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여기에서는 현재 프로토콜의 신뢰성과 재현성을 개선하고 추가 연구를 촉진하는 것을 목표로 in vitro 임플란트 표면의 면역 조절 가능성을 평가하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 분비 사이토카인 프로파일, mRNA 발현 및 세포 표면 마커는 혈액 단핵구 유래 대식세포를 사용하여 모니터링하여 티타늄에서 배양된 대식세포 분극을 조사했습니다.
면역 매개 복합 치유 과정인 이물질 반응(FBR)은 임플란트를 신체에 통합하는 데 중요한 역할을 합니다. 대식세포는 면역 체계가 임플란트 표면과 상호 작용하는 첫 번째 라인으로, 염증-재생 균형을 조절하는 데 양방향 역할을 합니다. 임플란트 재료와 면역 반응 간의 반응에 대한 심층적인 이해와 평가를 위해서는 신뢰할 수 있는 체외 방법과 프로토콜이 매우 중요합니다. 다양한 in vitro 모델 중에서 1차 단핵구 유래 대식세포(MDM)는 대식세포-임플란트 상호 작용을 조사하기 위한 훌륭한 모델을 제시합니다. 우리는 임플란트 표면에서 MDM이 M1(고전적으로 활성화된) 및 M2(대안적으로 활성화된) 대식세포로 분극되는 것을 평가하기 위한 실험 프로토콜을 구현했습니다. 건강한 기증자로부터 혈액 단핵구를 분리하고 대식세포 집락자극인자(M-CSF)를 사용하여 대식세포로 분화시켰습니다. 분화된 대식세포를 임플란트 표면에서 배양하고 M1 및 M2 아형으로 편광시켰습니다. M1 분극은 인터페론(IFN)-γ 및 지질다당류(LPS)의 존재 하에서 달성되었으며, M2 분극은 인터류킨(IL)-4 및 IL-13을 함유한 배지에서 수행되었습니다. 분비된 사이토카인, 세포 표면 마커 및 발현 유전자 패널을 기반으로 ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay), CLSM(Confocal Laser scanning Microscopy) 및 qRT-PCR(quantitative real-time PCR)을 통해 대식세포 표현형을 평가했습니다. 추출된 RNA는 상보적 DNA(complementary DNA)로 형질전환하고, qRT-PCR을 사용하여 M1 및 M2 대식세포와 관련된 mRNA를 정량화했습니다. 이에 따라, M1 대식세포는 CD209 및 CCL13 수치가 높은 M2 대식세포에 비해 전염증성 종양괴사인자(TNF-α) 사이토카인 및 CCR7 표면 마커의 발현이 더 높은 특징이 있습니다. 결과적으로, CCR7 및 CD209는 CLSM에 의한 면역염색 및 시각화를 통해 M1 및 M2 대식세포 아형의 특이적이고 신뢰할 수 있는 마커로 확인되었습니다. ELISA가 M1에서 TNF-ɑ 수치 상승과 M2 세포에서 CCL13 증가를 감지하여 추가 확인을 달성했습니다. 제안된 마커 및 실험 설정은 임플란트의 면역 조절 가능성을 평가하는 데 효과적으로 사용할 수 있습니다.
이식형 생체 재료는 다양한 인간 질병에 대한 전통적인 솔루션이 되었으며 조직 공학, 약물 전달 시스템 및 임플란트를 포함한 생물 의학 연구에서 큰 역할을 합니다 1,2. 고관절 보철물, 스텐트, 메쉬, 심장 판막 또는 치과 임플란트와 같이 구조와 기능이 다른 다양한 재료로 만든 다양한 임플란트가 있습니다. 이식 시 조직-임플란트 접촉은 면역 반응을 유발하고 해결, 조직 리모델링 및 항상성이 뒤따릅니다. 이러한 공정은 사용되는 생체 재료의 물리적, 화학적, 생체 활성 특성의 영향을 받습니다. 이러한 특성은 전염증 및 항염증 반응의 강도와 스펙트럼, 섬유낭 형성, 조직 분해 및 치유 단계에 영향을 미칠 수 있습니다 3,4. 치유 과정과 장기적인 임플란트 통합을 지원하고 최적화하기 위해 현재 연구의 새로운 측면 중 하나는 임플란트 표면과 면역 세포 간의 상호 작용을 조사하고 중재하는 것입니다.
다른 면역 세포 중에서도 몸 전체에 존재하는 대식세포는 염증과 항병원성 방어, 치유 과정, 조직 항상성 유지에 중요한 역할을 합니다 5,6. 대식세포는 가소성과 국소 조직 미세환경 자극에 따라 뚜렷한 기능적 표현형으로 분극화할 수 있으며, 이는 세포 대사, 세포 기능 및 사이토카인 분비 프로필에서 큰 차이를 보입니다. 고전적으로 활성화된 M1 표현형은 IL-1β, IL-6, TNF-α와 같은 전염증성 사이토카인의 분비에 의해 구별될 수 있으며, 외상 및 외부 생체 물질에 대한 초기 및 만성 염증 반응에 관여합니다. 대조적으로, IL-4 및 IL-13과 같은 사이토카인에 의해 유발되는 활성화된 M2 대식세포는 염증 해소 및 조직 치유 촉진과 같은 특징적인 특징을 가지고 있습니다. M2 편광 대식세포는 CD206과 같은 세포 표면 마커의 발현과 IL-10 및 IL-4와 같은 사이토카인의 생성으로 식별할 수 있습니다7. 마찬가지로, 이미 편광된 대식세포는 새로운 미시환경에서 스스로를 재프로그래밍할 수 있습니다.
세포-생체 재료 상호 작용에 대한 많은 연구는 이식 가능한 생체 재료에 대한 면역학적 반응의 연쇄 반응 및 임플란트 관련 합병증의 치유와 관련된 프로세스를 조율하는 데 있어 대식세포의 중요성을 보여주었습니다 8,9,10. 최근 몇 년 동안 생체공학이 상당한 진전을 이루었지만, 임플란트가 대식세포 행동과 분극을 어떻게 조절하는지 이해하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다 11,12,13.
세포 배양에서 단핵구 유래 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 부착 M0 대식세포로 분화한 후 LPS 및 IFN-γ 또는 IL-4를 각각 사용하여 M1 또는 M2 표현형으로 유도 분극할 수 있습니다. 새로운 생체 재료 표본으로 in vitro 배양 후, M1 및 M2 대식 세포의 다양한 세포 표면 수용체와 사이토카인 프로파일을 활용하여 in vitro14,15 생체 재료의 면역 조절 가능성을 검출할 수 있습니다. 이 연구는 다양한 임플란트 표면에 대한 MDM의 분극을 조사하는 데 사용할 수 있는 체외 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 유전자 발현 분석, 현미경 기술 및 ELISA를 사용하여 생체 물질에 의해 조절되는 M1 및 M2 대식세포의 표현형 마커 및 특정 사이토카인 프로파일을 결정할 수 있습니다. 따라서 대식세포와 생체 물질 표면 간의 복잡한 상호 작용을 규명할 수 있으며 대식세포-생체 물질 상호 작용을 더 잘 이해하기 위한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 표준화된 in vitro 프로토콜은 실험 설정의 변동성을 최소화하여 실험 결과의 재현성, 신뢰성 및 비교 가능성을 보장합니다.
인간 말초 혈액은 튀빙겐 대학교 의학부 윤리 위원회에서 승인한 프로토콜(윤리적 승인: 286/2021 BO)에 따라 건강한 헌혈자로부터 얻었습니다. 인간 PBMC는 앞서 설명한 바와 같이 밀도 구배 원심분리(Density Gradient Centrifugation)를 사용하여 분리하였다16. 다음 프로토콜은 24mL의 혈액에서 분리된 PBMC에 대해 요약되어 있습니다. 프로토콜의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.
참고: 혈액량은 사용된 M0 대식세포의 수에 따라 조정해야 합니다.
24mL의 혈액에서 총 3,546± 910만 개의 PBMC를 얻어 1.97± 0.46만 M0 대식세포(n=5)를 얻었습니다. 모든 시약, 소모품 및 장치는 재료 표에 나열되어 있습니다. 버퍼는 표 1에 나열되어 있습니다.
1. 인간 혈액 단핵구와 대식세포의 분화
2. 티타늄 임플란트 표면에서 MDM의 배양 및 분극
참고: 분화 6일차에 M0 대식세포를 완전히 편광된 M1 또는 M2 대식세포를 얻기 위해 48시간 동안 다른 자극으로 생체 재료 표면에 파종했습니다. 검사된 각 표면에 대해 3개의 디스크를 사용하여 M0, M1 및 M2 대식세포를 파종했습니다. 세포 배양 처리된 플라스틱 커버슬립이 대조 표면으로 사용되었습니다.
3. ELISA를 사용한 편광 대식세포의 특성 분석
참고: 편광 2일차에 특성화 분석을 위해 샘플을 준비했습니다. TNF-ɑ 사이토카인 및 CCL13 케모카인을 측정하여 각각 M1 및 M2 편광 대식세포를 특성화했습니다. 분비된 단백질의 농도는 해당 상등액에서 분비된 단백질의 총 농도로 정규화되었습니다.
4. CLSM을 이용한 편광 대식세포의 특성화
참고: 편광된 대식세포는 CD209 및 CCR7 세포 표면 마커에 대한 항체로 염색하여 추가로 특성화되었습니다. 핵은 DRAQ5로 대조염색되었습니다. CD68 또는 다른 마커를 범대식세포 마커로 사용할 수 있습니다.
5. qRT-PCR을 사용한 편광 대식세포의 특성 분석
참고: RNA 분리를 위해 cDNA 합성을 위한 충분한 RNA를 얻기 위해 샘플당 두 개의 디스크를 사용했습니다.
6. 통계 분석
이 연구의 결과는 티타늄 표면에서 MDM의 성공적인 분화 및 분극화를 입증한 후 M1 또는 M2 편광 대식세포의 특성화를 보여줍니다. 첫 번째 단계에서는 CLSM을 사용하여 편광 MDM을 특성화했습니다. 예비 연구에 따르면 CD209 및 CCR7은 M1과 M2 편광 MDM을 구별하기 위한 특정 마커로 사용되었습니다. 그림 2A, B에서 볼 수 있듯이 MDM은 M1 및 M2 대식?...
대식세포 거동에 대한 철저한 이해는 이식 가능한 물질의 면역 조절 특성을 이해하는 데 필수적입니다. 여러 연구에서 이질적인 마커, 다양한 세포 모델 및 대식세포 분극을 특성화하기 위한 프로토콜이 in vitro 17,18,19,20에 보고되었습니다. 실험 결과의 재현성, 신뢰성 ...
저자는 공개할 내용이 없습니다.
디스크는 독일 Bad-Neuenahr-Ahrweiler에 위치한 Medentis Medical에서 친절하게 제공했습니다. 저자는 구강악안면외과(University Hospital Tuebingen)의 지원을 인정합니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
24-well plate, not-treated | Corning Incorporated (Kennebunk, USA) | 144530 | |
Absorbance reader Infinite F50 | TECAN Austria GmbH (Grödig, Austria) | TCAT91000001 | |
Accutase in DPBS, 0.5 mM EDTA | EMD Millipore Corp. (Burlington, USA) | SCR005 | |
Anti-Fade Fluorescence Mounting Medium -Aqueous, Fluoroshield | abcam (Cambridge, UK) | ab104135 | |
Bio-Rad MJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Bio-Rad / MJ Research | 7212 | |
Bovine serum albumin (BSA) | VWR International bvba (Leuven, Belgium) | 422361V | |
Centrifuge 5804 R | Eppendorf SE (Hamburg, Germany) | 5804 R | |
DC-SIGN (D7F5C) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13193 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich Co. (St.Louis, MO, USA) | D2438-5X10ML | |
DRAQ5 Staining Solution | Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-117-344 | |
Ethanol ≥99.8% for molecularbiology | Carl Roth GmbH + CO. KG (Karlsruhe, Germany) | 1HPH.1 | |
Goat Anti-Mouse IgG (H&L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723TR | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Cyanine3 | Invitrogen | A10520 | |
GraphPad Prism | GraphPad | Version 9.4.1 | |
Human CCR7 Antibody | R&D Systems | MAB197 | |
Human IFN-gamma Recombinant | Invitrogen (Rockford, USA) | RIFNG100 | |
Human IL-13 | Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 5230901032 | |
Human IL-4 | Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-095-373 | |
Human M-CSF | Peprotech (Cranbury, USA) | 300-25 | |
Leica TCS SP5 | Leica Microsystems CMS GmbH (Mannheim, Germany) | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp5/ | |
Lipopolysaccharides from Escherichia | Sigma Aldrich Co. (Missouri, USA) | L4391-1MG | |
Luna Universal qPCR Master Mix | New England Biolabs | NEB #M3003 | |
LunaScript RT SuperMix Kit | New England Biolabs | E3010L | |
Lymphocyte Separation Medium 1077 | PromoCell (Heidelberg, Germany) | C-44010 | |
MCP-4/CCL13 Human ELISA Kit | Invitrogen | EHCCL13 | |
MicroAmp Fast 96-Well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems (Waltham, USA) | 4346907 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Life Technologies Corporation (Carlsbad, USA) | 4311971 | |
MicroAmp Splash Free 96-Well Base | Applied Biosystems (Waltham, USA) | 4312063 | |
Microlitercentrifuge CD-3124R | Phoenix Instrument (Germany) | 9013111121 | |
Microscope Cover Glasses, 10 mm | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 4HX4.1 | |
Monocyte Attachment Medium | PromoCell (Heidelberg, Germany) | C-28051 | |
Multiply-Pro Gefäß 0.5 mL, PP | Sarstedt AG & CO (Nümbrecht, Germany) | 7,27,35,100 | |
Nanodrop One | Thermo Scientific (USA) | ND-ONE-W | |
QuantStudio 3 System | Life Technologies GmbH (St. Leon-Rot, Germany) | A28567 | |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74007 | |
RPMI 1640, 1x, with L-glutamine | Mediatech, Inc. (Manassas, USA) | 10-040-CV | |
Sterile bench, LaminarAir HB 2472 | Heraeus instruments (Hanau, Germany) | 51012197 | |
Tissue Culture Coverslips 13 mm (Plastic) | Sarstedt Inc. (Newton, USA) | 83,18,40,002 | |
Titanium machinied discs 12 cm | Medentis Medical (Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Germany) | N/A | |
TNF alpha Human ELISA Kit | Invitrogen | KHC3011 | |
Trypan blue solution 0.4% | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | 1680.1 |
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