Évaluation de la toxicité thérapeutique et chimique à l’aide de cornées porcines cultivées sur des organes et de la cicatrisation des plaies épithéliales

Résumé

La culture ex vivo d’organes de cornée porcine et la cicatrisation des plaies épithéliales constituent un moyen économique, éthique, reproductible et quantitatif de tester la toxicité oculaire des produits chimiques. Ils aident également à élucider les mécanismes sous-jacents à la régulation de l’épithélialisation et de la réparation tissulaire, et à évaluer les traitements pour traiter la kératopathie diabétique et le retard de cicatrisation des plaies.

Résumé

En raison de ses similitudes anatomiques et physiologiques avec l’œil humain, l’œil porcin sert de modèle robuste pour la recherche biomédicale et l’évaluation de la toxicité oculaire. Un système de culture cornéenne air/liquide utilisant des yeux de porc a été mis au point, et la cicatrisation épithéliale ex vivo a été utilisée comme paramètre critique pour ces études. Des cornées de porc fraîches ont été traitées pour la culture d’organes, avec ou sans lésions épithéliales. Les cornées ont été cultivées dans un incubateur humidifié à 5 % de CO₂ à 37 °C en MEM, avec ou sans agents de test. La perméabilité de la cornée et les taux de cicatrisation des plaies ont été mesurés, et les cellules épithéliales et/ou les cornées entières peuvent être traitées pour l’immunohistochimie, le western blot et la qPCR pour les analyses moléculaires et cellulaires. Cette étude décrit un protocole détaillé et présente deux études utilisant ce système ex vivo . Les données montrent que la culture d’organes cornéens porcins, combinée à la cicatrisation des plaies épithéliales, est un modèle ex vivo approprié pour les tests de toxicité chimique, l’étude de la kératopathie diabétique et l’identification de thérapies potentielles.

Introduction

Alors que les modèles cellulaires possèdent des populations clonales limitées et ne parviennent pas à reproduire l’architecture in vivo d’un organisme, la culture ou l’explantation d’organes offre des informations sur la fonction, le développement, les mécanismes de la maladie et les thérapies potentielles tout en offrant des avantages éthiques et physiologiques par rapport à d’autres modèles^{expérimentaux1,2}. En plus de réduire le nombre d’animaux nécessaires, la culture d’explants contrôle et manipule judicieusement les conditions environnantes, ce qui est idéal pour une exploration détaillée des facteurs contrôlant la prolifération cellulaire, la migration, la réponse des plaies et la différenciation cellulaire dans un contexte de culture d’organes ^2,3. Parmi différents tissus/organes, les explants de cornée, y compris ceux de l’homme ^4,5,6, ont été largement utilisés pour la toxicité oculaire, l’évaluation de l’irritation ^7,8, pour l’étude des mécanismes moléculaires sous-jacents à la fonction des cellules souches⁹ et à la cicatrisation des plaies^10,11, et pour le glaucome primaire à angle ouvert¹².

Les cornées porcines partagent plusieurs similitudes structurelles et physiologiques avec les cornées humaines, ce qui en fait un excellent modèle pour l’étude de la biologie et des maladies de la cornée humaine. Structurellement, les deux ont la couche de Bowman, 5 à 7 couches de cellules épithéliales, et une courbure et un diamètre similaires. Physiologiquement, ils sont très transparents, ont une composition de film lacrymal et une hydratation cornéenne similaires, présentent des motifs et des fonctions comparables d’innervation cornéenne et suivent des processus de cicatrisation similaires, ce qui en fait un excellent modèle pour l’étude de la biologie et des maladies de la cornée humaine^13,14. Bien que les cornées humaines et porcines présentent de légères différences dans l’arrangement des fibrilles de collagène et la teneur en eau, leur signalisation immunitaire et leurs réponses ne sont pas identiques. Ces différences posent des défis pour la xénotransplantation¹⁵. Par conséquent, les différences spécifiques aux espèces doivent être prises en compte lors de l’interprétation des données expérimentales.

Par rapport aux cornées humaines, les yeux porcins sont facilement disponibles en tant que sous-produits de l’industrie de la viande, ce qui les rend rentables et facilement accessibles pour la recherche¹⁴. L’utilisation de cornées porcines permet de réduire le besoin de cornées de donneurs humains et de minimiser les problèmes éthiques associés aux tests sur les animaux. De plus, la disponibilité de nombreuses cornées porcines à la fois permet des expériences cohérentes et reproductibles, ce qui est crucial pour des résultats de recherche fiables.

Un système de culture d’organes cornéens porcins a d’abord été utilisé pour remplacer les tests sur les animaux de produits chimiques cosmétiques et de médicaments oculaires⁷. Ce système a été utilisé pour étudier la cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes et pour identifier plusieurs voies de signalisation importantes telles que l’excrétion d’ectodomaine HB-EGF, la stimulation de l’acide lysophosphatidique médiateur lipidique et l’activation de l’EGFR pour la cicatrisation des plaies cornéennes^16,17. En utilisant un taux élevé de glucose comme facteur pathologique, un modèle ex vivo d’hyperglycémie a été établi avec une cicatrisation épithéliale retardée pour imiter la kératopathie diabétique humaine. À l’aide de ce modèle, il a été démontré que les expressions équilibrées de l’IL-1β par rapport à l’IL-1Ra¹⁸ et du TGFβ3 par rapport au TGFβ1¹⁹ étaient des facteurs importants pour une bonne cicatrisation des plaies dans les cornées, et la manipulation de ces équilibres peut être utilisée pour traiter la kératopathie diabétique. Par conséquent, la culture d’organes porcins représente un système d’expérience pertinent, économique et manipulateur avec diverses applications dans les tests de toxicité chimique, la recherche biomédicale, la découverte de médicaments et l’évaluation des lésions tissulaires et de la réparation en réponse à l’exposition oculaire à des armes chimiques.

Dans cet article, un protocole détaillé de la culture d’organes cornéens porcins est décrit, et ses applications pour évaluer les effets potentiels des gouttes oculaires AINS (AINS) sur la santé cornéenne et pour déterminer les voies de signalisation et les processus biologiques impliqués dans la pathogenèse de la kératopathie diabétique sont illustrées.

Protocole

Étant donné que les cornées de porc fraîches sont un sous-produit de l’industrie alimentaire, le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux n’a pas eu besoin d’approuver leur utilisation à des fins de recherche. Contrairement aux cornées humaines utilisées dans la recherche, il n’y a pas de risque biologique et les parties inutilisées des yeux de porc peuvent être jetées avec les ordures ménagères. Les réactifs et l’équipement utilisés pour cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation à la culture d’organes

1. Ajouter la pénicilline-streptomycine au milieu essentiel minimum (MEM) en tant que suppléments avant utilisation.
2. Préparez des milieux de culture à haute teneur en glucose en ajoutant 3,6 g de D-glucose à 1 L de MEM supplémenté, qui contient 5 mM de glucose (égal à 90 mg/dL), pour atteindre une concentration finale de glucose de 25 mM (égale à 450 mg/dL), imitant l’hyperglycémie chez les patients diabétiques.
3. Préparez de l’agarose à 1 % dans du MEM supplémenté avec 5 mM ou 25 mM de glucose en ajoutant 0,2 g d’agarose à 20 mL de MEM et en le chauffant au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose se dissolve.
4. Transvaser la solution contenant de l’agarose dans un bain-marie maintenu à 48 °C.
5. Avant l’expérience, autoclavez tous les réactifs expérimentaux, tels que l’eau distillée, le PBS et le matériel chirurgical : hémostat, pince, manche de scalpel, ciseaux et trépan, ainsi que des béchers, des serviettes en papier, des lingettes non pelucheuses, des gants et des pointes de pipette. Faites tremper le moule en silicone, la lame de rasoir et le porte-lame dans de l’alcool à 70 % pendant 30 minutes et lavez-les trois fois avec du PBS stérile.

2. Préparation du globe oculaire porcin pour la culture cornéenne

1. Procurez-vous des globes oculaires de porc dans un abattoir local et transportez-les au laboratoire sur de la glace dans une chambre humide.
   REMARQUE : Les yeux de bovin peuvent également être utilisés de la même manière. Cependant, les yeux et les cornées des bovins diffèrent plus remarquablement des yeux et des cornées humaines. Par exemple, les cornées humaines et porcines ont 5 à 7 couches de cellules épithéliales, tandis que les cornées bovines ont environ 20 couches^13,14. De plus, les yeux des bovins sont plus susceptibles d’être contaminés lors de la culture d’organes cornéens ; Par conséquent, il faut davantage d’yeux de bovin pour l’analyse statistique.
2. Placez les yeux de porc dans un bécher de 1 L contenant du PBS stérilisé.
   REMARQUE : Les globes oculaires porcins sont prélevés dans l’heure qui suit l’abattage et transportés au laboratoire dans environ 2 h. Dans l’ensemble, les yeux ont été utilisés dans les 4 heures (étape 2.3).
3. Tenez un globe oculaire avec une pince à épiler et retirez les tissus extraoculaires avec des ciseaux dans une plaque de Pétri stérile.
4. Rincez les globes oculaires avec de l’eau distillée une fois et du PBS deux fois.
5. Rincer les bulbes oculaires avec une solution antiseptique de povidone et d’iode pendant 10 secondes, puis laver trois fois le PBS stérilisé.
6. Incuber les globes oculaires dans du PBS contenant 20 μg/mL de gentamicine pendant 30 min et les rincer deux fois avec du PBS.

3. Blessure de l’épithélium

1. Tenez un globe oculaire avec des lingettes non pelucheuses stérilisées et marquez le centre des cornées avec un trépan de 6 mm.
2. Grattez doucement les cellules épithéliales à l’intérieur du cercle marqué de trépan avec un petit scalpel ou une lame de rasoir souple émoussée dans les coins, retirez tous les débris cellulaires mais laissez la membrane basale intacte, et nettoyez la zone de la plaie avec des cotons-tiges.
   REMARQUE : Le scalpel avec les cellules épithéliales collectées peut être transféré dans un tube de microcentrifugation placé sur de la glace. Les cellules peuvent être lysées immédiatement ou stockées dans un congélateur à -20 °C pour servir de commandes.

4. Culture d’organes cornéens et modélisation ex vivo de l’hyperglycémie

1. Disséquez le globe oculaire en coupant le long des bords cornéen-scléraux à l’aide d’un scalpel et de ciseaux et rincez les cornées dans un bécher stérilisé de 1000 ml contenant du PBS (pH 7,4).
2. Placez les cornées excisées à l’envers dans un moule stérile fabriqué à partir de silicone liquide non toxique pour la fabrication de moules.
   REMARQUE : Versez le liquide de fabrication de moule en silicone non toxique dans les trous d’un support de culture tissulaire/tube à essai de 50 ml, en utilisant le fond du tube d’ultracentrifugation de 30 ml pour fabriquer un moule demi-rond.
3. Remplissez la cavité cornéenne endothéliale avec du MEM contenant 1% d’agarose maintenu à 48 °C et laissez le mélange se gélifier à température ambiante.
4. Retournez et transférez les cornées dans une boîte de 35 mm, et ajoutez 2 ml de MEM avec ou sans agent d’essai jusqu’à la surface de la cornée centrale pour couvrir la région de la conjonctive limbique, laissant l’épithélium exposé à l’air (figure 1).
5. Placez les boîtes de culture dans un incubateur humidifié à 5 % de CO₂ à 37 °C et remplacez le milieu par un milieu MEM frais avec ou sans agent de test tous les jours pendant 2 jours.
6. Établir un modèle d’hyperglycémie ex vivo en ajoutant du L-glucose à la MEM pour atteindre un total de 25 mM de glucose, qui est utilisé pour la préparation de gels d’agarose à 1 % et comme milieu de culture.

5. Évaluation de la fonction cornéenne

1. Déterminez le taux de cicatrisation de la plaie épithéliale en colorant les cornées blessées avec la coloration de Richardson20 pour marquer la zone restante de la plaie et la photographier (Figure 2 et Figure 3). Quantifiez la taille de la plaie à l’aide d’un logiciel Image-J ou Photoshop (histogramme).
2. Traitez les cornées pour les analyses d’histologie, d’histochimie et d’immunohistochimie (Figure 2 et Figure 3) en les intégrant dans le sectionnement OCT et cryostat. Fixez les sections avec de l’acétone glacée, colorez avec une coloration H&E, ou bloquez avec 1% BSA pendant 1 h pour la coloration TUNEL ou l’immunohistochimie pour détecter les protéines et les molécules de signalisation (telles que Erk et ATK phosphorylées).
   REMARQUE : La plupart des anticorps disponibles dans le commerce n’ont pas été testés pour les antigènes porcins. Cependant, si un anticorps reconnaît à la fois les antigènes humains et murins, il peut principalement être utilisé pour détecter l’antigène porcin correspondant par transfert Western et immunohistochimie.
3. Lavez les cornées colorées avec du PBS et utilisez le trépan de la même taille pour marquer la plaie d’origine et éliminer les cellules épithéliales à l’intérieur des cercles de marqueur.
   1. Prélevez les cellules épithéliales à l’aide d’un petit scalpel, immergez le scalpel avec les cellules collectées dans un tube à centrifuger prérefroidi sur de la glace.
   2. Conservez les cellules collectées dans un congélateur à -80 °C ou extrayez-les immédiatement et effectuez la lyse pour le Western blot et/ou l’ELISA ou dans un tampon d’extraction d’ARN pour la PCR (si nécessaire)10,16,21.

Résultats

La chirurgie de la cataracte est l’une des procédures les plus fréquemment pratiquées dans le monde, et les gouttes ophtalmiques jouent un rôle crucial dans les soins post-opératoires. L’application de gouttes ophtalmiques après une chirurgie de la cataracte aide à prévenir les complications telles que les infections oculaires, l’inflammation et l’œdème maculaire. Les gouttes ophtalmiques AINS (NS), y compris le kétorolac, le bromfénac et le népafénac, ont été cou...

Discussion

Des cornées bovines et principalement porcines en culture ont été utilisées pour évaluer la toxicité des produits chimiques cosmétiques, des médicaments contre le glaucome et des anti-inflammatoires non stéroïdiens^21,26. Les cornées de porc ont également été utilisées comme modèle ex vivo de la kératopathie diabétique humaine. Contrairement aux yeux de lapin, l’œil de porc ressemble à l’?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL tubes	Axygen	AXYMCT175SP
Agarose	Thermo Scientific	R0491
Bromfenac (Prolensa) 0.09%
Camera	Canon	PowerShot A620
Cell Culture Dish	Corning	430165
D-glucose	Sigma	50-99-7
Dissecting microscope	Zeiss	Stemi 2000c
Forceps	FisherScientific	10-316A
Hemostat	FisherScientific	13-812-14
Ketorolac (Acular) 0.45%		Kresge Clinic
Kimwipes	Kimtech	34155
LL-37	Tocris	5213/1
Minimum essential medium (MEM)	Gibco	A1048901
Nepafenac (Ilevro) 0.1%
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417
Pig eyes	Bernthal Packing Inc.
Pipet tips	VWR	76322-164
Porcine corneas	Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI
Povidone-Iodine	Betadine
Q-Tips cotton swabs	Q-Tips
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72002-01
Razor blade holder	Stotz
Scalpel	Bard-Parker	377112
Scalpel Handle	Bard-Parker	#3
Scissors	FisherScientific	08-951-20
Silicon mold
Tissue culter enclosure	Labconco	5100000
Trephine	Acu.Punch	3813775
Water bath	VWR	1235