incluyendo la secreción de moco y la respuesta hormonal⁶. Sin embargo, el cultivo ex vivo de células madre adultas que forman los organoides endometriales requiere un soporte estructural similar a una glándula, lo que lleva a desafíos como la pérdida de tallo y dificultades para el paso⁷.

Actualmente, el cultivo de organoides endometriales se basa en el método de cultivo de digestión en bloques de tejidos. En un estudio anterior, nuestro equipo de investigación cultivó células madre epiteliales endometriales humanas durante un período prolongado in vitro utilizando un medio de cultivo primario compuesto principalmente por Y27632, que empleamos para construir organoides endometriales⁸. Sobre la base de este éxito, aislamos y cultivamos células madre epiteliales endometriales a partir de tejido endometrial de rata utilizando un medio de cultivo compuesto de molécula pequeña, estableciendo un sistema de cultivo in vitro a largo plazo. Además, utilizamos células madre epiteliales endometriales de rata (reESCs) para generar organoides endometriales de rata. El desarrollo de este modelo mejorará los futuros estudios in vitro e in vivo de enfermedades relacionadas con el endometrio junto con modelos de ratas.

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Protocolo

En este trabajo se utilizaron seis ratas Sprague-Dawley hembras de 7/8 semanas de edad con un peso de 200-250 g. Las ratas fueron alojadas en un animalario climatizado con acceso ad libitum a alimentos y agua. Todos los procedimientos experimentales con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices Institucionales para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por la junta de revisión institucional para experimentos con animales en el Comité de Ética de Investigación del Hospital Popular de Meizhou.

La siguiente sección describe el proceso para aislar, pasar, congelar y descongelar células madre epiteliales endometriales de rata utilizando un medio de expansión de reESC refinado (REEM) compuesto principalmente por Y27632, A8301 y CHIR990217 ^8,9. La formulación de REEM se basa en DMEM/F12 sin suero enriquecido con concentraciones específicas de componentes clave: 10 μM Y27632, 3 μM CHIR99021 y 0,5 μM A8301. Los detalles completos sobre los componentes se pueden encontrar en la Tabla de materiales. Una vez que las ratas han sido anestesiadas con inhalación de isoflurano, se deben implementar los procedimientos posteriores descritos en la Figura 1.

1. Procedimiento quirúrgico

1. Anestesiar a la rata por inhalación de isoflurano.
   1. Coloque las ratas en una cámara de inducción llena de isoflurano al 3-5% mezclado con oxígeno. Confirmar la anestesia adecuada por la ausencia de respuesta a un pinzamiento del dedo del pie y la pérdida del reflejo de enderezamiento.
   2. Una vez anestesiadas, mantenga a las ratas bajo 1-3% de isoflurano a través de un cono nasal durante el procedimiento. Aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad mientras la rata está bajo anestesia.
2. Haga una incisión en la línea media del abdomen para exponer los cuernos del útero.
   NOTA: Todos los instrumentos quirúrgicos deben esterilizarse antes de su uso. El área quirúrgica de la rata se afeita y se desinfecta con una solución antiséptica. El cirujano usa guantes estériles, una mascarilla y una bata. El procedimiento quirúrgico se realiza sobre un paño estéril.
3. Realizar incisiones longitudinales en ambos lados del útero para exponer el endometrio interno. Use una hoja de bisturí T10 para raspar el endometrio hasta que la superficie esté áspera.
4. Después del procedimiento quirúrgico, transfiera a las ratas a un área de recuperación estéril y cálida con niveles regulados de temperatura y humedad y vigílelas de cerca hasta que recuperen la conciencia completa y puedan sostenerse en una posición reclinada esternal. Aloje grupos de tres ratas postoperatorias por separado en jaulas separadas. Para aliviar el dolor postquirúrgico, administrar analgésicos como buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg, por vía subcutánea); Repita cada 8-12 h durante un máximo de 48-72 h según sea necesario.

2. Procesamiento de tejidos

1. Coloque todos los fragmentos de endometrio uterino en un plato de 3,5 cm y lávelos 3 veces con PBS.
2. Mezclar los fragmentos de endometrio uterino con 3 mL de colagenasa tipo I al 1% (diluida en tripsina al 0,25%/EDTA al 1 mM) a 37 °C durante 60 min. Filtre el tejido no digerido con un colador de células de 100 μm para aislar y recoger el filtrado para su posterior cultivo.
3. Siembre las células recolectadas en placas de 12 pocillos en medio REEM para su posterior cultivo. Calcule el volumen de la suspensión celular necesaria para sembrar las células en cada pocillo de la placa de 12 pocillos para lograr la densidad celular deseada (típicamente ~ 1-2 × 10⁵ celdas/pocillo en 1,5 mL de REEM).
4. Lave las células recogidas en el paso 2.2 durante 3 veces con PBS. Después del lavado inicial, centrifugar las células a 300 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante; resuspender el pellet celular en PBS que contenga un 1% de BSA (albúmina sérica bovina) para minimizar la unión inespecífica e incubar durante 15-30 min en hielo.
5. Incubar las células con anticuerpos primarios específicos para diferentes marcadores (ver la Tabla de Materiales) durante 30 min a 1 h a 4 °C. Diluya los anticuerpos en PBS con 1% de BSA según las instrucciones del fabricante.
6. Después de la incubación, lave las células 2 veces con PBS para eliminar los anticuerpos no unidos. Después del lavado final, vuelva a suspender las células en 600 μL de PBS con BSA al 1% para el análisis de citometría de flujo.
7. Configure el instrumento con láseres y filtros apropiados para los fluoróforos utilizados en el experimento (por ejemplo, FITC, PE, APC). Utilice los ajustes de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) para bloquear la población viva de una sola célula, excluyendo los desechos y los agregados de células. Calibre el citómetro de flujo utilizando un control sin manchas para garantizar una alineación adecuada. Establezca puertas específicas basadas en el control no teñido para definir poblaciones positivas para cada marcador de interés (el umbral es 0,02%).

3. Cultivo a largo plazo de células madre epiteliales endometriales de rata

1. Ensayo de formación de colonias
   NOTA: Este ensayo ayudó a determinar el medio de cultivo óptimo para las reESC.
   1. Siembre las reESC P0 en placas de 6 pocillos a una densidad de 1.000 células/pocillo y cultívelas durante 14 días en REEM o REEM sin A8301, Y27632 o CHIR99021.
   2. Después del período de cultivo, fije las células con paraformaldehído al 4% durante 20 min a temperatura ambiente y posteriormente tíñalas con solución de violeta cristalina durante otros 20 min.
   3. Cuantifique el número de grupos de células que contienen más de 50 células. Seleccione el medio de cultivo en función del medio que favorece el crecimiento de los grupos de células.
      NOTA: La omisión de factores específicos del REEM resultó en una disminución de la capacidad proliferativa de las reESC (Figura 1B, C). Sobre la base de estos hallazgos, se seleccionó REEM como el medio preferido para el cultivo de reESCs con el fin de optimizar las condiciones de cultivo.
2. Cambie el REEM cada 2 días. Cuando las células alcancen el 80-90% de confluencia, digerirlas con tripsina al 0,25%/EDTA 1 mM durante 5-6 min.
3. Pase las celdas en una proporción de 1:3 en REEM.
4. Ensayo de proliferación
   1. Siembre las reESC P1, P7 y P14 en placas de 96 pocillos a una densidad de 4 × 10³ células/pocillo en 150 μL de REEM.
   2. Añada 10 μl de reactivo CCK-8 a cada pocillo después de 24, 48, 72 y 96 h de cultivo, seguido de una incubación de 2 h a 37 °C.
   3. Determine la tasa de proliferación midiendo la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas.
5. Preparación y uso de existencias congeladas
   1. Prepare la solución madre congelada utilizando REEM con DMSO al 10%.
   2. Coseche las reESC con 0,25% de tripsina/1 mM de EDTA.
   3. Vuelva a suspender el pellet de celda en una solución madre congelada a una concentración de 1 × 10⁶ células/mL. Transfiera la suspensión celular a tubos.
   4. Congele los tubos primero a -80 °C y luego transfiéralos a nitrógeno líquido dentro de las 24 h.
      NOTA: Si tiene la intención de descongelar las células pronto, se recomienda almacenar las células congeladas a -80 °C durante un período máximo de 6 meses.
   5. Precalienta el REEM a 37 °C.
   6. Recupere los REESC congelados y sumérjalos en un baño de agua a 37 °C durante 1-2 minutos.
   7. Transfiera las reESC descongeladas a placas de 6 pocillos con una densidad de siembra de 1 × 10⁵ células/pocillo en REEM.
6. Tinción de inmunofluorescencia
   1. Siembre las REESC en la fase de crecimiento logarítmico en placas u-Slide de 8 pocillos a una densidad de 2 × 10³ células por pocillo y cultícelas en REEM.
   2. Cuando las reESC alcancen el 90% de confluencia, fíjelas con paraformaldehído al 4% durante 20 min. Lave los reESC con PBS 2x antes y después de la fijación.
   3. Permeabilizar las células con Triton X-100 al 0,2% durante 10 min.
   4. Bloquear las células con un 30% de suero de cabra diluido en albúmina sérica bovina (BSA) al 5% durante 30 min a temperatura ambiente. Lave los reESC con PBS 2x antes y después del bloqueo.
   5. Incubar las células con anticuerpos primarios (anti-SSEA-1 y anti-Citoqueratina) durante 12 h a 4 °C. Lave los reESC con PBS 2x después de la incubación.
   6. Incubar las células con anticuerpos secundarios durante 1 h a temperatura ambiente. Lave los reESC con PBS 2x después de la incubación.
   7. Contratinción de las células con 150 μL de DAPI para marcar todos los núcleos.
   8. Capture imágenes de las células teñidas con un microscopio confocal invertido.

4. Establecimiento de organoides endometriales de rata a partir de reESCs

1. Generación de los organoides
   1. Cuando las reESC alcancen el 70% de confluencia, digiera las células con tripsina al 0,25%/EDTA 1 mM durante 5-6 min.
   2. Vuelva a suspender 5 × 10⁵ reESC en 500 μL de Matrigel descongelado y colóquelo en placas de 12 pocillos. Incubar las placas a 37 °C durante 20 min para permitir la gelificación.
   3. Una vez que la mezcla de célula y Matrigel se solidifique, agregue 1,5 mL/pocillo de REEM para cubrir el Matrigel. Cambie el REEM cada 2-3 días.
2. Tinción de inmunofluorescencia
   1. Aspire el REEM y agregue 1 mL/pocillo de solución de recolección de organoides preenfriada en las placas de 12 pocillos. Incubar en hielo durante 40-60 min.
   2. Recoja los organoides con una pipeta Pasteur y centrifuga a 300 × g durante 3 min a 4 °C.
   3. Enjuague los organoides 2-3 veces con PBS.
   4. Fije los organoides con paraformaldehído al 4% durante 20 min y bloquee con BSA al 5% durante 60 min.
      NOTA: Lave 2 veces con PBS antes y después de cada paso.
   5. Incubar los organoides durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios diluidos en BSA al 1%.
   6. Incubar los organoides con anticuerpos secundarios durante 1 h a temperatura ambiente.
   7. Contratinción de los organoides con 200 μL de DAPI.
   8. Captura de imágenes con un microscopio confocal invertido.
3. Tinción HE
   1. Deshidratar los organoides a través de una serie de etanol graduado: etanol al 70% durante 30 min; etanol al 80% durante 30 min; etanol al 95% durante 30 min; 100% etanol para 2 x 30 min. Limpie los organoides sumergiéndolos en xileno durante 2 x 30 min.
   2. Sumerja los organoides aclarados en parafina derretida a 60 °C durante 1 h. Transfiera los organoides infiltrados en parafina a moldes de inclusión, llene los moldes con parafina derretida y coloque los moldes en una placa fría para que la parafina se solidifique. Retire los bloques de parafina de los moldes después de que la parafina se haya solidificado y recorte el exceso de parafina.
   3. Monta los bloques de parafina en el micrótomo. Cortar secciones de 5 μm de grosor y hacerlas flotar en un baño de agua tibia (42-45 °C) para aplanarlas. Transfiera con cuidado las secciones a portaobjetos de vidrio y séquelas en un calentador de portaobjetos.
   4. Desparafinar las secciones sumergiendo los portaobjetos en xileno durante 2 x 5 min. Rehidratar a través de una serie de etanol graduado: etanol 100% durante 2 x 3 min; Etanol al 95% durante 3 min; etanol al 70% durante 3 min; Enjuague con agua destilada.
   5. Teñir con hematoxilina durante 5 min; Luego, enjuague con agua corriente del grifo durante 5 minutos. Diferenciar en alcohol ácido al 1% durante unos segundos; enjuague con agua corriente del grifo durante 5 minutos; colocar en azul en agua con amoníaco al 0,2% durante 30 s; enjuague con agua corriente del grifo durante 5 minutos; Teñir con eosina durante 2 min. Deshidratar a través de etanol graduado: 70% de etanol durante 1 min; etanol al 95% durante 1 min; Etanol 100% durante 2 x 1 min. Transparente en xileno durante 2 x 1 min.
   6. Agregue una gota de medio de montaje a las secciones manchadas. A continuación, coloque un cubreobjetos sobre la sección de pañuelo, evitando las burbujas de aire. Observe las secciones manchadas bajo un microscopio óptico.
4. Tinción de fluorescencia
   1. Realice la desparafinación y la rehidratación como se describe en los pasos 4.3.1. al punto 4.3.4.
   2. Precaliente la solución de recuperación de antígenos en un horno microondas. Coloque los portaobjetos en la solución de recuperación de antígenos calentada y manténgalos a temperatura de ebullición durante 20 minutos. Deje que los portaobjetos se enfríen en la solución de recuperación de antígenos durante 40 minutos. Enjuague los portaobjetos en agua desionizada durante 5 min.
   3. Incubar los portaobjetos en peróxido de hidrógeno al 0,3% en metanol durante 10 minutos para calmar la actividad de la peroxidasa endógena. Enjuague los portaobjetos durante 3 x 5 min en PBS e incubelos en solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Retira el exceso de solución bloqueadora, pero no enjuague.
   4. Diluya el anticuerpo primario en la solución bloqueante de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aplique el anticuerpo primario diluido a las secciones de tejido e incube durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada.
   5. Lave los portaobjetos durante 3 x 5 minutos en PBS. Diluya el anticuerpo secundario conjugado con HRP en una solución bloqueante de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aplique el anticuerpo secundario diluido a las secciones de tejido e incube durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Lave los portaobjetos durante 3 x 5 min en PBS para eliminar el anticuerpo secundario no unido.
   6. Prepare la solución de trabajo de fluoresceína tiramida de acuerdo con las instrucciones del kit. Aplique la solución de trabajo a las secciones de tejido e incube durante 15 min a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Enjuague los portaobjetos durante 3 x 5 minutos en PBS.
   7. Repita el paso 4.4.1. hasta 4.4.5 hasta que se haya completado la tinción con los tres anticuerpos. Aplique una gota de medio de montaje fluorescente con DAPI a cada sección de tejido. Coloque con cuidado un cubreobjetos sobre la sección de pañuelos para evitar burbujas de aire. Examine los portaobjetos del microscopio confocal invertido.
5. PCR cuantitativa
   1. Recoja los organoides como se describe en los pasos 4.2.1. al punto 4.2.3. Aspire el PBS y extraiga los ARN totales de los organoides siguiendo las instrucciones del fabricante.
   2. Utilice cualquier kit de transcripción inversa disponible en el mercado para sintetizar ADNc a partir de 1 μg de ARN total. Configure una reacción de q-PCR de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit. Consulte la Tabla de materiales para conocer las secuencias de cebadores utilizadas para la q-PCR.

5. Cultivo a largo plazo de organoides endometriales de rata

1. Aspirar el REEM y añadir 1 mL de Solución de Recolección de Organoides durante 40 min para disociar los organoides. Incubar en hielo para mantener la integridad de los organoides.
2. Después de la incubación, recoja los organoides con una pipeta Pasteur y centrifugue a 300 × g durante 3 min a 4 °C para pellets para su posterior procesamiento.
   NOTA: El recorte de la punta de la pipeta puede ser útil para manipular organoides más grandes (más de 500 μm) sin causar daños.
3. Resuspender los organoides peletizados en Matrigel, en una proporción de 1:2 o 1:3, para su inclusión y posterior cultivo en placas de 12 pocillos.
4. Preparar la solución madre congelada: REEM con 10% de DMSO.
5. Coseche los organoides, vuelva a suspenderlos en la solución madre congelada y luego guárdelos en un congelador a -80 °C o en nitrógeno líquido para su conservación a largo plazo.
6. Para descongelar los organoides congelados, precaliente el REEM en un baño de agua a 37 °C y sumerja el tubo de caldo congelado en el baño de agua para descongelar suavemente los organoides.
7. Después de la descongelación, vuelva a suspender los organoides en 500 μL de Matrigel para volver a incrustarlos y cultivarlos en una placa de 12 pocillos. Siga los pasos 4.1.2. al punto 4.1.3.
   NOTA: Se recomienda almacenar los organoides congelados a -80 °C durante períodos más cortos o transferirlos a nitrógeno líquido para un almacenamiento a largo plazo.

6. Opcional: Transición de organoides a cultivo adherente

NOTA: El protocolo menciona un método alternativo para la obtención de reESCs de cultivo plano mediante la transición de organoides a cultivo adherente, lo que permite la reestructuración de la morfología de los organoides.

1. Aspirar el REEM y añadir 1 mL de Solución de Recolección de Organoides para disociar los organoides. Incubar en hielo para mantener la integridad de los organoides.
2. Después de la incubación, recoja los organoides con una pipeta Pasteur y centrífugue para peletizarlos a 300 × g durante 3 min a 4 °C.
3. Vuelva a suspender los organoides en 3 mL de REEM precalentado y transfiera los organoides resuspendidos a un plato de 3,5 cm. Cambie el medio REEM cada 2 días.
4. Cuando las células alcancen el 70% de confluencia, digerirlas con tripsina al 0,25%/EDTA 1 mM durante 5-6 min.
5. Reconstrucción de los organoides con reESCs siguiendo los pasos 4.1.1 a 4.1.3.

7. Cultivo secuencial de organoides con estradiol (_E2) y progesterona (P₄)

1. Prepare soluciones madre de E₂ y P₄ en DMSO. Diluir las soluciones madre hasta las concentraciones de trabajo deseadas (E₂: 10 nM; P₄: 1 μM) en REEM, asegurando que la concentración final de DMSO no supere el 0,1% para evitar efectos citotóxicos.
2. Cultivo de organoides en REEM como paso 4.1.1. al punto 4.1.3. durante 4 días. Sustituir el medio por REEM suplementado con E₂ y cultivo durante 7 días. Controle el crecimiento y la morfología de los organoides a diario. Cambie el medio cada 2-3 días.
3. Sustituya el medio por REEM complementado con E₂ y P₄. Controle el crecimiento y la morfología de los organoides a diario. Cambie el medio cada 2-3 días. Continúe cultivando los organoides durante 7 días.

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Resultados

Las reESCs y los organoides del útero de rata se establecieron a partir de seis ratas hembras Sprague-Dawley con un peso de entre 200 g y 250 g siguiendo el protocolo descrito en la Figura 1. Basándose en el éxito del cultivo a largo plazo de células madre epiteliales endometriales humanas, la formulación de REEM consistió principalmente en Y27632, A8301 y CHIR99021. Para estabilizar las reESCs in vitro, inicialmente aislamos células endometr...

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Discusión

En este estudio, hemos descrito un método sencillo para aislar y cultivar células madre epiteliales endometriales de rata (reESC) y hemos refinado el sistema ex vivo previamente establecido para células madre epiteliales endometriales humanas⁸. Nuestro enfoque utiliza un medio de cultivo de molécula pequeña que contiene Y27632, A8301 y CHIR99021 como componentes principales para permitir un cultivo ex vivo estable y a largo plazo. Además, g...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD15 (SSEA-1)	Abcam	ab135377	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-Estrogen Receptor alpha	Abcam	ab32063	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-pan Cytokeratin	Abcam	ab7753	Mouse, 1:250 (IHC)
Anti-Progesterone Receptor	Abcam	ab101688	Rabbit, 1:200 (IHC)
Anti-Ki67	Abcam	ab279653	Mouse, 1:250 (IHC)
A8301	TargetMol	909910-43-6
β-Estradiol	Merck	E8875
Cell Counting Kit-8	Beyotime	C0038
CD9	BioLegend	109819	1:20 (FC), Pacific Blue
CD24	BioLegend	101806	1:20 (FC), FITC
CD31	BioLegend	303120	1:20 (FC), APC
CD45	BioLegend	301703	1:20 (FC), PE
CHIR99021	TargetMol	CT99021
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D Systems	3700-100-01
Cy3 TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1051
Cy5 TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1052
DAPI	Sigma	D9542	1 μg/mL
DMEM/F-12	Invitrogen	11330032
EpCAM	BioLegend	369803	1:20 (FC), PerCP
Fluorescein TSA Fluorescence System Kit	APExBIO	K1050
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008	1:500
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	1:500
Goat Anti-rabbit IgG/HRP antibody	APExBIO	bs-0295G-HRP
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828028
Matrigel	Corning	356234
PrimeScript RT Master Mix	Takara	RR063A
Progesterone	Merck	57-83-0
Sprague-Dawley rat	Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, China
SSEA-1	BioLegend	323047	1:20 (FC), APC
TB Green Fast qPCR Mix	Takara	RR820A
TriZOL	Invitrogen	15596026CN	RNA extraction
u-Slide 8-well plates	Ibidi	80827
Y27632	TargetMol	146986-50-7
qPCR primers of target genes
Genes	Company	Sequences
rat GAPDH F	Sangon biotech	GACATGCCGCCTGGAGAAAC
rat GAPDH R	Sangon biotech	AGCCCAGGATGCCCTTTAGT
rat Nanog F	Sangon biotech	GACTAGCAACGGCCTGACTCA
rat Nanog R	Sangon biotech	CTGCAATGGATGCTGGGATA
rat Sox2 F	Sangon biotech	ATTACCCGCAGCAAAATGAC
rat Sox2 R	Sangon biotech	ATCGCCCGGAGTCTAGTTCT
rat Oct4 F	Sangon biotech	CCCAGCGCCGTGAAGTTGGA
rat Oct4 R	Sangon biotech	ACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA GG