Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להערכת הפוטנציאל החיסוני של משטחי שתלים במבחנה, במטרה לשפר את האמינות והשחזור של הפרוטוקולים הנוכחיים ולקדם מחקר נוסף. פרופילי ציטוקינים מפרישים, ביטוי mRNA וסמני פני התא נוטרו באמצעות מקרופאגים שמקורם במונוציטים בדם כדי לחקור קיטוב מקרופאגים המעובדים על טיטניום.

Abstract

תגובת גוף זר (FBR), תהליך ריפוי מורכב בתיווך מערכת החיסון, ממלאת תפקיד מכריע בשילוב שתלים בגוף. מקרופאגים, כקו הראשון של אינטראקציה של מערכת החיסון עם משטחי השתל, ממלאים תפקיד דו-כיווני בוויסות מאזן הדלקת-התחדשות. להבנה מעמיקה והערכה של התגובות בין חומרי השתל לתגובות החיסוניות, שיטות ופרוטוקולים אמינים במבחנה הם חיוניים. בין מודלים שונים במבחנה , מקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים (MDMs) מציגים מודל מצוין לחקירת אינטראקציות מקרופאגים-שתלים. יישמנו פרוטוקול ניסיוני להערכת הקיטוב של MDMs למקרופאגים M1 (מופעלים קלאסית) ו-M2 (מופעלים לחלופין) על משטחי השתל. בודדנו מונוציטים בדם מתורמים בריאים והבדלנו אותם למקרופאגים באמצעות גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF). מקרופאגים מובחנים תורבבו על משטחי השתל וקוטבו לתת-סוגים M1 ו-M2. קיטוב M1 הושג בנוכחות אינטרפרון (IFN)-γ וליפופוליסכריד (LPS), בעוד שקיטוב M2 בוצע במדיום המכיל אינטרלוקין (IL)-4 ו-IL-13. הערכנו פנוטיפים של מקרופאגים על ידי בדיקת אימונוסורבנט מקושרת לאנזים (ELISA), מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) ו-PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) על סמך פאנלים של ציטוקינים מופרשים, סמני פני התא וגנים מבוטאים. ה-RNA המופק הפך ל-DNA משלים (cDNA), ו-qRT-PCR שימש לכימות mRNA הקשור למקרופאגים M1 ו-M2. בהתאם לכך, מקרופאגים M1 אופיינו בביטוי גבוה יותר של ציטוקין גורם נמק גידול פרו-דלקתי (TNF-α) וסמן פני השטח CCR7 בהשוואה למקרופאגים M2, שהפגינו רמות גבוהות יותר של CD209 ו-CCL13. כתוצאה מכך, CCR7 ו-CD209 זוהו כסמנים ספציפיים ואמינים של תת-סוגים של מקרופאגים M1 ו-M2 על ידי צביעה חיסונית והדמיה על ידי CLSM. אישור נוסף הושג על ידי ELISA שזיהתה רמת TNF-ɑ מוגברת ב-M1 ועלייה ב-CCL13 בתאי M2. ניתן להשתמש ביעילות בסמנים המוצעים ובמערך הניסוי כדי להעריך את הפוטנציאל החיסוני של שתלים.

Introduction

ביו-חומרים מושתלים הפכו לפתרון קונבנציונלי למחלות אנושיות שונות וממלאים תפקיד גדול במחקר ביו-רפואי, כולל הנדסת רקמות, מערכות אספקת תרופות ושתלים 1,2. קיים מגוון רחב של שתלים העשויים מחומרים שונים בעלי מבנים ופונקציות שונות, כגון תותבות ירך, סטנטים, רשתות, מסתמי לב או שתלים דנטליים. עם ההשתלה, מגע הרקמה-שתל מעורר תגובה חיסונית, ואחריה רזולוציה, שיפוץ רקמות והומאוסטזיס. תהליכים אלה מושפעים מהמאפיינים הפיזיקליים, הכימיים והביו-אקטיביים של הביו-חומרים שבהם משתמשים. מאפיינים אלה עשויים להשפיע על העוצמה והספקטרום של תגובות פרו-דלקתיות ואנטי דלקתיות, היווצרות קפסולה פיברוטית, פירוק רקמות וריפוי שלב 3,4. על מנת לתמוך ולייעל את תהליך הריפוי ושילוב השתלים לטווח ארוך, היבט מתפתח אחד של המחקר הנוכחי הוא לחקור ולתווך את האינטראקציה בין משטחי השתל לתאי החיסון.

בין שאר תאי החיסון, מקרופאגים, הנמצאים בכל הגוף, הם שחקני מפתח בדלקת ובהגנה אנטי-פתוגנית, כמו גם בתהליכי ריפוי ושמירה על הומאוסטזיס רקמות 5,6. בהתבסס על הפלסטיות שלהם והגירויים המיקרו-סביבתיים של הרקמה המקומית, מקרופאגים מסוגלים לקטב לפנוטיפים פונקציונליים מובחנים, המציגים הבדלים גדולים בחילוף החומרים של התאים, בתפקודי התאים ובפרופילי הפרשת הציטוקינים. ניתן להבחין בפנוטיפ M1 המופעל באופן קלאסי על ידי הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון IL-1β, IL-6 ו-TNF-α, והוא מעורב בתגובה הדלקתית הראשונית והכרונית לטראומה וביו-חומרים זרים. לעומת זאת, לחלופין, למקרופאגים M2 מופעלים, המופעלים על ידי ציטוקינים כמו IL-4 ו-IL-13, יש מאפיינים אופייניים כמו רזולוציה של דלקת וקידום ריפוי רקמות. ניתן לזהות מקרופאגים מקוטבים M2 על ידי ביטוי של סמני פני התא כגון CD206 וייצור ציטוקינים כמו IL-10 ו-IL-47. באופן דומה, מקרופאגים שכבר היו מקוטבים יכולים לתכנת את עצמם מחדש במיקרו-סביבה חדשה.

מחקרים רבים על אינטראקציות תא-ביו-חומרים הראו את חשיבותם של מקרופאגים במפל התגובות האימונולוגיות כלפי ביו-חומרים מושתלים ובתזמור תהליכים המעורבים בריפוי סיבוכים הקשורים לשתלים 8,9,10. למרות שההנדסה הביו-רפואית עשתה התקדמות משמעותית בשנים האחרונות, יש צורך במחקר נוסף כדי להבין כיצד שתלים מווסתים את התנהגות המקרופאגים ואת הקיטוב 11,12,13.

בתרבית תאים, ניתן להתמיין לתאים חד-גרעיניים בדם היקפי שמקורם במונוציטים למקרופאגים M0 דבקים ואחריהם קיטוב מושרה כלפי פנוטיפים M1 או M2 באמצעות LPS ו-IFN-γ או IL-4, בהתאמה. לאחר דגירה במבחנה עם דגימות ביו-חומרים חדשות, ניתן לנצל את הקולטנים השונים של פני התא ופרופילי הציטוקינים של מקרופאגים M1 ו-M2 כדי לזהות את הפוטנציאל האימונומודולטורי של ביו-חומרים במבחנה14,15. מחקר זה נועד לפתח פרוטוקול מבחנה שניתן להשתמש בו כדי לחקור את הקיטוב של MDMs בתגובה למשטחי שתלים שונים. ניתן להשתמש בניתוחי ביטוי גנים, טכניקות מיקרוסקופיה ו-ELISA כדי לקבוע את הסמנים הפנוטיפיים ופרופילי הציטוקינים הספציפיים של מקרופאגים M1 ו-M2 המווסתים על ידי החומר הביולוגי. לפיכך, ניתן להבהיר את האינטראקציות המורכבות בין מקרופאגים למשטחי ביו-חומר, וניתן לקבל מידע רב ערך כדי להבין טוב יותר אינטראקציות מקרופאגים-ביו-חומרים. לבסוף, פרוטוקול מבחנה סטנדרטי מבטיח שחזור, אמינות והשוואה של תוצאות הניסוי על ידי מזעור השונות במערך הניסוי.

Protocol

דם היקפי אנושי התקבל מתורמי דם בריאים בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה באוניברסיטת טובינגן (אישור אתי: 286/2021 BO). PBMCs אנושיים בודדו באמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות, כפי שתואר קודם לכן16. הפרוטוקול הבא מתואר עבור PBMCs שבודדו מ-24 מ"ל דם. ייצוג סכמטי של הפרוטוקול מוצג באיור 1.

הערה: יש לכוונן את נפח הדם בהתאם למספר המקרופאגים M0 המשמשים.

בסך הכל התקבלו 35.46 ±-9.1 מיליון PBMCs מ-24 מ"ל דם, וכתוצאה מכך 1.97 ±-0.46 מיליון מקרופאגים M0 (n = 5). כל הריאגנטים, החומרים המתכלים וההתקנים מפורטים בטבלת החומרים. המאגרים מפורטים בטבלה 1.

1. התמיינות של מונוציטים בדם אנושי למקרופאגים

  1. השעו מחדש את ה-PBMCs המבודדים ב-15 מ"ל של מדיום חיבור מונוציטים מחומם מראש והעבירו אותם לבקבוק תרבית תאים T75 אחד.
  2. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 90 דקות כדי לאפשר הידבקות.
  3. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את התאים פעם אחת עם מדיום שלם שחומם מראש עם הטיה עדינה להסרת תאים שאינם נדבקים או דבוקים באופן רופף.
    הערה: התאים המחוברים הם מונוציטים, המהווים כ-10% מסך ה-PBMCs שנוספו במקור לבקבוק.
  4. יש להוסיף 15 מ"ל של מדיום שלם המכיל 10 ננוגרם/מ"ל גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) לתאים הדבקים ולדגור במשך 6 ימים כדי לקדם התמיינות.
  5. החלף את המדיום במדיום טרי ושלם המכיל 10 ננוגרם/מ"ל M-CSF כל יומיים.

2. טיפוח וקיטוב של MDMs על פני שתל הטיטניום

הערה: ביום השישי של ההתמיינות, מקרופאגים M0 נזרעו על משטחי הביו-חומר עם גירויים שונים במשך 48 שעות כדי להשיג מקרופאגים M1 או M2 מקוטבים לחלוטין. עבור כל משטח שנבדק, נעשה שימוש בשלושה דיסקים כדי לזרוע מקרופאגים M0, M1 ו-M2. כיסויי פלסטיק שטופלו בתרבית תאים שימשו כמשטחי בקרה.

  1. הסר את מדיום התרבות מצלוחיות T75 ושטוף את התאים עם 10 מ"ל PBS למשך 5 דקות.
  2. נתק תאים דבקים על ידי דגירה שלהם עם 10 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים מחוממת מראש למשך 30 דקות.
  3. הקש בעדינות על התאים והעביר אותם לצינור של 50 מ"ל. נתק את התאים הנותרים על ידי גירוד עדין ב -10 מ"ל PBS.
  4. העבירו את התאים המנותקים לצינור של 50 מ"ל וצנטריפוגה אותם בטמפרטורה של 300 x גרם למשך 10 דקות.
  5. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-5 מ"ל של מדיום שלם שחומם מראש.
  6. ספרו את התאים באמצעות צביעה כחולה טריפן והמוציטומטר כדי לקבוע את מספר התאים ואת כדאיותם.
  7. הכן את תרחיף התאים על ידי התאמת מספר התא ל -160,000 תאים לכל 1 מ"ל של מדיום שלם.
  8. נקה את דיסקי הביו-חומר באופן קולי ב-70% אתנול למשך 5 דקות, ולאחר מכן עיקור ב-70% אתנול למשך 30 דקות.
  9. יבש את דיסקי הטיטניום למשך 1-2 שעות, ואז הניח אותם בצלחות 24 בארות לא מטופלות והוסף 1 מ"ל של תרחיף תאים מוכן לכל באר.
  10. כדי להשיג מקרופאגים מקוטבים M1, הוסף IFN-γ ו-LPS בריכוז של 50 ננוגרם/מ"ל ו-10 ננוגרם/מ"ל, בהתאמה. לקיטוב M2, הוסף IL-4 ו-IL-13 בריכוז של 20 ננוגרם/מ"ל כל אחד. ודא שתאי M0 גדלים ללא חומרי קיטוב. דגרו על התאים למשך 48 שעות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 כדי לגרום לקיטוב.

3. אפיון מקרופאגים מקוטבים באמצעות ELISA

הערה: ביום השני של הקיטוב, הוכנו דגימות לניתוחי אפיון. ציטוקין TNF-ɑ וכימוקין CCL13 נמדדו כדי לאפיין מקרופאגים מקוטבים M1 ו-M2, בהתאמה. ריכוז החלבונים המופרשים נורמל לריכוז הכולל של חלבונים מופרשים בסופרנטנט המתאים.

  1. אוספים את הסופרנטנט בצינור של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש.
  2. העבירו את הדיסקים לצלחת חדשה של 24 בארות לניסויים נוספים. המטרה היא לחסל תאים מתים או מחוברים באופן רופף בצלחות 24 בארות שאינן מטופלות.
    הערה: יש לאמת את כדאיות התא על פני משטחים לפני ביצוע ניתוח כלשהו. ניתן לקבוע את הכדאיות של תאים על ידי מבחני כדאיות של תאים חיים/מתים או בעקיפין באמצעות בדיקות התפשטות תאים וציטוטוקסיות.
  3. מדוד את הציטוקינים והכימוקינים על פי ההוראות הספציפיות שסופקו על ידי היצרן. מדוד את הציטוקינים באופן מיידי או אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למדידה עתידית.
    הערה: עבור כל סוג של ערכה (בהתחשב במגבלות הרגישות והזיהוי של ערכת ELISA), יש לקבוע דילול דגימה מתאים. עבור בדיקת חומצה ביסינצ'ונינית (BCA), הדגימות דוללו ביחס של 1:5. דגימות M1 עבור TNF-ɑ דוללו ב-1:10, ודגימות M2 עבור CCL13 דוללו ב-1:12.
  4. חשב את ריכוז הציטוקינים/כימוקינים המופרשים באמצעות העקומה הסטנדרטית בהתאם להוראות היצרן.
  5. מדוד את כמות החלבון הכוללת באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA.
  6. לנרמל את ריכוז החלבונים המופרשים למ"ג חלבון כולל.

4. אפיון מקרופאגים מקוטבים באמצעות CLSM

הערה: מקרופאגים מקוטבים אופיינו עוד יותר על ידי צביעתם בנוגדנים לסמני פני השטח של תאי CD209 ו-CCR7. הגרעינים הוכתמו ב-DRAQ5. CD68 או סמנים אחרים יכולים לשמש כסמני פאן-מקרופאגים.

  1. שוטפים את התאים פי 2 ב 800 מיקרוליטר של PBS. דגרו את הדיסקים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ב-400 מיקרוליטר של מאגר קיבוע.
  2. לאחר הסרת מאגר הקיבוע, יש לשטוף שלוש פעמים ב -400 מיקרוליטר PBS. מכתים את הדגימות מיד או מאחסנים ב-4 מעלות צלזיוס ב-1 מ"ל של מאגר אחסון.
    הערה: עם פרוטוקול קיבוע ואחסון זה, הדגימות הוכתמו בהצלחה וצולמו תוך 1-6 שבועות מרגע הקיבוע.
  3. לפני השלב הבא, שטפו את הדיסקים פעמיים עם 800 מיקרוליטר PBS לאחר האחסון.
  4. דגירה של דיסקים עם 400 מיקרוליטר של מאגר חוסם למשך 30 דקות ב-RT כדי לחסום את אתרי הקישור הלא ספציפיים.
  5. השליכו את המאגר החוסם ודגרו את הדיסקים ב-RT למשך שעה אחת עם נוגדנים ראשוניים מדוללים ב-400 מיקרוליטר של מאגר מכתים.
    1. בצע הליך אימונופלואורסצנטי באמצעות צביעה כפולה כדי לבחון את הביטוי של CCR7 ו-CD209 בדגימה אחת. לשם כך יש לשלב נוגדנים ראשוניים הגדלים ממינים שונים (עכבר וארנב) באותו שלב צביעה.
      הערה: כדי להשיג אות חזק עם רקע מינימלי, מטב את ריכוז הנוגדנים. נוגדן CCR7 שימש בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל, ונוגדני CD209 דולל ב-1/400.
  6. הסר את הנוגדנים העיקריים ושטוף פי 3 עם 400 מיקרוליטר של מאגר כביסה.
  7. הוסף נוגדנים משניים עם תווית פלואורופור מדולל במאגר צביעה ודגירה למשך שעה ב-RT בחושך.
    הערה: יש לייעל את ריכוז הנוגדנים המשניים כדי להשיג אותות ספציפיים מקסימליים עם רקע מינימלי. במחקר זה נעשה שימוש בנוגדנים משניים בריכוז של 5 מיקרוגרם/מ"ל לצביעה.
  8. לאחר הסרת הסופרנטנט, שטפו את הדגימות שלוש פעמים במאגר הכביסה למשך 3 דקות כל אחת.
  9. הוסף 10 μM DRAQ5 ב-PBS ודגירה למשך 15 דקות ב-RT, מוגן מפני אור.
  10. הסר את ה-supernatant ושטוף את הדיסקים פעם אחת ב-PBS.
  11. הסר את ה-PBS הנותר והוסף טיפה אחת של אמצעי הרכבה.
  12. לאחר 5 דקות יש למרוח את כוסות הכיסוי ולתת לדגימות להתייבש למשך שעה.
  13. לאחר ייבוש הדגימות, אטמו את הקצוות עם לק שקוף ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך עד להדמיה.
  14. כדי לקבל סקירה כללית של תאים, דמיין את הדגימות בהגדלה של פי 25. כדי לקבוע עוד יותר את המבנה והלוקליזציה של סמני פני השטח, רכוש תמונות בהגדלה של פי 63.
  15. כמת את עוצמת הקרינה של CCR7 ו-CD209 באמצעות תוכנת ImageJ.
    הערה: רכישת התמונה בוצעה עם מכפיל פוטו (PMT) באמצעות מערכת CLSM, שהייתה מצוידת בלייזר ארגון (488 ננומטר), לייזר DPSS (561 ננומטר) ולייזר HeNe (633 ננומטר).

5. אפיון מקרופאגים מקוטבים באמצעות qRT-PCR

הערה: לבידוד RNA, נעשה שימוש בשני דיסקים לכל דגימה על מנת להשיג מספיק RNA לסינתזת cDNA.

  1. שטפו את הדיסקים פעמיים עם 800 מיקרוליטר PBS.
  2. הוסף 350 מיקרוליטר של מאגר ליזה לדיסק הראשון ולייז את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
  3. העבירו את הליזאט לדיסק השני וחזרו על תהליך הליזינג.
  4. הוסף 350 מיקרוליטר של 70% אתנול לליזאט ופיפטה למעלה ולמטה עד לקבלת תערובת אחידה.
  5. העבר את הליזט לעמודת הסיבוב ופעל לפי הוראות היצרן לבידוד RNA.
  6. כמת את כמות ה-RNA באמצעות ננו-טיפה או מכשיר אחר.
  7. לנרמל את ריכוזי ה-RNA עבור דגימות שונות ולסנתז cDNA לפי הוראות היצרן באמצעות מערכת RT-PCR לסינתזת cDNA של גדיל ראשון.
  8. סנתז את ה-cDNA באמצעות 350 ננוגרם של RNA בהתאם לפרוטוקול היצרן ואחסן אותו ב-20 מעלות צלזיוס עד לביצוע ניתוח qRT-PCR.
    הערה: כאן, 350 ננוגרם של RNA מטוהר שימש לסינתזה של cDNA באמצעות 4 מיקרוליטר של RT Mix (5x) ב-20 מיקרוליטר.
  9. בצע qRT-PCR במערכת PCR בזמן אמת בלוחות של 96 בארות ותגובות בודדות של 15 מיקרוליטר (1x תערובת מאסטר ירוקה של Syber, 0.2 מיקרומטר של פריימרים קדימה ואחורה, ו-4.5 מיקרוליטר של cDNA מדולל 1:10).
    הערה: תוכנית ה-PCR מתחילה במכסה מחומם (105 מעלות צלזיוס) ואחריו שלושה שלבים: דנטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ואחריה 15 שניות ב-95 מעלות צלזיוס, ו-30 שניות ב-55 מעלות צלזיוס למשך 40 מחזורים.
  10. לנרמל את רמות הביטוי של גנים שונים לגן משק הבית GAPDH (או גנים אחרים של משק בית כמו β-אקטין).
  11. חשב את ביטוי הגנים היחסי בשיטת 2−ΔΔCt על ידי לקיחת תאי M0 שגודלו על כיסויי תרבית רקמה כהפניה. טבלה 2 מפרטת את כל הפריימרים ששימשו במחקר זה.

6. ניתוח סטטיסטי

  1. הצג את כל הנתונים כממוצע ± SEM. חזור על כל הבדיקות (במחקר זה, הבדיקות חזרו על עצמן חמש פעמים) כדי להבטיח שחזור. העריכו את ההבדלים המובהקים סטטיסטית בין נתונים המופצים בדרך כלל באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) ואחריו מבחן הריבוי של טוקי.
  2. השתמש במבחן פרידמן ובמבחן ההשוואה המרובה של דאן כדי לנתח מערכי נתונים לא פרמטריים. השתמש בתוכנת ניתוח נתונים מתאימה כדי לנתח את הנתונים ולהגדיר מובהקות סטטיסטית כערך p של פחות מ-0.05.

תוצאות

תוצאות מחקר זה מדגימות התמיינות וקיטוב מוצלחים של MDMs על משטחי טיטניום, ואחריהם אפיון של מקרופאגים מקוטבים M1 או M2. בשלב הראשון, אפיינו MDMs מקוטבים באמצעות CLSM. בהתבסס על המחקרים הראשוניים שלנו, CD209 ו-CCR7 שימשו כסמנים ספציפיים להבדיל בין M1 ל-MDM מקוטב M2. כפי שמוצג באיו...

Discussion

הבנה מעמיקה של התנהגות המקרופאגים חיונית להבנת התכונות האימונומודולטוריות של חומרים מושתלים. מספר מחקרים דיווחו על סמנים הטרוגניים, מגוון מודלים של תאים ופרוטוקולים לאפיון קיטוב מקרופאגים במבחנה 17,18,19,20.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

הדיסקים סופקו באדיבות על ידי Medentis Medical, Bad-Neuenahr-Ahrweiler, גרמניה. המחברים מודים על התמיכה של המחלקה לכירורגיית פה ולסתות (בית החולים האוניברסיטאי טובינגן).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well plate, not-treatedCorning Incorporated (Kennebunk, USA) 144530
Absorbance reader Infinite F50 TECAN Austria GmbH (Grödig, Austria)TCAT91000001
Accutase in DPBS, 0.5 mM EDTAEMD Millipore Corp. (Burlington, USA)SCR005
Anti-Fade Fluorescence Mounting Medium -Aqueous, Fluoroshieldabcam (Cambridge, UK)ab104135
Bio-Rad MJ Research PTC-200 Peltier Thermal CyclerBio-Rad / MJ Research7212
Bovine serum albumin (BSA)VWR International bvba (Leuven, Belgium)422361V
Centrifuge 5804 REppendorf SE (Hamburg, Germany)5804 R
DC-SIGN (D7F5C) XP Rabbit mAbCell Signaling Technology13193
Dimethyl sulfoxideSigma Aldrich Co. (St.Louis, MO, USA)D2438-5X10ML
DRAQ5 Staining SolutionMilteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)130-117-344
Ethanol ≥99.8% for molecularbiologyCarl Roth GmbH + CO. KG (Karlsruhe, Germany)1HPH.1
Goat Anti-Mouse IgG (H&L) Highly Cross-Adsorbed
Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488		InvitrogenA32723TR
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Cyanine3InvitrogenA10520
GraphPad PrismGraphPadVersion  9.4.1
Human CCR7 AntibodyR&D SystemsMAB197
Human IFN-gamma RecombinantInvitrogen (Rockford, USA)RIFNG100
Human IL-13Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)5230901032
Human IL-4Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)130-095-373
Human M-CSFPeprotech (Cranbury, USA)300-25
Leica TCS SP5Leica Microsystems CMS GmbH (Mannheim, Germany)https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp5/
Lipopolysaccharides from EscherichiaSigma Aldrich Co. (Missouri, USA)L4391-1MG
Luna Universal qPCR Master Mix New England BiolabsNEB #M3003
LunaScript RT SuperMix KitNew England BiolabsE3010L
Lymphocyte Separation Medium 1077PromoCell (Heidelberg, Germany)C-44010
MCP-4/CCL13 Human ELISA KitInvitrogenEHCCL13
MicroAmp Fast 96-Well Reaction Plate (0.1 mL)Applied Biosystems (Waltham, USA)4346907
MicroAmp Optical Adhesive FilmLife Technologies Corporation (Carlsbad, USA)4311971
MicroAmp Splash Free 96-Well BaseApplied Biosystems (Waltham, USA)4312063
Microlitercentrifuge CD-3124RPhoenix Instrument (Germany)9013111121
Microscope Cover Glasses, 10 mmCarl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany4HX4.1
Monocyte Attachment MediumPromoCell (Heidelberg, Germany)C-28051
Multiply-Pro Gefäß 0.5 mL, PPSarstedt AG & CO (Nümbrecht, Germany)7,27,35,100
Nanodrop OneThermo Scientific (USA)ND-ONE-W
QuantStudio 3 SystemLife Technologies GmbH (St. Leon-Rot, Germany)A28567
RNeasy Micro KitQiagen74007
RPMI 1640, 1x, with L-glutamineMediatech, Inc. (Manassas, USA)10-040-CV
Sterile bench, LaminarAir HB 2472 Heraeus instruments (Hanau, Germany)51012197
Tissue Culture Coverslips 13 mm (Plastic)Sarstedt Inc. (Newton, USA)83,18,40,002
Titanium machinied discs 12 cm Medentis Medical (Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Germany)N/A
TNF alpha Human ELISA KitInvitrogenKHC3011
Trypan blue solution 0.4%Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany)1680.1

References

  1. Othman, Z., Pastor, B. C., van Rijt, S., Habibovic, P. Understanding interactions between biomaterials and biological systems using proteomics. Biomaterials. 167, 191-204 (2018).
  2. Ikada, Y. Challenges in tissue engineering. J R Soc Interface. 3 (10), 589-601 (2006).
  3. Aamodt, J. M., Grainger, D. W. Extracellular matrix-based biomaterial scaffolds and the host response. Biomaterials. 86, 68-82 (2016).
  4. Batool, F., et al. Modulation of immune-inflammatory responses through surface modifications of biomaterials to promote bone healing and regeneration. J Tissue Eng. 12, 20417314211041428 (2021).
  5. Mantovani, A., Biswas, S. K., Galdiero, M. R., Sica, A., Locati, M. Macrophage plasticity and polarization in tissue repair and remodelling. J Pathol. 229 (2), 176-185 (2013).
  6. Shrivastava, R., Shukla, N. Attributes of alternatively activated (M2) macrophages. Life Sci. 224, 222-231 (2019).
  7. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol. 5 (12), 953-964 (2005).
  8. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
  9. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  10. Kzhyshkowska, J., et al. Macrophage responses to implants: prospects for personalized medicine. J Leukoc Biol. 98 (6), 953-962 (2015).
  11. Browne, S., Pandit, A. Biomaterial-mediated modification of the local inflammatory environment. Front Bioeng Biotechnol. 3, 67 (2015).
  12. Piatnitskaia, S., et al. Modelling of macrophage responses to biomaterials in vitro: state-of-the-art and the need for the improvement. Front Immunol. 15, 1349461 (2024).
  13. Rayahin, J. E., Gemeinhart, R. A. Activation of macrophages in response to biomaterials. Results Probl Cell Differ. 62, 317-351 (2017).
  14. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  15. Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biol. 15 (1), 53 (2017).
  16. Salma Iqbal, A. K. Characterization of in vitro generated human polarized macrophages. J Clin Cell Immunol. 6, 1-8 (2015).
  17. Hotchkiss, K. M., et al. Titanium surface characteristics, including topography and wettability, alter macrophage activation. Acta Biomater. 31, 425-434 (2016).
  18. Wang, Y., Zhang, Y., Sculean, A., Bosshardt, D. D., Miron, R. J. Macrophage behavior and interplay with gingival fibroblasts cultured on six commercially available titanium, zirconium, and titanium-zirconium dental implants. Clin Oral Investig. 23 (8), 3219-3227 (2019).
  19. Abaricia, J. O., Shah, A. H., Ruzga, M. N., Olivares-Navarrete, R. Surface characteristics on commercial dental implants differentially activate macrophages in vitro and in vivo. Clin Oral Implants Res. 32 (4), 487-497 (2021).
  20. Lu, W., et al. Improved osseointegration of strontium-modified titanium implants by regulating angiogenesis and macrophage polarization. Biomater Sci. 10 (9), 2198-2214 (2022).
  21. Murray, P. J., Wynn, T. A. Obstacles and opportunities for understanding macrophage polarization. J Leukoc Biol. 89 (4), 557-563 (2011).
  22. Nascimento, C. R., Fernandes, N. A. R., Maldonado, L. A. G., Junior, C. R. Comparison of monocytic cell lines U937 and THP-1 as macrophage models for in vitro studies. Biochem Biophys Rep. 32, 101383 (2022).
  23. Freytes, D. O., Kang, J. W., Marcos-Campos, I., Vunjak-Novakovic, G. Macrophages modulate the viability and growth of human mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 114 (1), 220-229 (2013).
  24. Zhang, Y., et al. Macrophage type modulates osteogenic differentiation of adipose tissue MSCs. Cell Tissue Res. 369 (2), 273-286 (2017).
  25. Cerqueira, A., et al. Evaluation of the inflammatory responses to sol-gel coatings with distinct biocompatibility levels. J Biomed Mater Res A. 109 (9), 1539-1548 (2021).
  26. Zhang, Y., Cheng, X., Jansen, J. A., Yang, F., van den Beucken, J. J. Titanium surfaces characteristics modulate macrophage polarization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 95, 143-151 (2019).
  27. Nobs, S. P., Kopf, M. Tissue-resident macrophages: guardians of organ homeostasis. Trends Immunol. 42 (6), 495-507 (2021).
  28. Sreejit, G., Fleetwood, A., Murphy, A., Nagareddy, P. Origins and diversity of macrophages in health and disease. Clin Transl Immunology. 9 (12), e1222 (2020).
  29. Parisi, L., et al. Preparation of human primary macrophages to study the polarization from monocyte-derived macrophages to pro-or anti-inflammatory macrophages at biomaterial interface in vitro. J Dent Sci. 18 (4), 1630-1637 (2023).
  30. Feuerer, N., et al. Macrophage retrieval from 3D biomaterials: A detailed comparison of common dissociation methods. J Immunol Regen Med. 11, 100035 (2021).
  31. Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. J Cell Physiol. 233 (9), 6425-6440 (2018).
  32. Sridharan, R., Cameron, A. R., Kelly, D. J., Kearney, C. J., O'Brien, F. J. Biomaterial based modulation of macrophage polarization: a review and suggested design principles. Mater Today. 18 (6), 313-325 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

M1M2ELISACLSMPCR qRT PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved