Polarisation et caractérisation de macrophages dérivés de monocytes humains M1 et M2 sur des surfaces d’implants

Résumé

Nous présentons ici un protocole détaillé d’évaluation du potentiel immunomodulateur des surfaces d’implants in vitro, dans le but d’améliorer la fiabilité et la reproductibilité des protocoles actuels et de promouvoir la poursuite des recherches. Les profils de cytokines sécrétoires, l’expression de l’ARNm et les marqueurs de surface cellulaire ont été surveillés à l’aide de macrophages dérivés de monocytes sanguins pour étudier la polarisation des macrophages cultivés sur du titane.

Résumé

La réaction à un corps étranger (FBR), un processus de cicatrisation complexe à médiation immunitaire, joue un rôle crucial dans l’intégration des implants dans le corps. Les macrophages, en tant que première ligne d’interaction du système immunitaire avec les surfaces de l’implant, jouent un rôle bidirectionnel dans la modulation de l’équilibre inflammation-régénération. Pour une compréhension approfondie et l’évaluation des réactions entre les matériaux d’implants et les réponses immunitaires, des méthodes et des protocoles in vitro fiables sont essentiels. Parmi les différents modèles in vitro , les macrophages primaires dérivés de monocytes (MDM) présentent un excellent modèle pour étudier les interactions macrophages-implants. Nous avons mis en place un protocole expérimental pour évaluer la polarisation des MDM en macrophages M1 (activés classiquement) et M2 (activés alternativement) sur les surfaces des implants. Nous avons isolé des monocytes sanguins de donneurs sains et les avons différenciés en macrophages à l’aide du facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF). Des macrophages différenciés ont été cultivés sur les surfaces de l’implant et polarisés en sous-types M1 et M2. La polarisation M1 a été obtenue en présence d’interféron (IFN)-γ et de lipopolysaccharide (LPS), tandis que la polarisation M2 a été réalisée dans un milieu contenant de l’interleukine (IL)-4 et de l’IL-13. Nous avons évalué les phénotypes des macrophages par immuno-enzymatique (ELISA), microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) sur la base de panels de cytokines sécrétées, de marqueurs de surface cellulaire et de gènes exprimés. L’ARN extrait a été transformé en ADN complémentaire (ADNc), et la qRT-PCR a été utilisée pour quantifier l’ARNm lié aux macrophages M1 et M2. En conséquence, les macrophages M1 ont été caractérisés par une expression plus élevée de la cytokine pro-inflammatoire du facteur de nécrose tumorale (TNF-α) et du marqueur de surface CCR7 par rapport aux macrophages M2, qui présentaient des niveaux plus élevés de CD209 et CCL13. Par conséquent, CCR7 et CD209 ont été identifiés comme des marqueurs spécifiques et fiables des sous-types de macrophages M1 et M2 par immunomarquage et visualisation par CLSM. Une confirmation supplémentaire a été obtenue par ELISA détectant un taux élevé de TNF-ɑ dans M1 et une augmentation du CCL13 dans les cellules M2. Les marqueurs proposés et le dispositif expérimental peuvent être utilisés efficacement pour évaluer le potentiel immunomodulateur des implants.

Introduction

Les biomatériaux implantables sont devenus une solution conventionnelle pour diverses maladies humaines et jouent un grand rôle dans la recherche biomédicale, y compris l’ingénierie tissulaire, les systèmes d’administration de médicaments et les implants ^1,2. Il existe une large gamme d’implants fabriqués à partir de divers matériaux avec différentes structures et fonctionnalités, tels que des prothèses de hanche, des stents, des mailles, des valves cardiaques ou des implants dentaires. Lors de l’implantation, le contact tissu-implant provoque une réponse immunitaire, suivie d’une résolution, d’un remodelage tissulaire et d’une homéostasie. Ces processus sont influencés par les caractéristiques physiques, chimiques et bioactives des biomatériaux utilisés. Ces caractéristiques peuvent affecter l’intensité et le spectre des réponses pro- et anti-inflammatoires, la formation de capsules fibrotiques, la dégradation des tissus et la phase^de cicatrisation ^3,4. Afin de soutenir et d’optimiser le processus de cicatrisation et l’intégration à long terme des implants, l’un des aspects émergents de la recherche actuelle consiste à étudier et à arbitrer l’interaction entre les surfaces des implants et les cellules immunitaires.

Parmi les autres cellules immunitaires, les macrophages, que l’on trouve dans tout le corps, sont des acteurs clés de l’inflammation et de la défense antipathogène, ainsi que des processus de guérison et du maintien de l’homéostasie tissulaire ^5,6. Sur la base de leur plasticité et des stimuli microenvironnementaux tissulaires locaux, les macrophages sont capables de se polariser en phénotypes fonctionnels distincts, qui présentent de grandes différences dans le métabolisme cellulaire, les fonctions cellulaires et les profils de sécrétion de cytokines. Le phénotype M1 classiquement activé se distingue par la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-1β, l’IL-6 et le TNF-α, et est impliqué dans la réponse inflammatoire initiale et chronique aux traumatismes et aux biomatériaux étrangers. En revanche, les macrophages M2 activés, qui sont déclenchés par des cytokines telles que l’IL-4 et l’IL-13, présentent des caractéristiques telles que la résolution de l’inflammation et la promotion de la cicatrisation des tissus. Les macrophages polarisés M2 peuvent être identifiés par l’expression de marqueurs de surface cellulaire tels que CD206 et la production de cytokines comme IL-10 et IL-4⁷. De même, les macrophages qui ont déjà été polarisés peuvent se reprogrammer dans un nouveau microenvironnement.

De nombreuses études sur les interactions cellule-biomatériaux ont montré l’importance des macrophages dans la cascade des réponses immunologiques envers les biomatériaux implantables et dans l’orchestration des processus impliqués dans la guérison des complications liées aux implants ^8,9,10. Même si l’ingénierie biomédicale a fait des progrès significatifs ces dernières années, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre comment les implants modulent le comportement et la polarisation des macrophages 11,12,13.

En culture cellulaire, les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) dérivées de monocytes peuvent être différenciées en macrophages M0 adhérents, suivies d’une polarisation induite vers les phénotypes M1 ou M2 en utilisant respectivement le LPS et l’IFN-γ ou l’IL-4. Après l’incubation in vitro avec de nouveaux échantillons de biomatériaux, il est possible d’utiliser les différents récepteurs de surface cellulaire et les profils cytokiniques des macrophages M1 et M2 pour détecter le potentiel immunomodulateur des biomatériaux in vitro^14,15. Cette étude visait à développer un protocole in vitro qui peut être utilisé pour étudier la polarisation des MDM en réponse à différentes surfaces d’implants. Les analyses d’expression génique, les techniques de microscopie et l’ELISA peuvent être utilisées pour déterminer les marqueurs phénotypiques et les profils cytokiniques spécifiques des macrophages M1 et M2 modulés par le biomatériau. Par conséquent, les interactions complexes entre les macrophages et les surfaces des biomatériaux peuvent être élucidées, et des informations précieuses peuvent être obtenues pour mieux comprendre les interactions macrophages-biomatériaux. Enfin, un protocole in vitro standardisé garantit la reproductibilité, la fiabilité et la comparabilité des résultats expérimentaux en minimisant la variabilité dans le dispositif expérimental.

Protocole

Le sang périphérique humain a été obtenu à partir de donneurs de sang sains conformément au protocole approuvé par le comité d’éthique de la faculté de médecine de l’Université de Tübingen (approbation éthique : 286/2021 BO). Les PBMC humains ont été isolés à l’aide de la centrifugation à gradient de densité, comme décrit précédemment¹⁶. Le protocole suivant est décrit pour les PBMC isolés à partir de 24 mL de sang. Une représentation schématique du protocole est illustrée à la figure 1.

REMARQUE : Le volume sanguin doit être ajusté en fonction du nombre de macrophages M0 utilisés.

Au total, 35,46 ± 9,1 millions de PBMC ont été obtenus à partir de 24 ml de sang, ce qui a donné 1,97 ± 0,46 million de macrophages M0 (n = 5). Tous les réactifs, consommables et appareils sont répertoriés dans la table des matériaux. Les tampons sont répertoriés dans le Tableau 1.

1. Différenciation des monocytes sanguins humains en macrophages

1. Remettre en suspension les PBMC isolés dans 15 mL de milieu de fixation monocytaire préchauffé et les transférer dans une fiole de culture cellulaire T75.
2. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 90 min pour permettre l’adhérence.
3. Jetez le surnageant et lavez les cellules une fois avec un milieu complet préchauffé avec une légère inclinaison pour éliminer les cellules non adhérentes ou faiblement adhérentes.
   REMARQUE : Les cellules attachées sont des monocytes, qui représentent environ 10 % du total des PBMC ajoutés à l’origine dans le flacon.
4. Ajouter 15 mL de milieu complet contenant 10 ng/mL de facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) aux cellules adhérentes et incuber pendant 6 jours pour favoriser la différenciation.
5. Remplacez le milieu par un milieu frais complet contenant 10 ng/mL DE M-CSF tous les 2 jours.

2. Culture et polarisation des MDM sur la surface de l’implant en titane

REMARQUE : Au 6e jour de différenciation, les macrophages M0 ont été ensemencés à la surface du biomatériau avec différents stimuli pendant 48 h pour obtenir des macrophages M1 ou M2 entièrement polarisés. Pour chaque surface examinée, trois disques ont été utilisés pour ensemencer les macrophages M0, M1 et M2. Des lamelles en plastique traitées par culture cellulaire ont été utilisées comme surfaces de contrôle.

1. Retirer le milieu de culture des flacons T75 et laver les cellules avec 10 mL de PBS pendant 5 min.
2. Détacher les cellules adhérentes en les incubant avec 10 mL de solution de détachement cellulaire préchauffée pendant 30 min.
3. Tapotez doucement les cellules et transférez-les dans un tube de 50 ml. Détachez les cellules restantes en les grattant doucement dans 10 mL de PBS.
4. Transférez les cellules détachées dans le tube de 50 mL et centrifugez-les à 300 x g pendant 10 min.
5. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 5 mL de milieu complet préchauffé.
6. Comptez les cellules à l’aide d’une coloration au bleu de trypan et d’un hémocytomètre pour déterminer le nombre et la viabilité des cellules.
7. Préparez la suspension cellulaire en ajustant le nombre de cellules à 160 000 cellules par 1 mL de milieu complet.
8. Nettoyez les disques de biomatériau par ultrasons avec de l’éthanol à 70 % pendant 5 min, suivi d’une stérilisation avec de l’éthanol à 70 % pendant 30 min.
9. Faites sécher les disques de titane pendant 1 à 2 h, puis placez-les dans des plaques non traitées à 24 puits et ajoutez 1 ml de suspension cellulaire préparée dans chaque puits.
10. Pour obtenir des macrophages polarisés M1, ajouter de l’IFN-γ et du LPS à la concentration de 50 ng/mL et 10 ng/mL, respectivement. Pour la polarisation M2, ajouter l’IL-4 et l’IL-13 à une concentration de 20 ng/mL chacune. Assurez-vous que les cellules M0 sont cultivées sans aucun agent de polarisation. Incuber les cellules pendant encore 48 h à 37 °C et 5 % de CO₂ pour induire la polarisation.

3. Caractérisation des macrophages polarisés à l’aide de l’ELISA

REMARQUE : Au jour 2 de la polarisation, des échantillons ont été préparés pour les analyses de caractérisation. La cytokine TNF-ɑ et la chimiokine CCL13 ont été mesurées pour caractériser les macrophages polarisés M1 et M2, respectivement. La concentration des protéines sécrétées a été normalisée à la concentration totale des protéines sécrétées dans le surnageant correspondant.

1. Prélever le surnageant dans un tube de 1,5 mL et le centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Transférez le surnageant dans un nouveau tube.
2. Transférez les disques sur une nouvelle plaque à 24 puits pour d’autres expériences. L’objectif est d’éliminer les cellules mortes ou faiblement attachées dans des plaques non traitées à 24 puits.
   REMARQUE : La viabilité des cellules doit être vérifiée sur les surfaces avant toute analyse. La viabilité des cellules peut être déterminée par des tests de viabilité de cellules vivantes/mortes ou indirectement par des tests de prolifération cellulaire et de cytotoxicité.
3. Mesurez les cytokines et les chimiokines selon les instructions spécifiques fournies par le fabricant. Mesurez les cytokines soit immédiatement, soit conservez les échantillons à -80 °C pour une mesure future.
   REMARQUE : Pour chaque type de kit (compte tenu de la sensibilité et des limites de détection du kit ELISA), la dilution appropriée de l’échantillon doit être déterminée. Pour le dosage de l’acide bicinchoninique (BCA), les échantillons ont été dilués 1:5. Les échantillons M1 pour TNF-ɑ ont été dilués 1:10, et les échantillons M2 pour CCL13 ont été dilués 1:12.
4. Calculez la concentration de cytokines/chimiokines sécrétées à l’aide de la courbe standard en suivant les instructions du fabricant.
5. Mesurez la quantité totale de protéines à l’aide du kit de dosage des protéines BCA.
6. Normaliser la concentration des protéines sécrétées en mg de protéines totales.

4. Caractérisation des macrophages polarisés à l’aide du CLSM

REMARQUE : Les macrophages polarisés ont été caractérisés en les colorant avec des anticorps dirigés contre les marqueurs de surface cellulaire CD209 et CCR7. Les noyaux ont été contre-colorés avec DRAQ5. CD68 ou d’autres marqueurs peuvent être utilisés comme marqueurs pan-macrophages.

1. Laver les cellules 2x dans 800 μL de PBS. Incuber les disques pendant 20 min à température ambiante (RT) dans 400 μL de tampon de fixation.
2. Après avoir retiré le tampon de fixation, laver trois fois dans 400 μL de PBS. Colorer immédiatement les échantillons ou les conserver à 4 °C dans 1 mL de tampon de stockage.
   REMARQUE : Avec ce protocole de fixation et de stockage, les échantillons ont été colorés et imagés avec succès dans les 1 à 6 semaines suivant la fixation.
3. Avant l’étape suivante, lavez les disques deux fois avec 800 μL de PBS après le stockage.
4. Incuber les disques avec 400 μL de tampon de blocage pendant 30 min à RT pour bloquer les sites de liaison non spécifiques.
5. Jeter le tampon de blocage et incuber les disques à RT pendant 1 h avec des anticorps primaires dilués dans 400 μL de tampon de coloration.
   1. Effectuer une procédure d’immunofluorescence à l’aide d’une double coloration pour examiner l’expression de CCR7 et CD209 dans un échantillon. Pour ce faire, combinez des anticorps primaires provenant de différentes espèces (souris et lapin) dans la même étape de coloration.
      REMARQUE : Pour obtenir un signal fort avec un bruit de fond minimal, optimisez la concentration d’anticorps. L’anticorps CCR7 a été utilisé à une concentration finale de 10 μg/mL, et l’anticorps CD209 a été dilué à 1/400.
6. Retirez les anticorps primaires et lavez 3 fois avec 400 μL de tampon de lavage.
7. Ajouter des anticorps secondaires marqués au fluorophore dilués dans un tampon de coloration et incuber pendant 1 h à RT dans l’obscurité.
   REMARQUE : La concentration des anticorps secondaires doit être optimisée pour obtenir un maximum de signaux spécifiques avec un bruit de fond minimal. Dans cette étude, des anticorps secondaires ont été utilisés à une concentration de 5 μg/mL pour la coloration.
8. Après avoir retiré le surnageant, laver les échantillons trois fois dans le tampon de lavage pendant 3 minutes chacune.
9. Ajouter 10 μM DRAQ5 dans PBS et incuber 15 min à RT, à l’abri de la lumière.
10. Retirez le surnageant et lavez les disques une fois dans du PBS.
11. Retirez le PBS restant et ajoutez 1 goutte de support de montage.
12. Après 5 minutes, appliquez les verres de protection et laissez sécher les échantillons pendant 1 h.
13. Après avoir séché les échantillons, scellez les bords avec du vernis à ongles transparent et conservez-les à 4 °C dans l’obscurité jusqu’à l’imagerie.
14. Pour obtenir une vue d’ensemble des cellules, imagez les échantillons avec un grossissement de 25x. Pour déterminer davantage la structure et la localisation des marqueurs de surface, acquérez des images avec un grossissement de 63x.
15. Quantifiez l’intensité de fluorescence de CCR7 et CD209 à l’aide du logiciel ImageJ.
    REMARQUE : L’acquisition d’images a été effectuée à l’aide d’un photomultiplicateur (PMT) à l’aide d’un système CLSM, équipé d’un laser à argon (488 nm), d’un laser DPSS (561 nm) et d’un laser HeNe (633 nm).

5. Caractérisation des macrophages polarisés par qRT-PCR

REMARQUE : Pour l’isolement de l’ARN, deux disques par échantillon ont été utilisés afin d’obtenir suffisamment d’ARN pour la synthèse de l’ADNc.

1. Lavez les disques 2 fois avec 800 μL de PBS.
2. Ajoutez 350 μL de tampon de lyse au premier disque et lysez les cellules en pipetant de haut en bas.
3. Transférez le lysat sur le deuxième disque et répétez le processus de lyse.
4. Ajoutez 350 μL d’éthanol à 70 % dans le lysat et pipetez de haut en bas jusqu’à ce que l’homogénéité soit homogène.
5. Transférez le lysat dans la colonne de spin et suivez les instructions du fabricant pour l’isolement de l’ARN.
6. Quantifiez la quantité d’ARN à l’aide d’une nanogoutte ou d’un autre appareil.
7. Normalisez les concentrations d’ARN pour différents échantillons et synthétisez l’ADNc selon les instructions du fabricant à l’aide du système RT-PCR pour la synthèse de l’ADNc sur le premier brin.
8. Synthétisez l’ADNc à l’aide de 350 ng d’ARN en suivant le protocole du fabricant et stockez-le à -20 °C jusqu’à ce que l’analyse qRT-PCR soit effectuée.
   REMARQUE : Ici, 350 ng d’ARN purifié ont été utilisés pour synthétiser l’ADNc à l’aide de 4 μL de RT Mix (5x) dans 20 μL.
9. Effectuez une qRT-PCR sur un système de PCR en temps réel dans des plaques à 96 puits et des réactions individuelles de 15 μL (1x mélange maître vert Syber, 0,2 μM d’amorces directes et inverses et 4,5 μL d’ADNc dilué 1:10).
   REMARQUE : Le programme PCR commence par un couvercle chauffé (105 °C) suivi de trois étapes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 min, suivie de 15 s à 95 °C et de 30 s à 55 °C pendant 40 cycles.
10. Normaliser les niveaux d’expression de divers gènes au gène d’entretien GAPDH (ou à d’autres gènes d’entretien comme l’β-actine).
11. Calculer l’expression relative des gènes à l’aide de la méthode 2^−ΔΔCt en prenant comme référence les cellules M0 cultivées sur des lamelles de culture tissulaire. Le tableau 2 énumère toutes les amorces utilisées dans cette étude.

6. Analyse statistique

1. Présentez toutes les données sous forme de moyenne ± MEB. Répétez tous les essais (dans cette étude, les essais ont été répétés cinq fois) pour assurer la reproductibilité. Évaluez les différences statistiquement significatives entre des données normalement distribuées à l’aide d’une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie d’un test multiple de Tukey.
2. Utilisez le test de Friedman et le test de comparaison multiple de Dunn pour analyser des ensembles de données non paramétriques. Utilisez un logiciel d’analyse de données approprié pour analyser les données et définir la signification statistique comme une valeur p inférieure à 0,05.

Résultats

Les résultats de cette étude démontrent une différenciation et une polarisation réussies des MDM sur des surfaces en titane, suivies d’une caractérisation des macrophages polarisés M1 ou M2. Dans un premier temps, nous avons caractérisé les MDM polarisés à l’aide de CLSM. Sur la base de nos études préliminaires, CD209 et CCR7 ont été utilisés comme marqueurs spécifiques pour différencier les MDM polarisés M1 de M2. Comme le montrent les figures...

Discussion

Une compréhension approfondie du comportement des macrophages est essentielle pour comprendre les propriétés immunomodulatrices des matériaux implantables. Plusieurs études ont rapporté des marqueurs hétérogènes, une variété de modèles cellulaires et des protocoles pour caractériser la polarisation des macrophages in vitro 17,18,19,20. Pou...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate, not-treated	Corning Incorporated (Kennebunk, USA)	144530
Absorbance reader Infinite F50	TECAN Austria GmbH (Grödig, Austria)	TCAT91000001
Accutase in DPBS, 0.5 mM EDTA	EMD Millipore Corp. (Burlington, USA)	SCR005
Anti-Fade Fluorescence Mounting Medium -Aqueous, Fluoroshield	abcam (Cambridge, UK)	ab104135
Bio-Rad MJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cycler	Bio-Rad / MJ Research	7212
Bovine serum albumin (BSA)	VWR International bvba (Leuven, Belgium)	422361V
Centrifuge 5804 R	Eppendorf SE (Hamburg, Germany)	5804 R
DC-SIGN (D7F5C) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13193
Dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich Co. (St.Louis, MO, USA)	D2438-5X10ML
DRAQ5 Staining Solution	Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)	130-117-344
Ethanol ≥99.8% for molecularbiology	Carl Roth GmbH + CO. KG (Karlsruhe, Germany)	1HPH.1
Goat Anti-Mouse IgG (H&L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32723TR
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Cyanine3	Invitrogen	A10520
GraphPad Prism	GraphPad	Version  9.4.1
Human CCR7 Antibody	R&D Systems	MAB197
Human IFN-gamma Recombinant	Invitrogen (Rockford, USA)	RIFNG100
Human IL-13	Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)	5230901032
Human IL-4	Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)	130-095-373
Human M-CSF	Peprotech (Cranbury, USA)	300-25
Leica TCS SP5	Leica Microsystems CMS GmbH (Mannheim, Germany)	https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp5/
Lipopolysaccharides from Escherichia	Sigma Aldrich Co. (Missouri, USA)	L4391-1MG
Luna Universal qPCR Master Mix	New England Biolabs	NEB #M3003
LunaScript RT SuperMix Kit	New England Biolabs	E3010L
Lymphocyte Separation Medium 1077	PromoCell (Heidelberg, Germany)	C-44010
MCP-4/CCL13 Human ELISA Kit	Invitrogen	EHCCL13
MicroAmp Fast 96-Well Reaction Plate (0.1 mL)	Applied Biosystems (Waltham, USA)	4346907
MicroAmp Optical Adhesive Film	Life Technologies Corporation (Carlsbad, USA)	4311971
MicroAmp Splash Free 96-Well Base	Applied Biosystems (Waltham, USA)	4312063
Microlitercentrifuge CD-3124R	Phoenix Instrument (Germany)	9013111121
Microscope Cover Glasses, 10 mm	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	4HX4.1
Monocyte Attachment Medium	PromoCell (Heidelberg, Germany)	C-28051
Multiply-Pro Gefäß 0.5 mL, PP	Sarstedt AG & CO (Nümbrecht, Germany)	7,27,35,100
Nanodrop One	Thermo Scientific (USA)	ND-ONE-W
QuantStudio 3 System	Life Technologies GmbH (St. Leon-Rot, Germany)	A28567
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74007
RPMI 1640, 1x, with L-glutamine	Mediatech, Inc. (Manassas, USA)	10-040-CV
Sterile bench, LaminarAir HB 2472	Heraeus instruments (Hanau, Germany)	51012197
Tissue Culture Coverslips 13 mm (Plastic)	Sarstedt Inc. (Newton, USA)	83,18,40,002
Titanium machinied discs 12 cm	Medentis Medical (Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Germany)	N/A
TNF alpha Human ELISA Kit	Invitrogen	KHC3011
Trypan blue solution 0.4%	Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany)	1680.1