Polarisation und Charakterisierung von M1- und M2-humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen auf Implantatoberflächen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Bewertung des immunmodulatorischen Potenzials von Implantatoberflächen in vitro vor, um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit aktueller Protokolle zu verbessern und die weitere Forschung zu fördern. Sekretorische Zytokinprofile, mRNA-Expression und Zelloberflächenmarker wurden mit Hilfe von Blutmonozyten-abgeleiteten Makrophagen überwacht, um die Makrophagenpolarisation auf Titan zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Fremdkörperreaktion (FBR), ein immunvermittelter komplexer Heilungsprozess, spielt eine entscheidende Rolle bei der Integration von Implantaten in den Körper. Makrophagen als erste Linie der Interaktion des Immunsystems mit den Implantatoberflächen spielen eine bidirektionale Rolle bei der Modulation des Gleichgewichts zwischen Entzündung und Regeneration. Für ein tiefes Verständnis und die Bewertung der Reaktionen zwischen Implantatmaterialien und Immunantworten sind zuverlässige in vitro Methoden und Protokolle von entscheidender Bedeutung. Unter den verschiedenen in vitro Modellen stellen primäre Monozyten-abgeleitete Makrophagen (MDMs) ein hervorragendes Modell für die Untersuchung von Makrophagen-Implantat-Interaktionen dar. Wir haben ein experimentelles Protokoll implementiert, um die Polarisation von MDMs in M1 (klassisch aktivierte) und M2 (alternativ aktivierte) Makrophagen auf Implantatoberflächen zu bewerten. Wir isolierten Blutmonozyten von gesunden Spendern und differenzierten sie mit Hilfe des Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (M-CSF) in Makrophagen. Differenzierte Makrophagen wurden auf Implantatoberflächen kultiviert und in M1- und M2-Subtypen polarisiert. Die M1-Polarisation wurde in Gegenwart von Interferon (IFN)-γ und Lipopolysaccharid (LPS) erreicht, während die M2-Polarisation in einem Medium durchgeführt wurde, das Interleukin (IL)-4 und IL-13 enthielt. Wir untersuchten Makrophagen-Phänotypen mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) und quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) auf der Grundlage von Panels von sezernierten Zytokinen, Zelloberflächenmarkern und exprimierten Genen. Die extrahierte RNA wurde in komplementäre DNA (cDNA) umgewandelt, und die qRT-PCR wurde verwendet, um mRNA zu quantifizieren, die mit M1- und M2-Makrophagen verwandt ist. Dementsprechend wurden M1-Makrophagen durch eine höhere Expression des proinflammatorischen Tumornekrosefaktors (TNF-α)-Zytokins und des CCR7-Oberflächenmarkers im Vergleich zu M2-Makrophagen, die höhere Spiegel von CD209 und CCL13 aufwiesen, charakterisiert. Folglich wurden CCR7 und CD209 als spezifische und zuverlässige Marker für M1- und M2-Makrophagen-Subtypen durch Immunfärbung und Visualisierung mittels CLSM identifiziert. Eine weitere Bestätigung wurde durch den ELISA erreicht, der einen erhöhten TNF-ɑ-Spiegel in M1 und einen erhöhten CCL13-Spiegel in M2-Zellen nachweiste. Die vorgeschlagenen Marker und der Versuchsaufbau können effektiv genutzt werden, um das immunmodulatorische Potenzial von Implantaten zu bewerten.

Einleitung

Implantierbare Biomaterialien sind zu einer konventionellen Lösung für verschiedene menschliche Krankheiten geworden und spielen eine große Rolle in der biomedizinischen Forschung, einschließlich Tissue Engineering, Drug Delivery Systems und Implantaten ^1,2. Es gibt eine große Auswahl an Implantaten aus verschiedenen Materialien mit unterschiedlichen Strukturen und Funktionalitäten, wie z. B. Hüftprothesen, Stents, Netze, Herzklappen oder Zahnimplantate. Bei der Implantation provoziert der Gewebe-Implantat-Kontakt eine Immunantwort, gefolgt von Auflösung, Gewebeumbau und Homöostase. Diese Prozesse werden durch die physikalischen, chemischen und bioaktiven Eigenschaften der verwendeten Biomaterialien beeinflusst. Diese Eigenschaften können die Intensität und das Spektrum der pro- und antiinflammatorischen Reaktionen, die Bildung fibrotischer Kapseln, den Gewebeabbau und die Heilungsphase beeinflussen ^3,4. Um den Heilungsprozess und die langfristige Implantatintegration zu unterstützen und zu optimieren, ist ein neuer Aspekt der aktuellen Forschung die Untersuchung und Vermittlung der Interaktion zwischen Implantatoberflächen und Immunzellen.

Makrophagen, die im ganzen Körper vorkommen, spielen unter anderem eine Schlüsselrolle bei Entzündungen und antipathogener Abwehr sowie bei Heilungsprozessen und der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase ^5,6. Aufgrund ihrer Plastizität und der lokalen Mikroumgebungsreize des Gewebes sind Makrophagen in der Lage, in unterschiedliche funktionelle Phänotypen zu polarisieren, die große Unterschiede im Zellstoffwechsel, in den zellulären Funktionen und in den Zytokinsekretionsprofilen aufweisen. Der klassisch aktivierte M1-Phänotyp kann durch die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen wie IL-1β, IL-6 und TNF-α unterschieden werden und ist an der anfänglichen und chronischen Entzündungsreaktion auf Traumata und fremde Biomaterialien beteiligt. Im Gegensatz dazu weisen aktivierte M2-Makrophagen, die durch Zytokine wie IL-4 und IL-13 ausgelöst werden, charakteristische Merkmale wie die Auflösung von Entzündungen und die Förderung der Gewebeheilung auf. M2-polarisierte Makrophagen können durch die Expression von Zelloberflächenmarkern wie CD206 und die Produktion von Zytokinen wie IL-10 und IL-4⁷ identifiziert werden. In ähnlicher Weise können sich Makrophagen, die bereits polarisiert wurden, in einer neuen Mikroumgebung neu programmieren.

Viele Studien zu Zell-Biomaterial-Wechselwirkungen haben die Bedeutung von Makrophagen in der Kaskade immunologischer Reaktionen auf implantierbare Biomaterialien und bei der Orchestrierung von Prozessen bei der Heilung implantatbedingter Komplikationen gezeigt ^8,9,10. Auch wenn die Biomedizintechnik in den letzten Jahren erhebliche Fortschritte gemacht hat, sind weitere Forschungen erforderlich, um zu verstehen, wie Implantate das Verhalten und die Polarisation von Makrophagen modulieren 11,12,13.

In Zellkulturen können aus Monozyten stammende mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) in adhärente M0-Makrophagen differenziert werden, gefolgt von einer induzierten Polarisation in Richtung M1- oder M2-Phänotypen unter Verwendung von LPS bzw. IFN-γ bzw. IL-4. Nach der Inkubation in vitro mit neuen Biomaterialproben ist es möglich, die verschiedenen Zelloberflächenrezeptoren und Zytokinprofile von M1- und M2-Makrophagen zu nutzen, um das immunmodulatorische Potenzial von Biomaterialien in vitro nachzuweisen ^14,15. Ziel dieser Studie war es, ein in vitro Protokoll zu entwickeln, mit dem die Polarisation von MDMs als Reaktion auf verschiedene Implantatoberflächen untersucht werden kann. Genexpressionsanalysen, Mikroskopietechniken und ELISA können verwendet werden, um die phänotypischen Marker und spezifischen Zytokinprofile von M1- und M2-Makrophagen zu bestimmen, die durch das Biomaterial moduliert werden. So können die komplexen Wechselwirkungen zwischen Makrophagen und Biomaterialoberflächen aufgeklärt und wertvolle Informationen gewonnen werden, um Makrophagen-Biomaterial-Wechselwirkungen besser zu verstehen. Schließlich gewährleistet ein standardisiertes In-vitro-Protokoll die Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit und Vergleichbarkeit der Versuchsergebnisse, indem die Variabilität im Versuchsaufbau minimiert wird.

Protokoll

Das humane periphere Blut wurde von gesunden Blutspendern gemäß dem von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Tübingen genehmigten Protokoll gewonnen (Ethische Zulassung: 286/2021 BO). Humane PBMCs wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert, wie zuvor beschrieben¹⁶. Das folgende Protokoll ist für PBMCs beschrieben, die aus 24 ml Blut isoliert wurden. Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

HINWEIS: Das Blutvolumen sollte in Abhängigkeit von der Anzahl der verwendeten M0-Makrophagen angepasst werden.

Aus 24 mL Blut wurden insgesamt 35,46 ± 9,1 Mio. PBMC gewonnen, was zu 1,97 ± 0,46 Mio. M0-Makrophagen (n = 5) führte. Alle Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die Puffer sind in Tabelle 1 aufgeführt.

1. Differenzierung von Monozyten im menschlichen Blut zu Makrophagen

1. Resuspendieren Sie die isolierten PBMCs in 15 mL vorgewärmtem Monozyten-Bindungsmedium und überführen Sie sie in einen T75-Zellkulturkolben.
2. Die Zellen werden 90 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert, um eine Adhäsion zu ermöglichen.
3. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmtem Vollmedium unter leichtem Kippen, um nicht anhaftende oder lose anhaftende Zellen zu entfernen.
   ANMERKUNG: Bei den angehängten Zellen handelt es sich um Monozyten, die etwa 10 % der gesamten PBMC ausmachen, die ursprünglich in den Kolben gegeben wurden.
4. Geben Sie 15 ml vollständiges Medium mit 10 ng/ml Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (M-CSF) zu den adhärenten Zellen und inkubieren Sie es 6 Tage lang, um die Differenzierung zu fördern.
5. Tauschen Sie das Medium alle 2 Tage gegen ein frisches, vollständiges Medium mit 10 ng/mL M-CSF aus.

2. Kultivierung und Polarisation von MDMs auf der Titanimplantatoberfläche

HINWEIS: Am Tag 6 der Differenzierung wurden M0-Makrophagen 48 h lang mit unterschiedlichen Stimuli auf die Biomaterialoberflächen ausgesät, um vollständig polarisierte M1- oder M2-Makrophagen zu erhalten. Für jede untersuchte Oberfläche wurden drei Scheiben verwendet, um M0-, M1- und M2-Makrophagen zu säen. Als Kontrollflächen wurden mit Zellkulturen behandelte Kunststoffdeckgläser verwendet.

1. Nehmen Sie das Kulturmedium aus den T75-Kolben und waschen Sie die Zellen 5 Minuten lang mit 10 mL PBS.
2. Lösen Sie adhärente Zellen, indem Sie sie 30 Minuten lang mit 10 ml vorgewärmter Zellablösungslösung inkubieren.
3. Klopfen Sie die Zellen vorsichtig ab und geben Sie sie in ein 50 mL Röhrchen. Entfernen Sie die verbleibenden Zellen, indem Sie sie vorsichtig in 10 ml PBS abkratzen.
4. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in das 50 mL Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 300 x g für 10 min.
5. Den Überstand verwerfen und die Zellen in 5 ml vorgewärmtem Komplettmedium resuspendieren.
6. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau-Färbung und einem Hämozytometer, um die Zellzahl und Lebensfähigkeit zu bestimmen.
7. Bereiten Sie die Zellsuspension vor, indem Sie die Zellzahl auf 160.000 Zellen pro 1 ml vollständigem Medium einstellen.
8. Reinigen Sie die Biomaterial-Discs 5 Minuten lang mit Ultraschall in 70 % Ethanol, gefolgt von einer Sterilisation in 70 % Ethanol für 30 Minuten.
9. Trocknen Sie die Titanscheiben 1-2 Stunden lang, legen Sie sie dann in unbehandelte 24-Well-Platten und geben Sie 1 ml vorbereitete Zellsuspension in jedes Well.
10. Um M1-polarisierte Makrophagen zu erhalten, fügen Sie IFN-γ und LPS in einer Konzentration von 50 ng/ml bzw. 10 ng/ml hinzu. Für die M2-Polarisation fügen Sie IL-4 und IL-13 in einer Konzentration von jeweils 20 ng/ml hinzu. Stellen Sie sicher, dass die M0-Zellen ohne Polarisationsmittel gezüchtet werden. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 48 Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂ , um eine Polarisation zu induzieren.

3. Charakterisierung polarisierter Makrophagen mittels ELISA

HINWEIS: Am Tag 2 der Polarisation wurden Proben für die Charakterisierungsanalysen vorbereitet. Das TNF-ɑ-Zytokin und das CCL13-Chemokin wurden gemessen, um M1- bzw. M2-polarisierte Makrophagen zu charakterisieren. Die Konzentration der sezernierten Proteine wurde auf die Gesamtkonzentration der sezernierten Proteine im entsprechenden Überstand normiert.

1. Sammeln Sie den Überstand in einem 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie ihn 5 Minuten lang bei 300 x g . Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen.
2. Übertragen Sie die Discs für weitere Experimente auf eine neue 24-Well-Platte. Ziel ist es, tote oder lose anhaftende Zellen in unbehandelten 24-Well-Platten zu eliminieren.
   HINWEIS: Die Viabilität der Zellen sollte an Oberflächen überprüft werden, bevor eine Analyse durchgeführt wird. Die Lebensfähigkeit von Zellen kann durch Viabilitätstests für lebende/tote Zellen oder indirekt durch Zellproliferations- und Zytotoxizitätstests bestimmt werden.
3. Messen Sie die Zytokine und Chemokine gemäß den spezifischen Anweisungen des Herstellers. Messen Sie die Zytokine entweder sofort oder lagern Sie die Proben bei -80 °C für zukünftige Messungen.
   HINWEIS: Für jeden Kit-Typ sollte (unter Berücksichtigung der Empfindlichkeit und der Nachweisgrenzen des ELISA-Kits) eine geeignete Probenverdünnung bestimmt werden. Für den Bicinchoninsäure (BCA)-Assay wurden die Proben im Verhältnis 1:5 verdünnt. Die M1-Proben für TNF-ɑ wurden 1:10 und die M2-Proben für CCL13 1:12 verdünnt.
4. Berechnen Sie die Konzentration der sezernierten Zytokine/Chemokine unter Verwendung der Standardkurve gemäß den Anweisungen des Herstellers.
5. Messen Sie die Gesamtproteinmenge mit dem BCA-Protein-Assay-Kit.
6. Normalisieren Sie die Konzentration der sekretierten Proteine auf mg des Gesamtproteins.

4. Charakterisierung polarisierter Makrophagen mittels CLSM

HINWEIS: Polarisierte Makrophagen wurden weiter charakterisiert, indem sie mit Antikörpern gegen CD209- und CCR7-Zelloberflächenmarker gefärbt wurden. Die Kerne wurden mit DRAQ5 gegengefärbt. CD68 oder andere Marker können als Pan-Makrophagen-Marker verwendet werden.

1. Waschen Sie die Zellen 2x in 800 μL PBS. Die Scheiben werden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) in 400 μl Fixationspuffer inkubiert.
2. Nach dem Entfernen des Fixierpuffers dreimal in 400 μl PBS waschen. Die Proben sofort färben oder bei 4 °C in 1 mL Lagerpuffer lagern.
   HINWEIS: Mit diesem Fixierungs- und Lagerungsprotokoll wurden die Proben innerhalb von 1-6 Wochen nach der Fixierung erfolgreich gefärbt und abgebildet.
3. Waschen Sie die Scheiben vor dem nächsten Schritt nach der Lagerung zweimal mit 800 μl PBS.
4. Inkubieren Sie Discs mit 400 μl Blockierungspuffer für 30 min bei RT, um die unspezifischen Bindungsstellen zu blockieren.
5. Verwerfen Sie den Blockierungspuffer und inkubieren Sie die Discs 1 h lang bei RT mit Primärantikörpern, die in 400 μl Färbepuffer verdünnt sind.
   1. Führen Sie ein Immunfluoreszenzverfahren mit Doppelfärbung durch, um die Expression von CCR7 und CD209 in einer Probe zu untersuchen. Zu diesem Zweck werden Primärantikörper kombiniert, die von verschiedenen Spezies (Maus und Kaninchen) im selben Färbeschritt gezüchtet wurden.
      HINWEIS: Um ein starkes Signal mit minimalem Hintergrund zu erzielen, optimieren Sie die Antikörperkonzentration. Der CCR7-Antikörper wurde in einer Endkonzentration von 10 μg/ml verwendet, und der CD209-Antikörper wurde um 1/400 verdünnt.
6. Entfernen Sie die primären Antikörper und waschen Sie 3x mit 400 μl Waschpuffer.
7. Fluorophor-markierte Sekundärantikörper, verdünnt in Färbepuffer, zugeben und 1 h bei RT im Dunkeln inkubieren.
   HINWEIS: Die Konzentration der Sekundärantikörper sollte optimiert werden, um maximale spezifische Signale mit minimalem Hintergrund zu erhalten. In dieser Studie wurden Sekundärantikörper in einer Konzentration von 5 μg/mL zur Färbung verwendet.
8. Nach Entfernen des Überstands werden die Proben dreimal für jeweils 3 Minuten im Waschpuffer gewaschen.
9. 10 μM DRAQ5 in PBS geben und 15 min bei RT lichtgeschützt inkubieren.
10. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Scheiben einmal in PBS.
11. Entfernen Sie das restliche PBS und fügen Sie 1 Tropfen Eindeckmedium hinzu.
12. Nach 5 min setzen Sie die Deckgläser auf und lassen Sie die Proben 1 h trocknen.
13. Nach dem Trocknen der Proben die Ränder mit klarem Nagellack versiegeln und bis zur Bildgebung bei 4 °C im Dunkeln lagern.
14. Um einen Überblick über die Zellen zu erhalten, bilden Sie die Proben mit 25-facher Vergrößerung ab. Um die Struktur und Lokalisierung von Oberflächenmarkierungen weiter zu bestimmen, nehmen Sie Bilder mit 63-facher Vergrößerung auf.
15. Quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensität von CCR7 und CD209 mit der ImageJ-Software.
    HINWEIS: Die Bildaufnahme wurde mit einem Photomultiplier (PMT) unter Verwendung eines CLSM-Systems durchgeführt, das mit einem Argon-Laser (488 nm), einem DPSS-Laser (561 nm) und einem HeNe-Laser (633 nm) ausgestattet war.

5. Charakterisierung polarisierter Makrophagen mittels qRT-PCR

HINWEIS: Für die RNA-Isolierung wurden zwei Scheiben pro Probe verwendet, um genügend RNA für die cDNA-Synthese zu erhalten.

1. Waschen Sie die Scheiben 2x mit 800 μL PBS.
2. Geben Sie 350 μl Lysepuffer auf die erste Scheibe und lysieren Sie die Zellen durch Auf- und Abpipettieren.
3. Übertragen Sie das Lysat auf die zweite Scheibe und wiederholen Sie den Lysevorgang.
4. Geben Sie 350 μl 70%iges Ethanol in das Lysat und pipettieren Sie es auf und ab, bis es homogen ist.
5. Übertragen Sie das Lysat in die Spin-Säule und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zur RNA-Isolierung.
6. Quantifizieren Sie die RNA-Menge mit einem Nanotropfen oder einem anderen Gerät.
7. Normalisieren Sie die RNA-Konzentrationen für verschiedene Proben und synthetisieren Sie cDNA gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem RT-PCR-System für die Erststrang-cDNA-Synthese.
8. Synthetisieren Sie die cDNA mit 350 ng RNA gemäß dem Protokoll des Herstellers und lagern Sie sie bei -20 °C, bis die qRT-PCR-Analyse durchgeführt wird.
   HINWEIS: Hier wurden 350 ng gereinigte RNA zur Synthese von cDNA unter Verwendung von 4 μl RT Mix (5x) in 20 μl verwendet.
9. Durchführung der qRT-PCR auf einem Real-Time-PCR-System in 96-Well-Platten und einzelnen 15-μl-Reaktionen (1x Syber Green Master Mix, 0,2 μM Forward- und Reverse-Primer und 4,5 μL 1:10 verdünnte cDNA).
   HINWEIS: Das PCR-Programm beginnt mit einem beheizten Deckel (105 °C), gefolgt von drei Schritten: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, gefolgt von 15 s bei 95 °C und 30 s bei 55 °C für 40 Zyklen.
10. Normalisieren Sie die Expressionsniveaus verschiedener Gene auf das Haushaltsgen GAPDH (oder andere Haushaltsgene wie β-Aktin).
11. Berechnen Sie die relative Genexpression mit der ^{2-ΔΔCt-Methode} , indem Sie die M0-Zellen, die auf Gewebekultur-Deckgläsern kultiviert wurden, als Referenz nehmen. Tabelle 2 listet alle in dieser Studie verwendeten Primer auf.

6. Statistische Analyse

1. Präsentieren Sie alle Daten als Mittelwert ± REM. Wiederholen Sie alle Assays (in dieser Studie wurden die Assays fünfmal wiederholt), um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Bewerten Sie die statistisch signifikanten Unterschiede zwischen normalverteilten Daten mit einer unidirektionalen Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von dem Tukey-Mehrfachtest.
2. Verwenden Sie den Friedman-Test und den Dunn-Mehrfachvergleichstest, um nicht-parametrische Datensätze zu analysieren. Verwenden Sie eine geeignete Datenanalysesoftware, um die Daten zu analysieren und definieren Sie die statistische Signifikanz als einen p-Wert von weniger als 0,05.

Ergebnisse

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen die erfolgreiche Differenzierung und Polarisation von MDMs auf Titanoberflächen, gefolgt von der Charakterisierung von M1- oder M2-polarisierten Makrophagen. Im ersten Schritt haben wir polarisierte MDMs mittels CLSM charakterisiert. Basierend auf unseren Vorstudien wurden CD209 und CCR7 als spezifische Marker zur Unterscheidung von M1 von M2 polarisierten MDMs verwendet. Wie in Abbildung 2A,B gezeigt, polarisierten MDMs ...

Diskussion

Ein gründliches Verständnis des Verhaltens von Makrophagen ist unerlässlich, um die immunmodulatorischen Eigenschaften implantierbarer Materialien zu verstehen. Mehrere Studien haben über heterogene Marker, eine Vielzahl von Zellmodellen und Protokolle zur Charakterisierung der Makrophagenpolarisation in vitro berichtet 17,18,19,20. Um die Reproduz...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate, not-treated	Corning Incorporated (Kennebunk, USA)	144530
Absorbance reader Infinite F50	TECAN Austria GmbH (Grödig, Austria)	TCAT91000001
Accutase in DPBS, 0.5 mM EDTA	EMD Millipore Corp. (Burlington, USA)	SCR005
Anti-Fade Fluorescence Mounting Medium -Aqueous, Fluoroshield	abcam (Cambridge, UK)	ab104135
Bio-Rad MJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cycler	Bio-Rad / MJ Research	7212
Bovine serum albumin (BSA)	VWR International bvba (Leuven, Belgium)	422361V
Centrifuge 5804 R	Eppendorf SE (Hamburg, Germany)	5804 R
DC-SIGN (D7F5C) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13193
Dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich Co. (St.Louis, MO, USA)	D2438-5X10ML
DRAQ5 Staining Solution	Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)	130-117-344
Ethanol ≥99.8% for molecularbiology	Carl Roth GmbH + CO. KG (Karlsruhe, Germany)	1HPH.1
Goat Anti-Mouse IgG (H&L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32723TR
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Cyanine3	Invitrogen	A10520
GraphPad Prism	GraphPad	Version  9.4.1
Human CCR7 Antibody	R&D Systems	MAB197
Human IFN-gamma Recombinant	Invitrogen (Rockford, USA)	RIFNG100
Human IL-13	Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)	5230901032
Human IL-4	Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)	130-095-373
Human M-CSF	Peprotech (Cranbury, USA)	300-25
Leica TCS SP5	Leica Microsystems CMS GmbH (Mannheim, Germany)	https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp5/
Lipopolysaccharides from Escherichia	Sigma Aldrich Co. (Missouri, USA)	L4391-1MG
Luna Universal qPCR Master Mix	New England Biolabs	NEB #M3003
LunaScript RT SuperMix Kit	New England Biolabs	E3010L
Lymphocyte Separation Medium 1077	PromoCell (Heidelberg, Germany)	C-44010
MCP-4/CCL13 Human ELISA Kit	Invitrogen	EHCCL13
MicroAmp Fast 96-Well Reaction Plate (0.1 mL)	Applied Biosystems (Waltham, USA)	4346907
MicroAmp Optical Adhesive Film	Life Technologies Corporation (Carlsbad, USA)	4311971
MicroAmp Splash Free 96-Well Base	Applied Biosystems (Waltham, USA)	4312063
Microlitercentrifuge CD-3124R	Phoenix Instrument (Germany)	9013111121
Microscope Cover Glasses, 10 mm	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	4HX4.1
Monocyte Attachment Medium	PromoCell (Heidelberg, Germany)	C-28051
Multiply-Pro Gefäß 0.5 mL, PP	Sarstedt AG & CO (Nümbrecht, Germany)	7,27,35,100
Nanodrop One	Thermo Scientific (USA)	ND-ONE-W
QuantStudio 3 System	Life Technologies GmbH (St. Leon-Rot, Germany)	A28567
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74007
RPMI 1640, 1x, with L-glutamine	Mediatech, Inc. (Manassas, USA)	10-040-CV
Sterile bench, LaminarAir HB 2472	Heraeus instruments (Hanau, Germany)	51012197
Tissue Culture Coverslips 13 mm (Plastic)	Sarstedt Inc. (Newton, USA)	83,18,40,002
Titanium machinied discs 12 cm	Medentis Medical (Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Germany)	N/A
TNF alpha Human ELISA Kit	Invitrogen	KHC3011
Trypan blue solution 0.4%	Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany)	1680.1