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Neste Artigo

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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para avaliar o potencial imunomodulador das superfícies de implantes in vitro, visando melhorar a confiabilidade e reprodutibilidade dos protocolos atuais e promover novas pesquisas. Perfis de citocinas secretoras, expressão de mRNA e marcadores de superfície celular foram monitorados usando macrófagos derivados de monócitos sanguíneos para investigar a polarização de macrófagos cultivados em titânio.

Resumo

A reação de corpo estranho (FBR), um processo de cicatrização complexo mediado imunologicamente, desempenha um papel crucial na integração de implantes no corpo. Os macrófagos, como a primeira linha de interação do sistema imunológico com as superfícies dos implantes, desempenham um papel bidirecional na modulação do equilíbrio inflamação-regeneração. Para uma compreensão profunda e a avaliação das reações entre os materiais do implante e as respostas imunes, métodos e protocolos in vitro confiáveis são fundamentais. Dentre os diferentes modelos in vitro , os macrófagos primários derivados de monócitos (MDMs) apresentam um excelente modelo para investigar as interações macrófagos-implantes. Implementamos um protocolo experimental para avaliar a polarização de MDMs em macrófagos M1 (classicamente ativados) e M2 (ativados alternativamente) em superfícies de implantes. Isolamos monócitos sanguíneos de doadores saudáveis e os diferenciamos em macrófagos usando o fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). Macrófagos diferenciados foram cultivados em superfícies de implantes e polarizados em subtipos M1 e M2. A polarização M1 foi alcançada na presença de interferon (IFN)-γ e lipopolissacarídeo (LPS), enquanto a polarização M2 foi realizada em meio contendo interleucina (IL)-4 e IL-13. Avaliamos os fenótipos de macrófagos por ensaio imunoenzimático (ELISA), microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) e PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) com base em painéis de citocinas secretadas, marcadores de superfície celular e genes expressos. O RNA extraído foi transformado em DNA complementar (cDNA), e qRT-PCR foi usado para quantificar o mRNA relacionado aos macrófagos M1 e M2. Assim, os macrófagos M1 foram caracterizados por maior expressão da citocina pró-inflamatória do fator de necrose tumoral (TNF-α) e do marcador de superfície CCR7 em comparação com os macrófagos M2, que exibiram níveis mais altos de CD209 e CCL13. Consequentemente, CCR7 e CD209 foram identificados como marcadores específicos e confiáveis dos subtipos de macrófagos M1 e M2 por imunocoloração e visualização por CLSM. Confirmação adicional foi alcançada por ELISA detectando nível elevado de TNF-ɑ em M1 e aumento de CCL13 em células M2. Os marcadores propostos e a configuração experimental podem ser usados efetivamente para avaliar o potencial imunomodulador dos implantes.

Introdução

Os biomateriais implantáveis tornaram-se uma solução convencional para várias doenças humanas e desempenham um grande papel na pesquisa biomédica, incluindo engenharia de tecidos, sistemas de administração de medicamentos e implantes 1,2. Existe uma vasta gama de implantes feitos de vários materiais com diferentes estruturas e funcionalidades, como próteses de anca, stents, malhas, válvulas cardíacas ou implantes dentários. Após o implante, o contato tecido-implante provoca uma resposta imune, seguida de resolução, remodelação tecidual e homeostase. Esses processos são influenciados pelas características físicas, químicas e bioativas dos biomateriais utilizados. Essas características podem afetar a intensidade e o espectro das respostas pró e anti-inflamatórias, a formação de cápsulas fibróticas, a degradação tecidual e a fase de cicatrização 3,4. A fim de apoiar e otimizar o processo de cicatrização e a integração de implantes a longo prazo, um aspecto emergente da pesquisa atual é investigar e mediar a interação entre as superfícies dos implantes e as células imunológicas.

Entre outras células imunológicas, os macrófagos, encontrados em todo o corpo, são atores-chave na inflamação e na defesa antipatogênica, bem como nos processos de cicatrização e manutenção da homeostase tecidual 5,6. Com base em sua plasticidade e nos estímulos microambientais teciduais locais, os macrófagos são capazes de se polarizar em fenótipos funcionais distintos, que exibem grandes diferenças no metabolismo celular, funções celulares e perfis de secreção de citocinas. O fenótipo M1 classicamente ativado pode ser distinguido pela secreção de citocinas pró-inflamatórias, como IL-1β, IL-6 e TNF-α, e está envolvido na resposta inflamatória inicial e crônica a traumas e biomateriais estranhos. Em contraste, alternativamente, os macrófagos M2 ativados, que são desencadeados por citocinas como IL-4 e IL-13, têm características como a resolução da inflamação e a promoção da cicatrização tecidual. Macrófagos polarizados em M2 podem ser identificados pela expressão de marcadores de superfície celular como CD206 e pela produção de citocinas como IL-10 e IL-47. Da mesma forma, macrófagos que já foram polarizados podem se reprogramar em um novo microambiente.

Muitos estudos sobre interações célula-biomaterial têm mostrado a importância dos macrófagos na cascata de respostas imunológicas em relação aos biomateriais implantáveis e na orquestração de processos envolvidos na cicatrização de complicações relacionadas ao implante 8,9,10. Embora a engenharia biomédica tenha feito progressos significativos nos últimos anos, mais pesquisas são necessárias para entender como os implantes modulam o comportamento e a polarização dos macrófagos 11,12,13.

Em cultura de células, as células mononucleares do sangue periférico derivadas de monócitos (PBMCs) podem ser diferenciadas em macrófagos M0 aderentes seguidos de polarização induzida em direção aos fenótipos M1 ou M2 usando LPS e IFN-γ ou IL-4, respectivamente. Após incubação in vitro com novos espécimes de biomateriais, é possível utilizar os diferentes receptores de superfície celular e perfis de citocinas de macrófagos M1 e M2 para detectar o potencial imunomodulador de biomateriais in vitro14,15. Este estudo teve como objetivo desenvolver um protocolo in vitro que possa ser empregado para investigar a polarização de MDMs em resposta a diferentes superfícies de implantes. Análises de expressão gênica, técnicas de microscopia e ELISA podem ser usadas para determinar os marcadores fenotípicos e perfis específicos de citocinas de macrófagos M1 e M2 modulados pelo biomaterial. Assim, as complexas interações entre macrófagos e superfícies de biomateriais podem ser elucidadas e informações valiosas podem ser obtidas para entender melhor as interações macrófagos-biomateriais. Finalmente, um protocolo in vitro padronizado garante a reprodutibilidade, confiabilidade e comparabilidade dos resultados experimentais, minimizando a variabilidade na configuração experimental.

Protocolo

O sangue periférico humano foi obtido de doadores de sangue saudáveis de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê de Ética da faculdade de medicina da Universidade de Tübingen (aprovação ética: 286/2021 BO). PBMCs humanas foram isoladas usando Centrifugação de Gradiente de Densidade, conforme descrito anteriormente16. O protocolo a seguir é descrito para PBMCs isolados de 24 mL de sangue. Uma representação esquemática do protocolo é mostrada na Figura 1.

NOTA: O volume sanguíneo deve ser ajustado dependendo do número de macrófagos M0 usados.

Um total de 35,46 ± 9,1 milhões de PBMCs foram obtidos a partir de 24 mL de sangue, resultando em 1,97 ± 0,46 milhão de macrófagos M0 (n = 5). Todos os reagentes, consumíveis e dispositivos estão listados na Tabela de Materiais. Os buffers estão listados na Tabela 1.

1. Diferenciação de monócitos do sangue humano em macrófagos

  1. Ressuspender os PBMCs isolados em 15 ml de meio de fixação de monócitos pré-aquecido e transferi-los para um balão de cultura de células T75.
  2. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2 durante 90 min para permitir a adesão.
  3. Descarte o sobrenadante e lave as células uma vez com meio completo pré-aquecido com inclinação suave para remover as células não aderentes ou frouxamente aderidas.
    NOTA: As células anexadas são monócitos, que representam cerca de 10% do total de PBMCs originalmente adicionados ao frasco.
  4. Adicione 15 mL de meio completo contendo 10 ng/mL de fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) às células aderentes e incube por 6 dias para promover a diferenciação.
  5. Troque o meio por meio fresco e completo contendo 10 ng/mL M-CSF a cada 2 dias.

2. Cultivo e polarização de MDMs na superfície do implante de titânio

NOTA: No dia 6 de diferenciação, macrófagos M0 foram semeados nas superfícies do biomaterial com diferentes estímulos por 48 h para obter macrófagos M1 ou M2 totalmente polarizados. Para cada superfície examinada, três discos foram usados para semear macrófagos M0, M1 e M2. Lamínulas plásticas tratadas com cultura celular foram usadas como superfícies de controle.

  1. Retirar o meio de cultura dos frascos T75 e lavar as células com 10 ml de PBS durante 5 min.
  2. Separe as células aderentes incubando-as com 10 mL de solução de descolamento celular pré-aquecida por 30 min.
  3. Bata suavemente nas células e transfira-as para um tubo de 50 mL. Separe as células restantes raspando-as suavemente em 10 mL de PBS.
  4. Transfira as células destacadas para o tubo de 50 ml e centrifugue-as a 300 x g durante 10 min.
  5. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de meio completo pré-aquecido.
  6. Conte as células usando a coloração com azul de tripano e um hemocitômetro para determinar o número e a viabilidade das células.
  7. Prepare a suspensão celular ajustando o número de células para 160.000 células por 1 mL de meio completo.
  8. Limpe os discos de biomaterial por ultrassom em etanol a 70% por 5 min, seguido de esterilização em etanol a 70% por 30 min.
  9. Seque os discos de titânio por 1-2 h, coloque-os em placas de 24 poços não tratadas e adicione 1 mL de suspensão celular preparada a cada poço.
  10. Para obter macrófagos polarizados M1, adicione IFN-γ e LPS na concentração de 50 ng/mL e 10 ng/mL, respectivamente. Para polarização M2, adicione IL-4 e IL-13 em uma concentração de 20 ng/mL cada. Certifique-se de que as células M0 sejam cultivadas sem nenhum agente de polarização. Incubar as células por mais 48 h a 37 °C e 5% de CO2 para induzir a polarização.

3. Caracterização de macrófagos polarizados usando ELISA

NOTA: No dia 2 de polarização, as amostras foram preparadas para análises de caracterização. A citocina TNF-ɑ e a quimiocina CCL13 foram medidas para caracterizar macrófagos polarizados M1 e M2, respectivamente. A concentração de proteínas secretadas foi normalizada para a concentração total de proteínas secretadas no sobrenadante correspondente.

  1. Colete o sobrenadante em um tubo de 1,5 mL e centrifugue a 300 x g por 5 min. Transferir o sobrenadante para um novo tubo.
  2. Transfira os discos para uma nova placa de 24 poços para novos experimentos. O objetivo é eliminar células mortas ou frouxamente aderidas em placas de 24 poços não tratadas.
    NOTA: A viabilidade celular deve ser verificada sobre as superfícies antes de qualquer análise ser realizada. A viabilidade das células pode ser determinada por ensaios de viabilidade de células vivas/mortas ou indiretamente por meio de testes de proliferação celular e citotoxicidade.
  3. Meça as citocinas e quimiocinas de acordo com as instruções específicas fornecidas pelo fabricante. Meça as citocinas imediatamente ou armazene as amostras a -80 °C para medições futuras.
    NOTA: Para cada tipo de kit (considerando a sensibilidade e os limites de detecção do kit ELISA), a diluição apropriada da amostra deve ser determinada. Para o ensaio de ácido bicinconínico (BCA), as amostras foram diluídas 1:5. As amostras M1 para TNF-ɑ foram diluídas 1:10 e as amostras M2 para CCL13 foram diluídas 1:12.
  4. Calcule a concentração de citocinas/quimiocinas secretadas usando a curva padrão seguindo as instruções do fabricante.
  5. Meça a quantidade total de proteína usando o kit de ensaio de proteína BCA.
  6. Normalize a concentração de proteínas secretadas em mg de proteína total.

4. Caracterização de macrófagos polarizados usando CLSM

NOTA: Os macrófagos polarizados foram ainda caracterizados colorindo-os com anticorpos para marcadores de superfície celular CD209 e CCR7. Os núcleos foram contracorados com DRAQ5. CD68 ou outros marcadores podem ser usados como marcadores de pan-macrófagos.

  1. Lave as células 2x em 800 μL de PBS. Incubar os discos durante 20 min à temperatura ambiente (RT) em 400 μL de tampão de fixação.
  2. Após remover o tampão de fixação, lave três vezes em 400 μL de PBS. Manchar as amostras imediatamente ou armazená-las a 4 °C em 1 ml de tampão de armazenamento.
    NOTA: Com este protocolo de fixação e armazenamento, as amostras foram coradas e fotografadas com sucesso dentro de 1-6 semanas após a fixação.
  3. Antes da próxima etapa, lave os discos duas vezes com 800 μL de PBS após o armazenamento.
  4. Incube discos com 400 μL de tampão de bloqueio por 30 min em RT para bloquear os locais de ligação inespecíficos.
  5. Rejeitar o tampão de bloqueio e incubar os discos em RT durante 1 h com anticorpos primários diluídos em 400 μl de tampão de coloração.
    1. Realize um procedimento de imunofluorescência usando coloração dupla para examinar a expressão de CCR7 e CD209 em uma amostra. Para isso, combine anticorpos primários criados de diferentes espécies (camundongo e coelho) na mesma etapa de coloração.
      NOTA: Para obter um sinal forte com fundo mínimo, otimize a concentração de anticorpos. O anticorpo CCR7 foi usado na concentração final de 10 μg/mL, e o anticorpo CD209 foi diluído em 1/400.
  6. Remova os anticorpos primários e lave 3x com 400 μL de tampão de lavagem.
  7. Adicione anticorpos secundários marcados com fluoróforo diluídos em tampão de coloração e incube por 1 h em RT no escuro.
    NOTA: A concentração de anticorpos secundários deve ser otimizada para obter o máximo de sinais específicos com o mínimo de fundo. Neste estudo, anticorpos secundários foram usados na concentração de 5 μg/mL para coloração.
  8. Após remover o sobrenadante, lave as amostras três vezes no tampão de lavagem por 3 min cada.
  9. Adicionar 10 μM de DRAQ5 em PBS e incubar durante 15 min a RT, protegido da luz.
  10. Remova o sobrenadante e lave os discos uma vez em PBS.
  11. Remova o PBS restante e adicione 1 gota de meio de montagem.
  12. Após 5 min, aplique as lamínulas e deixe as amostras secarem por 1 h.
  13. Depois de secar as amostras, sele as bordas com esmalte transparente e guarde-as a 4 °C no escuro até a obtenção de imagens.
  14. Para obter uma visão geral das células, obtenha imagens das amostras com ampliação de 25x. Para determinar ainda mais a estrutura e a localização dos marcadores de superfície, adquira imagens com ampliação de 63x.
  15. Quantifique a intensidade de fluorescência de CCR7 e CD209 usando o software ImageJ.
    NOTA: A aquisição das imagens foi realizada com um fotomultiplicador (PMT) usando um sistema CLSM, que foi equipado com um laser de argônio (488 nm), laser DPSS (561 nm) e laser HeNe (633 nm).

5. Caracterização de macrófagos polarizados usando qRT-PCR

NOTA: Para isolamento de RNA, dois discos por amostra foram usados para obter RNA suficiente para a síntese de cDNA.

  1. Lave os discos 2x com 800 μL de PBS.
  2. Adicione 350 μL de tampão de lise ao primeiro disco e lise as células pipetando para cima e para baixo.
  3. Transferir o lisado para o segundo disco e repetir o processo de lisagem.
  4. Adicione 350 μL de etanol a 70% ao lisado e pipete para cima e para baixo até ficar homogêneo.
  5. Transfira o lisado para a coluna de rotação e siga as instruções do fabricante para isolamento de RNA.
  6. Quantifique a quantidade de RNA usando uma nanogota ou outro dispositivo.
  7. Normalize as concentrações de RNA para diferentes amostras e sintetize o cDNA de acordo com as instruções do fabricante usando o sistema RT-PCR para síntese de cDNA de primeira fita.
  8. Sintetize o cDNA usando 350 ng de RNA seguindo o protocolo do fabricante e armazene-o a -20 °C até que a análise qRT-PCR seja realizada.
    NOTA: Aqui, 350 ng de RNA purificado foram usados para sintetizar cDNA usando 4 μL de RT Mix (5x) em 20 μL.
  9. Realize qRT-PCR em um sistema de PCR em tempo real em placas de 96 poços e reações individuais de 15 μL (1x master mix Syber green, 0,2 μM de primers diretos e reversos e 4,5 μL de cDNA diluído 1:10).
    NOTA: O programa de PCR começa com uma tampa aquecida (105 ° C) seguida por três etapas: desnaturação inicial a 95 ° C por 3 min, seguida por 15 s a 95 ° C e 30 s a 55 ° C por 40 ciclos.
  10. Normalize os níveis de expressão de vários genes para o gene de manutenção GAPDH (ou outros genes de manutenção como β-actina).
  11. Calcular a expressão gênica relativa usando o método 2−ΔΔCt , tomando como referência as células M0 cultivadas em lamínulas de cultura de tecidos. A Tabela 2 lista todos os primers utilizados neste estudo.

6. Análise estatística

  1. Apresente todos os dados como a média ± SEM. Repita todos os ensaios (neste estudo, os ensaios foram repetidos cinco vezes) para garantir a reprodutibilidade. Avalie as diferenças estatisticamente significativas entre os dados normalmente distribuídos usando uma análise de variância (ANOVA) unidirecional seguida pelo teste múltiplo de Tukey.
  2. Use o teste de Friedman e o teste de comparação múltipla de Dunn para analisar conjuntos de dados não paramétricos. Use o software de análise de dados apropriado para analisar os dados e definir a significância estatística como um valor de p inferior a 0,05.

Resultados

Os resultados deste estudo demonstram diferenciação e polarização bem-sucedidas de MDMs em superfícies de titânio, seguidas pela caracterização de macrófagos polarizados M1 ou M2. Na primeira etapa, caracterizamos MDMs polarizados usando CLSM. Com base em nossos estudos preliminares, CD209 e CCR7 foram usados como marcadores específicos para diferenciar MDMs polarizados M1 de M2. Conforme mostrado na Figura 2A, B, os MDMs polarizar...

Discussão

Uma compreensão completa do comportamento dos macrófagos é essencial para compreender as propriedades imunomoduladoras dos materiais implantáveis. Vários estudos relataram marcadores heterogêneos, uma variedade de modelos celulares e protocolos para caracterizar a polarização de macrófagos in vitro 17,18,19,20. Para melhorar a reprodutibilidad...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os discos foram gentilmente cedidos pela Medentis Medical, Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Alemanha. Os autores agradecem o apoio do Departamento de Cirurgia Bucomaxilofacial do Hospital Universitário de Tuebingen.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well plate, not-treatedCorning Incorporated (Kennebunk, USA) 144530
Absorbance reader Infinite F50 TECAN Austria GmbH (Grödig, Austria)TCAT91000001
Accutase in DPBS, 0.5 mM EDTAEMD Millipore Corp. (Burlington, USA)SCR005
Anti-Fade Fluorescence Mounting Medium -Aqueous, Fluoroshieldabcam (Cambridge, UK)ab104135
Bio-Rad MJ Research PTC-200 Peltier Thermal CyclerBio-Rad / MJ Research7212
Bovine serum albumin (BSA)VWR International bvba (Leuven, Belgium)422361V
Centrifuge 5804 REppendorf SE (Hamburg, Germany)5804 R
DC-SIGN (D7F5C) XP Rabbit mAbCell Signaling Technology13193
Dimethyl sulfoxideSigma Aldrich Co. (St.Louis, MO, USA)D2438-5X10ML
DRAQ5 Staining SolutionMilteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)130-117-344
Ethanol ≥99.8% for molecularbiologyCarl Roth GmbH + CO. KG (Karlsruhe, Germany)1HPH.1
Goat Anti-Mouse IgG (H&L) Highly Cross-Adsorbed
Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488		InvitrogenA32723TR
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Cyanine3InvitrogenA10520
GraphPad PrismGraphPadVersion  9.4.1
Human CCR7 AntibodyR&D SystemsMAB197
Human IFN-gamma RecombinantInvitrogen (Rockford, USA)RIFNG100
Human IL-13Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)5230901032
Human IL-4Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)130-095-373
Human M-CSFPeprotech (Cranbury, USA)300-25
Leica TCS SP5Leica Microsystems CMS GmbH (Mannheim, Germany)https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp5/
Lipopolysaccharides from EscherichiaSigma Aldrich Co. (Missouri, USA)L4391-1MG
Luna Universal qPCR Master Mix New England BiolabsNEB #M3003
LunaScript RT SuperMix KitNew England BiolabsE3010L
Lymphocyte Separation Medium 1077PromoCell (Heidelberg, Germany)C-44010
MCP-4/CCL13 Human ELISA KitInvitrogenEHCCL13
MicroAmp Fast 96-Well Reaction Plate (0.1 mL)Applied Biosystems (Waltham, USA)4346907
MicroAmp Optical Adhesive FilmLife Technologies Corporation (Carlsbad, USA)4311971
MicroAmp Splash Free 96-Well BaseApplied Biosystems (Waltham, USA)4312063
Microlitercentrifuge CD-3124RPhoenix Instrument (Germany)9013111121
Microscope Cover Glasses, 10 mmCarl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany4HX4.1
Monocyte Attachment MediumPromoCell (Heidelberg, Germany)C-28051
Multiply-Pro Gefäß 0.5 mL, PPSarstedt AG & CO (Nümbrecht, Germany)7,27,35,100
Nanodrop OneThermo Scientific (USA)ND-ONE-W
QuantStudio 3 SystemLife Technologies GmbH (St. Leon-Rot, Germany)A28567
RNeasy Micro KitQiagen74007
RPMI 1640, 1x, with L-glutamineMediatech, Inc. (Manassas, USA)10-040-CV
Sterile bench, LaminarAir HB 2472 Heraeus instruments (Hanau, Germany)51012197
Tissue Culture Coverslips 13 mm (Plastic)Sarstedt Inc. (Newton, USA)83,18,40,002
Titanium machinied discs 12 cm Medentis Medical (Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Germany)N/A
TNF alpha Human ELISA KitInvitrogenKHC3011
Trypan blue solution 0.4%Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany)1680.1

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