Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لتقييم الإمكانات المناعية لأسطح الزرع في المختبر ، بهدف تحسين موثوقية وقابلية التكرار للبروتوكولات الحالية وتعزيز المزيد من البحث. تمت مراقبة ملامح السيتوكين الإفرازية ، وتعبير mRNA ، وعلامات سطح الخلية باستخدام البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة في الدم للتحقيق في استقطاب البلاعم المزروع على التيتانيوم.

Abstract

يلعب تفاعل الجسم الغريب (FBR) ، وهي عملية شفاء معقدة بوساطة المناعة ، دورا مهما في دمج الغرسات في الجسم. تلعب البلاعم ، باعتبارها الخط الأول لتفاعل الجهاز المناعي مع أسطح الزرع ، دورا ثنائي الاتجاه في تعديل توازن الالتهاب والتجديد. من أجل فهم عميق وتقييم التفاعلات بين مواد الزرع والاستجابات المناعية ، تعد الطرق والبروتوكولات الموثوقة في المختبر أمرا محوريا. من بين النماذج المختلفة في المختبر ، تقدم البلاعم الأولية المشتقة من الخلايا الوحيدة (MDMs) نموذجا ممتازا للتحقيق في تفاعلات البلاعم وغرسة. لقد قمنا بتنفيذ بروتوكول تجريبي لتقييم استقطاب MDMs إلى M1 (يتم تنشيطها كلاسيكيا) و M2 (تنشيطها بدلا من ذلك) على أسطح الزرع. قمنا بعزل خلايا الدم الوحيدة من المتبرعين الأصحاء وقمنا بتمييزها إلى ضامة باستخدام عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF). تم زراعة البلاعم المتمايزة على أسطح الزرع واستقطابها إلى أنواع فرعية M1 و M2. تم تحقيق استقطاب M1 في وجود الإنترفيرون (IFN)-γ وعديد السكاريد الدهني (LPS) ، بينما تم إجراء استقطاب M2 في وسط يحتوي على الإنترلوكين (IL) -4 و IL-13. قمنا بتقييم الأنماط الظاهرية للبلاعم عن طريق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، والفحص المجهري بالليزر متحد البؤر (CLSM) ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR) بناء على لوحات السيتوكينات المفرزة ، وعلامات سطح الخلية ، والجينات المعبر عنها. تم تحويل الحمض النووي الريبي المستخرج إلى حمض نووي تكميلي (cDNA) ، وتم استخدام qRT-PCR لتحديد كمية mRNA المرتبط بالضامة M1 و M2. وفقا لذلك ، تميزت البلاعم M1 بتعبير أعلى عن السيتوكين عامل نخر الورم المسبب للالتهابات (TNF-α) وعلامة سطح CCR7 مقارنة بالضامة M2 ، والتي أظهرت مستويات أعلى من CD209 و CCL13. وبالتالي ، تم تحديد CCR7 و CD209 كعلامات محددة وموثوقة لأنواع فرعية من البلاعم M1 و M2 عن طريق التلوين المناعي والتصور بواسطة CLSM. تم تحقيق مزيد من التأكيد من خلال ELISA للكشف عن ارتفاع مستوى TNF-ɑ في M1 وزيادة CCL13 في خلايا M2. يمكن استخدام العلامات المقترحة والإعداد التجريبي بشكل فعال لتقييم إمكانات التعديل المناعي للغرسات.

Introduction

أصبحت المواد الحيوية القابلة للزرع حلا تقليديا لمختلف الأمراض البشرية وتلعب دورا كبيرا في البحوث الطبية الحيوية ، بما في ذلك هندسة الأنسجة وأنظمة توصيل الأدوية والغرسات1،2. هناك مجموعة واسعة من الغرسات المصنوعة من مواد مختلفة ذات هياكل ووظائف مختلفة ، مثل الأطراف الاصطناعية للورك أو الدعامات أو الشبكات أو صمامات القلب أو زراعة الأسنان. عند الزرع ، يثير ملامسة زرع الأنسجة استجابة مناعية ، تليها الحل وإعادة تشكيل الأنسجة والتوازن. تتأثر هذه العمليات بالخصائص الفيزيائية والكيميائية والنشطة بيولوجيا للمواد الحيوية المستخدمة. قد تؤثر هذه الخصائص على شدة وطيف الاستجابات المؤيدة والمضادة للالتهابات ، وتكوين الكبسولة الليفية ، وتدهور الأنسجة ، ومرحلةالشفاء 3،4. من أجل دعم وتحسين عملية الشفاء وتكامل الزرع على المدى الطويل ، يتمثل أحد الجوانب الناشئة في البحث الحالي في التحقيق والتوسط في التفاعل بين أسطح الزرع والخلايا المناعية.

من بين الخلايا المناعية الأخرى ، تعد البلاعم ، الموجودة في جميع أنحاء الجسم ، لاعبا رئيسيا في الالتهاب والدفاع المضاد للأمراض ، وكذلك في عمليات الشفاء والحفاظ على توازن الأنسجة5،6. بناء على لدونتها ومحفزات الأنسجة البيئية الدقيقة المحلية ، فإن البلاعم قادرة على الاستقطاب إلى أنماط ظاهرية وظيفية متميزة ، والتي تظهر اختلافات كبيرة في التمثيل الغذائي للخلايا ، والوظائف الخلوية ، وملامح إفراز السيتوكين. يمكن تمييز النمط الظاهري M1 المنشط بشكل كلاسيكي من خلال إفراز السيتوكينات المسببة للالتهابات ، مثل IL-1β و IL-6 و TNF-α ، ويشارك في الاستجابة الالتهابية الأولية والمزمنة للصدمات والمواد الحيوية الغريبة. في المقابل ، بدلا من ذلك ، فإن الضامة M2 المنشطة ، والتي يتم تشغيلها بواسطة السيتوكينات مثل IL-4 و IL-13 ، لها سمات مميزة مثل حل الالتهاب وتعزيز التئام الأنسجة. يمكن التعرف على البلاعم المستقطبة M2 من خلال التعبير عن علامات سطح الخلية مثل CD206 وإنتاج السيتوكينات مثل IL-10 و IL-47. وبالمثل ، يمكن للبلاعم التي تم استقطابها بالفعل إعادة برمجة نفسها في بيئة مصغرة جديدة.

أظهرت العديد من الدراسات حول تفاعلات الخلايا والمواد الحيوية أهمية البلاعم في سلسلة الاستجابات المناعية تجاه المواد الحيوية القابلة للزرع وفي تنسيق العمليات المشاركة في التئام المضاعفات المرتبطة بالزرع8،9،10. على الرغم من أن الهندسة الطبية الحيوية قد أحرزت تقدما كبيرا في السنوات الأخيرة ، إلا أن هناك حاجة إلى مزيد من البحث لفهم كيفية تعديل الغرسات لسلوك البلاعم والاستقطاب11،12،13.

في زراعة الخلايا ، يمكن تمييز خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المشتقة من الخلايا الأحادية (PBMCs) إلى ضامة M0 ملتصقة متبوعة باستقطاب مستحث نحو الأنماط الظاهرية M1 أو M2 باستخدام LPS و IFN-γ أو IL-4 ، على التوالي. بعد الحضانة في المختبر مع عينات جديدة من المواد الحيوية ، من الممكن استخدام مستقبلات سطح الخلية المختلفة وملامح السيتوكين للبلاعم M1 و M2 للكشف عن إمكانات التعديل المناعي للمواد الحيوية في المختبر14،15. تهدف هذه الدراسة إلى تطوير بروتوكول في المختبر يمكن استخدامه للتحقيق في استقطاب MDMs استجابة لأسطح الزرع المختلفة. يمكن استخدام تحليلات التعبير الجيني وتقنيات الفحص المجهري و ELISA لتحديد علامات النمط الظاهري وملامح السيتوكين المحددة للبلاعم M1 و M2 التي تم تعديلها بواسطة المادة الحيوية. ومن ثم ، يمكن توضيح التفاعلات المعقدة بين البلاعم وأسطح المواد الحيوية ، ويمكن الحصول على معلومات قيمة لفهم تفاعلات البلاعم والمواد الحيوية بشكل أفضل. أخيرا ، يضمن البروتوكول الموحد في المختبر قابلية التكرار والموثوقية وقابلية المقارنة للنتائج التجريبية عن طريق تقليل التباين في الإعداد التجريبي.

Protocol

تم الحصول على الدم المحيطي البشري من المتبرعين بالدم الأصحاء وفقا للبروتوكول المعتمد من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة لكلية الطب في جامعة توبنغن (الموافقة الأخلاقية: 286/2021 BO). تم عزل PBMCs البشرية باستخدام الطرد المركزي المتدرج للكثافة ، كما هو موضحسابقا 16. تم تحديد البروتوكول التالي ل PBMCs المعزولة من 24 مل من الدم. يظهر تمثيل تخطيطي للبروتوكول في الشكل 1.

ملاحظة: يجب ضبط حجم الدم اعتمادا على عدد البلاعم M0 المستخدمة.

تم الحصول على ما مجموعه 35.46 ± 9.1 مليون PBMCs من 24 مل من الدم ، مما أدى إلى 1.97 ± 0.46 مليون M0 ضامة (ن = 5). يتم سرد جميع الكواشف والمواد الاستهلاكية والأجهزة في جدول المواد. المخازن المؤقتة مدرجة في الجدول 1.

1. تمايز خلايا الدم البشري الوحيدة إلى البلاعم

  1. أعد تعليق PBMCs المعزولة في 15 مل من وسط ربط الخلايا الأحادية الدافئ مسبقا ونقلها إلى قارورة واحدة لزراعة الخلايا T75.
  2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 90 دقيقة للسماح بالالتصاق.
  3. تخلص من المادة الطافية واغسل الخلايا مرة واحدة بوسط كامل دافئ مسبقا مع إمالة لطيفة لإزالة الخلايا غير الملتصقة أو غير الملتصقة بشكل فضفاض.
    ملاحظة: الخلايا المرفقة عبارة عن خلايا وحيدة تشكل حوالي 10٪ من إجمالي PBMCs المضافة في الأصل إلى القارورة.
  4. أضف 15 مل من الوسط الكامل الذي يحتوي على 10 نانوغرام / مل عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) إلى الخلايا الملتصقة واحتضانه لمدة 6 أيام لتعزيز التمايز.
  5. استبدل الوسط بوسط جديد كامل يحتوي على 10 نانوغرام / مل M-CSF كل يومين.

2. زراعة واستقطاب MDMs على سطح غرسة التيتانيوم

ملاحظة: في اليوم 6 من التمايز ، تم زرع البلاعم M0 على أسطح المواد الحيوية بمحفزات مختلفة لمدة 48 ساعة للحصول على البلاعم M1 أو M2 المستقطبة بالكامل. لكل سطح تم فحصه ، تم استخدام ثلاثة أقراص لزرع البلاعم M0 و M1 و M2. تم استخدام الأغطية البلاستيكية المعالجة بزراعة الخلايا كأسطح تحكم.

  1. قم بإزالة وسط الثقافة من قوارير T75 واغسل الخلايا ب 10 مل من PBS لمدة 5 دقائق.
  2. افصل الخلايا الملتصقة عن طريق احتضانها ب 10 مل من محلول انفصال الخلايا الدافئ مسبقا لمدة 30 دقيقة.
  3. اضغط على الخلايا برفق وانقلها إلى أنبوب سعة 50 مل. افصل الخلايا المتبقية عن طريق كشطها برفق في 10 مل من PBS.
  4. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب سعة 50 مل وقم بطردها بمعدل 300 × جم لمدة 10 دقائق.
  5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 5 مل من الوسط الكامل الدافئ مسبقا.
  6. عد الخلايا باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق ومقياس كثافة الدم لتحديد عدد الخلايا وقابليتها للحياة.
  7. قم بإعداد معلق الخلية عن طريق ضبط عدد الخلية إلى 160,000 خلية لكل 1 مل من الوسط الكامل.
  8. قم بتنظيف أقراص المواد الحيوية بالموجات فوق الصوتية في 70٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق ، متبوعا بالتعقيم في 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة.
  9. جفف أقراص التيتانيوم لمدة 1-2 ساعة ، ثم ضعها في أطباق غير معالجة من 24 بئرا وأضف 1 مل من تعليق الخلية المحضر إلى كل بئر.
  10. للحصول على البلاعم المستقطبة M1 ، أضف IFN-γ و LPS بتركيز 50 نانوغرام / مل و 10 نانوغرام / مل ، على التوالي. بالنسبة لاستقطاب M2 ، أضف IL-4 و IL-13 بتركيز 20 نانوغرام / مل لكل منهما. تأكد من نمو خلايا M0 بدون أي عوامل استقطاب. احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 للحث على الاستقطاب.

3. توصيف البلاعم المستقطبة باستخدام ELISA

ملاحظة: في اليوم الثاني من الاستقطاب ، تم إعداد عينات لتحليلات التوصيف. تم قياس سيتوكين TNF-ɑ و CCL13 chemokine لتوصيف الضامة المستقطبة M1 و M2 ، على التوالي. تم تطبيع تركيز البروتينات المفرزة إلى التركيز الكلي للبروتينات المفرزة في المادة الطافية المقابلة.

  1. اجمع المادة الطافية في أنبوب سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
  2. انقل الأقراص إلى لوحة جديدة سعة 24 بئرا لمزيد من التجارب. والغرض من ذلك هو القضاء على الخلايا الميتة أو المرتبطة بشكل فضفاض في ألواح 24 بئرا غير معالجة.
    ملاحظة: يجب التحقق من صلاحية الخلية على الأسطح قبل إجراء أي تحليل. يمكن تحديد صلاحية الخلايا عن طريق فحوصات بقاء الخلايا الحية / الميتة أو بشكل غير مباشر من خلال اختبارات تكاثر الخلايا والسمية الخلوية.
  3. قم بقياس السيتوكينات والكيموكينات وفقا للتعليمات المحددة التي تقدمها الشركة المصنعة. قم بقياس السيتوكينات إما على الفور أو قم بتخزين العينات عند -80 درجة مئوية للقياس المستقبلي.
    ملاحظة: لكل نوع من أنواع المجموعات (مع الأخذ في الاعتبار حدود الحساسية والكشف لمجموعة ELISA) ، يجب تحديد تخفيف العينة المناسب. بالنسبة لمقايسة حمض البيسنكونينيك (BCA) ، تم تخفيف العينات بنسبة 1: 5. تم تخفيف عينات M1 ل TNF-ɑ بنسبة 1:10 ، وتم تخفيف عينات M2 ل CCL13 بنسبة 1:12.
  4. احسب تركيز السيتوكينات / الكيموكينات المفرزة باستخدام المنحنى القياسي باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  5. قم بقياس كمية البروتين الإجمالية باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA.
  6. تطبيع تركيز البروتينات المفرزة إلى ملغ من البروتين الكلي.

4. توصيف البلاعم المستقطبة باستخدام CLSM

ملاحظة: تميزت البلاعم المستقطبة أيضا بتلطيخها بالأجسام المضادة لعلامات سطح الخلية CD209 و CCR7. تم تلبوخ النوى باستخدام DRAQ5. يمكن استخدام CD68 أو علامات أخرى كعلامات عموم البلاعم.

  1. اغسل الخلايا 2x في 800 ميكرولتر من PBS. احتضان الأقراص لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت.
  2. بعد إزالة المخزن المؤقت للتثبيت ، اغسل ثلاث مرات في 400 ميكرولتر من PBS. قم بتلطيخ العينات على الفور أو قم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية في 1 مل من المخزن المؤقت للتخزين.
    ملاحظة: باستخدام بروتوكول التثبيت والتخزين هذا ، تم تلطيخ العينات بنجاح وتصويرها في غضون 1-6 أسابيع من التثبيت.
  3. قبل الخطوة التالية ، اغسل الأقراص مرتين باستخدام 800 ميكرولتر من PBS بعد التخزين.
  4. احتضان الأقراص مع 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لمدة 30 دقيقة في RT لمنع مواقع الربط غير المحددة.
  5. تخلص من المخزن المؤقت للحجب واحتضان الأقراص في RT لمدة 1 ساعة مع الأجسام المضادة الأولية المخففة في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ.
    1. قم بإجراء التألق المناعي باستخدام تلطيخ مزدوج لفحص التعبير عن CCR7 و CD209 في عينة واحدة. لهذا الغرض ، اجمع بين الأجسام المضادة الأولية التي يتم جمعها من أنواع مختلفة (الفأر والأرانب) في نفس خطوة التلوين.
      ملاحظة: لتحقيق إشارة قوية بأقل قدر من الخلفية ، قم بتحسين تركيز الجسم المضاد. تم استخدام الجسم المضاد CCR7 بتركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام / مل ، وتم تخفيف الجسم المضاد CD209 1/400.
  6. قم بإزالة الأجسام المضادة الأولية وغسل 3 مرات باستخدام 400 ميكرولتر من محلول الغسيل.
  7. أضف الأجسام المضادة الثانوية المسماة بالفلوروفور المخففة في مخزن التلوين واحتضانها لمدة ساعة واحدة في RT في الظلام.
    ملاحظة: يجب تحسين تركيز الأجسام المضادة الثانوية للحصول على أقصى قدر من الإشارات المحددة بأقل قدر من الخلفية. في هذه الدراسة ، تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية بتركيز 5 ميكروغرام / مل للتلطيخ.
  8. بعد إزالة المادة الطافية ، اغسل العينات ثلاث مرات في مخزن الغسيل لمدة 3 دقائق لكل منها.
  9. أضف 10 ميكرومتر DRAQ5 في PBS واحتضن لمدة 15 دقيقة في RT ، محميا من الضوء.
  10. قم بإزالة المادة الطافية واغسل الأقراص مرة واحدة في PBS.
  11. قم بإزالة PBS المتبقي وأضف 1 قطرة من وسط التثبيت.
  12. بعد 5 دقائق ، ضع أكواب الغطاء واترك العينات تجف لمدة 1 ساعة.
  13. بعد تجفيف العينات ، أغلق الحواف بطلاء أظافر شفاف وقم بتخزينها على حرارة 4 درجات مئوية في الظلام حتى التصوير.
  14. للحصول على نظرة عامة على الخلايا ، قم بتصوير العينات بتكبير 25x. لتحديد هيكل وتحديد مواقع علامات السطح بشكل أكبر ، احصل على صور بتكبير 63x.
  15. حدد كثافة التألق ل CCR7 و CD209 باستخدام برنامج ImageJ.
    ملاحظة: تم إجراء الحصول على الصور باستخدام المضاعف الضوئي (PMT) باستخدام نظام CLSM ، والذي تم تجهيزه بليزر الأرجون (488 نانومتر) ، وليزر DPSS (561 نانومتر) ، وليزر HeNe (633 نانومتر).

5. توصيف البلاعم المستقطبة باستخدام qRT-PCR

ملاحظة: لعزل الحمض النووي الريبي ، تم استخدام قرصين لكل عينة من أجل الحصول على ما يكفي من الحمض النووي الريبي لتخليق (كدنا).

  1. اغسل الأقراص 2x مع 800 ميكرولتر من PBS.
  2. أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى القرص الأول وقم بتحلل الخلايا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
  3. انقل المحللة إلى القرص الثاني وكرر عملية التحلل.
  4. أضف 350 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول إلى المحللة والماصة لأعلى ولأسفل حتى تتجانس.
  5. انقل المحللة إلى عمود الدوران واتبع تعليمات الشركة المصنعة لعزل الحمض النووي الريبي.
  6. حدد كمية الحمض النووي الريبي باستخدام nanodrop أو جهاز آخر.
  7. تطبيع تركيزات الحمض النووي الريبي لعينات مختلفة وتصنيع (كدنا) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام نظام RT-PCR لتخليق الحبلا الأول.
  8. قم بتصنيع (كدنا) باستخدام 350 نانوغرام من الحمض النووي الريبي باتباع بروتوكول الشركة المصنعة وتخزينه عند -20 درجة مئوية حتى يتم إجراء تحليل qRT-PCR.
    ملاحظة: هنا ، تم استخدام 350 نانوغرام من الحمض النووي الريبي المنقى لتصنيع (كدنا) باستخدام 4 ميكرولتر من RT Mix (5x) في 20 ميكرولتر.
  9. قم بإجراء qRT-PCR على نظام PCR في الوقت الفعلي في ألواح 96 بئرا وتفاعلات فردية 15 ميكرولتر (1x مزيج رئيسي أخضر Syber ، و 0.2 ميكرومتر من البادئات الأمامية والخلفية ، و 4.5 ميكرولتر من 1:10 cDNA المخفف).
    ملاحظة: يبدأ برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل بغطاء ساخن (105 درجة مئوية) متبوعا بثلاث خطوات: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، متبوعا ب 15 ثانية عند 95 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 55 درجة مئوية لمدة 40 دورة.
  10. تطبيع مستويات التعبير عن الجينات المختلفة لجين التدبير المنزلي GAPDH (أو جينات التدبير المنزلي الأخرى مثل β-actin).
  11. احسب التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة 2−ΔΔCt عن طريق أخذ M0 الخلايا المزروعة على أغطية زراعة الأنسجة كمرجع. يسرد الجدول 2 جميع البادئات المستخدمة في هذه الدراسة.

6. التحليل الإحصائي

  1. اعرض جميع البيانات كمتوسط ± SEM. كرر جميع المقايسات (في هذه الدراسة ، تكررت المقايسات خمس مرات) لضمان قابلية التكرار. قم بتقييم الفروق ذات الدلالة الإحصائية بين البيانات الموزعة بشكل طبيعي باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعا باختبار Tukey المتعدد.
  2. استخدم اختبار فريدمان واختبار المقارنة المتعددة ل Dunn لتحليل مجموعات البيانات غير المعلمية. استخدم برنامج تحليل البيانات المناسب لتحليل البيانات وتحديد الدلالة الإحصائية على أنها قيمة p أقل من 0.05.

النتائج

تظهر نتائج هذه الدراسة تمايزا واستقطابا ناجحا ل MDMs على أسطح التيتانيوم ، متبوعا بتوصيف البلاعم المستقطبة M1 أو M2. في الخطوة الأولى ، قمنا بتمييز MDMs المستقطبة باستخدام CLSM. بناء على دراساتنا الأولية ، تم استخدام CD209 و CCR7 كعلامات محددة للتمييز بين M1 و M2 MDMs المستقطبة. كما هو مو?...

Discussion

يعد الفهم الشامل لسلوك البلاعم أمرا ضروريا لفهم الخصائص المناعية للمواد القابلة للزرع. أبلغت العديد من الدراسات عن علامات غير متجانسة ، ومجموعة متنوعة من نماذج الخلايا ، وبروتوكولات لتوصيف استقطاب البلاعم في المختبر17،18،

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم توفير الأقراص من قبل Medentis Medical ، Bad-Neuenahr-Ahrweiler ، ألمانيا. يقر المؤلفون بالدعم المقدم من قسم جراحة الفم والوجه والفكين (مستشفى جامعة توبينغن).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well plate, not-treatedCorning Incorporated (Kennebunk, USA) 144530
Absorbance reader Infinite F50 TECAN Austria GmbH (Grödig, Austria)TCAT91000001
Accutase in DPBS, 0.5 mM EDTAEMD Millipore Corp. (Burlington, USA)SCR005
Anti-Fade Fluorescence Mounting Medium -Aqueous, Fluoroshieldabcam (Cambridge, UK)ab104135
Bio-Rad MJ Research PTC-200 Peltier Thermal CyclerBio-Rad / MJ Research7212
Bovine serum albumin (BSA)VWR International bvba (Leuven, Belgium)422361V
Centrifuge 5804 REppendorf SE (Hamburg, Germany)5804 R
DC-SIGN (D7F5C) XP Rabbit mAbCell Signaling Technology13193
Dimethyl sulfoxideSigma Aldrich Co. (St.Louis, MO, USA)D2438-5X10ML
DRAQ5 Staining SolutionMilteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)130-117-344
Ethanol ≥99.8% for molecularbiologyCarl Roth GmbH + CO. KG (Karlsruhe, Germany)1HPH.1
Goat Anti-Mouse IgG (H&L) Highly Cross-Adsorbed
Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488		InvitrogenA32723TR
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Cyanine3InvitrogenA10520
GraphPad PrismGraphPadVersion  9.4.1
Human CCR7 AntibodyR&D SystemsMAB197
Human IFN-gamma RecombinantInvitrogen (Rockford, USA)RIFNG100
Human IL-13Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)5230901032
Human IL-4Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)130-095-373
Human M-CSFPeprotech (Cranbury, USA)300-25
Leica TCS SP5Leica Microsystems CMS GmbH (Mannheim, Germany)https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp5/
Lipopolysaccharides from EscherichiaSigma Aldrich Co. (Missouri, USA)L4391-1MG
Luna Universal qPCR Master Mix New England BiolabsNEB #M3003
LunaScript RT SuperMix KitNew England BiolabsE3010L
Lymphocyte Separation Medium 1077PromoCell (Heidelberg, Germany)C-44010
MCP-4/CCL13 Human ELISA KitInvitrogenEHCCL13
MicroAmp Fast 96-Well Reaction Plate (0.1 mL)Applied Biosystems (Waltham, USA)4346907
MicroAmp Optical Adhesive FilmLife Technologies Corporation (Carlsbad, USA)4311971
MicroAmp Splash Free 96-Well BaseApplied Biosystems (Waltham, USA)4312063
Microlitercentrifuge CD-3124RPhoenix Instrument (Germany)9013111121
Microscope Cover Glasses, 10 mmCarl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany4HX4.1
Monocyte Attachment MediumPromoCell (Heidelberg, Germany)C-28051
Multiply-Pro Gefäß 0.5 mL, PPSarstedt AG & CO (Nümbrecht, Germany)7,27,35,100
Nanodrop OneThermo Scientific (USA)ND-ONE-W
QuantStudio 3 SystemLife Technologies GmbH (St. Leon-Rot, Germany)A28567
RNeasy Micro KitQiagen74007
RPMI 1640, 1x, with L-glutamineMediatech, Inc. (Manassas, USA)10-040-CV
Sterile bench, LaminarAir HB 2472 Heraeus instruments (Hanau, Germany)51012197
Tissue Culture Coverslips 13 mm (Plastic)Sarstedt Inc. (Newton, USA)83,18,40,002
Titanium machinied discs 12 cm Medentis Medical (Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Germany)N/A
TNF alpha Human ELISA KitInvitrogenKHC3011
Trypan blue solution 0.4%Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany)1680.1

References

  1. Othman, Z., Pastor, B. C., van Rijt, S., Habibovic, P. Understanding interactions between biomaterials and biological systems using proteomics. Biomaterials. 167, 191-204 (2018).
  2. Ikada, Y. Challenges in tissue engineering. J R Soc Interface. 3 (10), 589-601 (2006).
  3. Aamodt, J. M., Grainger, D. W. Extracellular matrix-based biomaterial scaffolds and the host response. Biomaterials. 86, 68-82 (2016).
  4. Batool, F., et al. Modulation of immune-inflammatory responses through surface modifications of biomaterials to promote bone healing and regeneration. J Tissue Eng. 12, 20417314211041428 (2021).
  5. Mantovani, A., Biswas, S. K., Galdiero, M. R., Sica, A., Locati, M. Macrophage plasticity and polarization in tissue repair and remodelling. J Pathol. 229 (2), 176-185 (2013).
  6. Shrivastava, R., Shukla, N. Attributes of alternatively activated (M2) macrophages. Life Sci. 224, 222-231 (2019).
  7. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol. 5 (12), 953-964 (2005).
  8. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
  9. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  10. Kzhyshkowska, J., et al. Macrophage responses to implants: prospects for personalized medicine. J Leukoc Biol. 98 (6), 953-962 (2015).
  11. Browne, S., Pandit, A. Biomaterial-mediated modification of the local inflammatory environment. Front Bioeng Biotechnol. 3, 67 (2015).
  12. Piatnitskaia, S., et al. Modelling of macrophage responses to biomaterials in vitro: state-of-the-art and the need for the improvement. Front Immunol. 15, 1349461 (2024).
  13. Rayahin, J. E., Gemeinhart, R. A. Activation of macrophages in response to biomaterials. Results Probl Cell Differ. 62, 317-351 (2017).
  14. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  15. Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biol. 15 (1), 53 (2017).
  16. Salma Iqbal, A. K. Characterization of in vitro generated human polarized macrophages. J Clin Cell Immunol. 6, 1-8 (2015).
  17. Hotchkiss, K. M., et al. Titanium surface characteristics, including topography and wettability, alter macrophage activation. Acta Biomater. 31, 425-434 (2016).
  18. Wang, Y., Zhang, Y., Sculean, A., Bosshardt, D. D., Miron, R. J. Macrophage behavior and interplay with gingival fibroblasts cultured on six commercially available titanium, zirconium, and titanium-zirconium dental implants. Clin Oral Investig. 23 (8), 3219-3227 (2019).
  19. Abaricia, J. O., Shah, A. H., Ruzga, M. N., Olivares-Navarrete, R. Surface characteristics on commercial dental implants differentially activate macrophages in vitro and in vivo. Clin Oral Implants Res. 32 (4), 487-497 (2021).
  20. Lu, W., et al. Improved osseointegration of strontium-modified titanium implants by regulating angiogenesis and macrophage polarization. Biomater Sci. 10 (9), 2198-2214 (2022).
  21. Murray, P. J., Wynn, T. A. Obstacles and opportunities for understanding macrophage polarization. J Leukoc Biol. 89 (4), 557-563 (2011).
  22. Nascimento, C. R., Fernandes, N. A. R., Maldonado, L. A. G., Junior, C. R. Comparison of monocytic cell lines U937 and THP-1 as macrophage models for in vitro studies. Biochem Biophys Rep. 32, 101383 (2022).
  23. Freytes, D. O., Kang, J. W., Marcos-Campos, I., Vunjak-Novakovic, G. Macrophages modulate the viability and growth of human mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 114 (1), 220-229 (2013).
  24. Zhang, Y., et al. Macrophage type modulates osteogenic differentiation of adipose tissue MSCs. Cell Tissue Res. 369 (2), 273-286 (2017).
  25. Cerqueira, A., et al. Evaluation of the inflammatory responses to sol-gel coatings with distinct biocompatibility levels. J Biomed Mater Res A. 109 (9), 1539-1548 (2021).
  26. Zhang, Y., Cheng, X., Jansen, J. A., Yang, F., van den Beucken, J. J. Titanium surfaces characteristics modulate macrophage polarization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 95, 143-151 (2019).
  27. Nobs, S. P., Kopf, M. Tissue-resident macrophages: guardians of organ homeostasis. Trends Immunol. 42 (6), 495-507 (2021).
  28. Sreejit, G., Fleetwood, A., Murphy, A., Nagareddy, P. Origins and diversity of macrophages in health and disease. Clin Transl Immunology. 9 (12), e1222 (2020).
  29. Parisi, L., et al. Preparation of human primary macrophages to study the polarization from monocyte-derived macrophages to pro-or anti-inflammatory macrophages at biomaterial interface in vitro. J Dent Sci. 18 (4), 1630-1637 (2023).
  30. Feuerer, N., et al. Macrophage retrieval from 3D biomaterials: A detailed comparison of common dissociation methods. J Immunol Regen Med. 11, 100035 (2021).
  31. Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. J Cell Physiol. 233 (9), 6425-6440 (2018).
  32. Sridharan, R., Cameron, A. R., Kelly, D. J., Kearney, C. J., O'Brien, F. J. Biomaterial based modulation of macrophage polarization: a review and suggested design principles. Mater Today. 18 (6), 313-325 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

M1 M2 ELISA CLSM qRT PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved