A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
توفر زراعة أعضاء قرنية الخنازير خارج الجسم الحي والتئام الجروح الظهارية وسيلة اقتصادية وأخلاقية وقابلة للتكرار وكمية لاختبار سمية العين للمواد الكيميائية. كما أنها تساعد في توضيح الآليات الكامنة وراء تنظيم الظهارة وإصلاح الأنسجة ، وفي تقييم العلاجات لعلاج اعتلال القرنية السكري وتأخر التئام الجروح.
نظرا لأوجه التشابه التشريحية والفسيولوجية مع العين البشرية ، تعمل عين الخنازير كنموذج قوي للأبحاث الطبية الحيوية وتقييم سمية العين. تم تطوير نظام زراعة القرنية الهوائية / السائلة باستخدام عيون الخنازير ، وتم استخدام التئام الجروح الظهارية خارج الجسم الحي كمعيار حاسم لهذه الدراسات. تمت معالجة قرنيات الخنازير الطازجة لزراعة الأعضاء ، مع أو بدون جرح ظهاري. تم استزراع القرنيات في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية في MEM ، مع أو بدون عوامل اختبار. تم قياس نفاذية القرنية ومعدلات التئام الجروح ، ويمكن معالجة الخلايا الظهارية و / أو القرنيات الكاملة للكيمياء المناعية ، والنشاف الغربي ، و qPCR للتحليلات الجزيئية والخلوية. تصف هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا وتقدم دراستين باستخدام نظام ex vivo هذا. تظهر البيانات أن زراعة أعضاء قرنية الخنازير ، جنبا إلى جنب مع التئام الجروح الظهارية ، هي نموذج مناسب خارج الجسم الحي لاختبار السمية الكيميائية ، ودراسة اعتلال القرنية السكري ، وتحديد العلاجات المحتملة.
في حين أن نماذج الخلايا تمتلك مجموعات نسيلة محدودة وتفشل في إعادة إنتاج بنية الكائن الحي في الجسم الحي ، فإن زراعة الأعضاء أو الزرع تقدم رؤى حول وظيفة الأعضاء وتطورها وآليات المرض والعلاجات المحتملة مع توفير مزايا أخلاقية وفسيولوجية مقارنة بالنماذج التجريبية الأخرى1،2. بالإضافة إلى تقليل عدد المطلوبة ، فإن زراعة النباتات تتحكم في الظروف المحيطة وتتعامل معها بشكل معقول ، وهو أمر مثالي لاستكشاف مفصل للعوامل التي تتحكم في تكاثر الخلايا ، والهجرة ، واستجابة الجرح ، والتمايز الخلوي في بيئة زراعة الأعضاء2،3. من بين الأنسجة / الأعضاء المختلفة ، تم استخدام مستخلصات القرنية ، بما في ذلك تلك الخاصة بالبشر4،5،6 ، على نطاق واسع لسمية العين ، وتقييمات التهيج7،8 ، لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء وظيفة الخلايا الجذعية9 والتئام الجروح10،11 ، والجلوكوما الأولية ذات الزاويةالمفتوحة 12.
تشترك قرنيات الخنازير في العديد من أوجه التشابه الهيكلية والفسيولوجية مع القرنيات البشرية ، مما يجعلها نموذجا ممتازا لدراسة بيولوجيا القرنية البشرية وأمراضها. من الناحية الهيكلية ، يحتوي كلاهما على طبقة بومان ، و 5-7 طبقات من الخلايا الظهارية ، وانحناء وقطر مماثلين. من الناحية الفسيولوجية ، فهي شفافة للغاية ، ولها تركيبة غشاء دموع متشابهة وترطيب القرنية ، وتظهر أنماطا ووظائف مماثلة لتعصيب القرنية ، وتتبع عمليات التئام الجروح المماثلة ، مما يجعلها نموذجا ممتازا لدراسة بيولوجيا القرنية البشرية وأمراضها13،14. في حين أن القرنيات البشرية والخنازير لديها اختلافات طفيفة في ترتيب ألياف الكولاجين ومحتوى الماء ، فإن إشاراتها واستجاباتها المناعية ليست متطابقة. تشكل هذه الاختلافات تحديات لزرع الأعضاء15. ومن ثم ، يجب مراعاة الاختلافات الخاصة بالأنواع أثناء تفسير البيانات التجريبية.
بالمقارنة مع القرنيات البشرية ، فإن عيون الخنازير متاحة بسهولة كمنتجات ثانوية لصناعة اللحوم ، مما يجعلها فعالة من حيث التكلفة ويمكن الوصول إليها بسهولة للبحث14. يساعد استخدام قرنيات الخنازير في تقليل الحاجة إلى قرنيات المتبرعين البشريين ويقلل من المخاوف الأخلاقية المرتبطة بالتجارب على. علاوة على ذلك ، فإن توافر العديد من قرنيات الخنازير في وقت واحد يسمح بإجراء تجارب متسقة وقابلة للتكرار ، وهو أمر بالغ الأهمية لنتائج البحث الموثوقة.
تم استخدام نظام زراعة أعضاء قرنية الخنازير في البداية لاستبدال الاختبارات على للمواد الكيميائية التجميلية وأدوية العين7. تم استخدام هذا النظام لدراسة التئام الجروح الظهارية للقرنية وتحديد العديد من مسارات الإشارة المهمة مثل تساقط المجال الخارجي HB-EGF ، وتحفيز حمض الليزوفوسفاتيديك الوسيط الدهني ، وتنشيط EGFR لالتئام جروح القرنية16،17. باستخدام ارتفاع الجلوكوز كعامل مرضي ، تم إنشاء نموذج خارج الجسم الحي لارتفاع السكر في الدم مع تأخر التئام الجروح الظهارية لتقليد اعتلال القرنية السكري البشري. باستخدام هذا النموذج ، تبين أن تعبيرات التوازن ل IL-1β مقابل IL-1Ra18 و TGFβ3 مقابل TGFβ119 هي عوامل مهمة للتئام الجروح بشكل صحيح في القرنيات ، ويمكن استخدام التلاعب بهذه الموازين لعلاج اعتلال القرنية السكري. ومن ثم ، فإن زراعة أعضاء الخنازير تمثل نظاما تجريبيا ذا صلة واقتصاديا ومعالجا مع تطبيقات مختلفة في اختبارات السمية الكيميائية ، والبحوث الطبية الحيوية ، واكتشاف الأدوية ، وتقييم تلف الأنسجة وإصلاحها استجابة لتعرض العين للأسلحة الكيميائية.
في هذه المقالة ، يتم وصف بروتوكول مفصل لزراعة أعضاء قرنية الخنازير ، وتطبيقاته لتقييم الآثار المحتملة لقطرات العين غير الستيروئيدية (NS) على صحة القرنية ولتحديد مسارات الإشارات والعمليات البيولوجية المشاركة في التسبب في اعتلال القرنية السكري.
نظرا لأن قرنيات الخنازير الطازجة هي منتج ثانوي لصناعة الأغذية ، لم تكن اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها بحاجة إلى الموافقة على استخدامها في البحث. على عكس القرنيات البشرية المستخدمة في البحث ، لا توجد مخاوف من المخاطر البيولوجية ، ويمكن التخلص من الأجزاء غير المستخدمة من عيون الخنازير كقمامة عادية. الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.
1. التحضير لثقافة الأعضاء
2. تحضير مقلة عين الخنازير لثقافة القرنية
3. جرح الظهارة
4. ثقافة أعضاء القرنية ونمذجة ارتفاع السكر في الدم خارج الجسم الحي
5. تقييم وظيفة القرنية
تعد جراحة الساد واحدة من أكثر الإجراءات التي يتم إجراؤها بشكل متكرر على مستوى العالم ، وتلعب قطرات العين دورا مهما في رعاية ما بعد الجراحة. يساعد وضع قطرات العين بعد جراحة إعتام عدسة العين على منع المضاعفات مثل التهابات العين والالتهابات والوذمة البقعية. تستخدم قطرات ال...
تم استخدام قرنيات الأبقار المستنبتة ومعظمها من الخنازير لتقييم سمية المواد الكيميائية التجميلية وأدوية الجلوكوما والأدوية غير الستيرويدية المضادة للالتهابات21،26. كما تم استخدام قرنيات الخنازير كنموذج خارج الجسم الحي لاعتلال القر?...
اي.
نشكر الدكتورين كيبينغ شو (دكتوراه في الطب ودكتوراه) وجيا يين (دكتوراه في الطب ودكتوراه) على مساهماتهم في تطوير ثقافة أعضاء القرنية البقرية والخنازير وراي قوه وآندي وو من مدرسة تروي الثانوية على العمل الفني للشكل 1. تم تمويل أبحاث المختبر للدكتور يو من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (R01 EY010869 ، R01EY035785 ، P30 EY04068) ومن خلال أبحاث الوقاية من العمى في معهد Kresge للعيون.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.7 mL tubes | Axygen | AXYMCT175SP | |
Agarose | Thermo Scientific | R0491 | |
Bromfenac (Prolensa) 0.09% | |||
Camera | Canon | PowerShot A620 | |
Cell Culture Dish | Corning | 430165 | |
D-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000c | |
Forceps | FisherScientific | 10-316A | |
Hemostat | FisherScientific | 13-812-14 | |
Ketorolac (Acular) 0.45% | Kresge Clinic | ||
Kimwipes | Kimtech | 34155 | |
LL-37 | Tocris | 5213/1 | |
Minimum essential medium (MEM) | Gibco | A1048901 | |
Nepafenac (Ilevro) 0.1% | |||
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Phosphate buffered saline | Sigma | P4417 | |
Pig eyes | Bernthal Packing Inc. | ||
Pipet tips | VWR | 76322-164 | |
Porcine corneas | Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI | ||
Povidone-Iodine | Betadine | ||
Q-Tips cotton swabs | Q-Tips | ||
Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72002-01 | |
Razor blade holder | Stotz | ||
Scalpel | Bard-Parker | 377112 | |
Scalpel Handle | Bard-Parker | #3 | |
Scissors | FisherScientific | 08-951-20 | |
Silicon mold | |||
Tissue culter enclosure | Labconco | 5100000 | |
Trephine | Acu.Punch | 3813775 | |
Water bath | VWR | 1235 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved