Evaluación de la toxicidad terapéutica y química mediante el cultivo de órganos de córneas porcinas y la cicatrización de heridas epiteliales

Resumen

El cultivo de órganos ex vivo de córnea porcina y la cicatrización de heridas epiteliales proporcionan un medio económico, ético, reproducible y cuantitativo para probar la toxicidad ocular de los productos químicos. También ayudan a dilucidar los mecanismos subyacentes a la regulación de la epitelización y la reparación de tejidos, y a evaluar terapias para el tratamiento de la queratopatía diabética y el retraso en la cicatrización de heridas.

Resumen

Debido a sus similitudes anatómicas y fisiológicas con el ojo humano, el ojo porcino sirve como un modelo robusto para la investigación biomédica y la evaluación de la toxicidad ocular. Se desarrolló un sistema de cultivo de córnea aire/líquido utilizando ojos porcinos, y la cicatrización de heridas epiteliales ex vivo se utilizó como parámetro crítico para estos estudios. Se procesaron córneas frescas de cerdo para el cultivo de órganos, con o sin lesiones epiteliales. Las córneas se cultivaron en una incubadora humidificada de CO₂ al 5% a 37 °C en MEM, con o sin agentes de prueba. Se midió la permeabilidad de la córnea y las tasas de cicatrización de heridas, y las células epiteliales y/o las córneas enteras se pueden procesar para inmunohistoquímica, Western blot y qPCR para análisis moleculares y celulares. En este estudio se describe un protocolo detallado y se presentan dos estudios en los que se utiliza este sistema ex vivo . Los datos muestran que el cultivo de órganos corneales porcinos, combinado con la cicatrización de heridas epiteliales, es un modelo ex vivo adecuado para las pruebas de toxicidad química, el estudio de la queratopatía diabética y la identificación de posibles terapias.

Introducción

Mientras que los modelos celulares poseen poblaciones clonales limitadas y no logran reproducir la arquitectura in vivo de un organismo, el cultivo o explante de órganos ofrece información sobre la función de los órganos, el desarrollo, los mecanismos de la enfermedad y las posibles terapias, al tiempo que proporciona ventajas éticas y fisiológicas sobre otros modelos experimentales ^1,2. Además de reducir el número de animales necesarios, el cultivo de explantes controla y manipula sensiblemente las condiciones circundantes, lo que es ideal para una exploración detallada de los factores que controlan la proliferación celular, la migración, la respuesta a las heridas y la diferenciación celular en un entorno de cultivo de órganos ^2,3. Entre los diferentes tejidos/órganos, los explantes corneales, incluido el de los seres humanos ^4,5,6, se han utilizado ampliamente para la toxicidad ocular, las evaluaciones de irritación ^7,8, para estudiar molecularmente los mecanismos subyacentes a la función de las células madre⁹ y la cicatrización de heridas^10,11, y para el glaucoma primario de ángulo abierto¹².

Las córneas porcinas comparten varias similitudes estructurales y fisiológicas con las córneas humanas, lo que las convierte en un excelente modelo para estudiar la biología y las enfermedades de la córnea humana. Estructuralmente, ambos tienen la capa de Bowman, 5-7 capas de células epiteliales y una curvatura y diámetro similares. Fisiológicamente, son altamente transparentes, tienen una composición de película lagrimal e hidratación corneal similares, exhiben patrones y funciones comparables de inervación corneal y siguen procesos de cicatrización de heridas similares, lo que los convierte en un excelente modelo para estudiar la biología y las enfermedades de la córnea humana^13,14. Si bien las córneas humanas y porcinas tienen ligeras diferencias en la disposición de las fibrillas de colágeno y el contenido de agua, sus señales y respuestas inmunitarias no son idénticas. Estas diferencias plantean desafíos para el xenotrasplante¹⁵. Por lo tanto, las diferencias específicas de las especies deben tenerse en cuenta al interpretar los datos experimentales.

En comparación con las córneas humanas, los ojos porcinos están fácilmente disponibles como subproductos de la industria cárnica, lo que los hace rentables y fácilmente accesibles para la investigación¹⁴. El uso de córneas porcinas ayuda a reducir la necesidad de córneas de donantes humanos y minimiza las preocupaciones éticas asociadas con las pruebas con animales. Además, la disponibilidad de muchas córneas porcinas a la vez permite realizar experimentos consistentes y reproducibles, lo cual es crucial para obtener resultados de investigación confiables.

Inicialmente se utilizó un sistema de cultivo de órganos corneales porcinos para reemplazar las pruebas en animales de productos químicos cosméticos y medicamentos oculares⁷. Este sistema se ha utilizado para estudiar la cicatrización de heridas epiteliales corneales y para identificar varias vías de señalización importantes, como el desprendimiento del ectodominio HB-EGF, la estimulación del ácido lisofosfatídico mediador lipídico y la activación de EGFR para la cicatrización de heridas corneales^16,17. Utilizando la glucosa alta como factor patológico, se estableció un modelo ex vivo de hiperglucemia con retraso en la cicatrización de heridas epiteliales para imitar la queratopatía diabética humana. Utilizando este modelo, se demostró que las expresiones de equilibrio de IL-1β frente a IL-1Ra¹⁸ y TGFβ3 frente a TGFβ1¹⁹ son factores importantes para la cicatrización adecuada de las heridas en las córneas, y la manipulación de estos equilibrios puede utilizarse para tratar la queratopatía diabética. Por lo tanto, el cultivo de órganos porcinos representa un sistema de experimentación relevante, económico y manipulador con diversas aplicaciones en pruebas de toxicidad química, investigación biomédica, descubrimiento de fármacos y evaluación del daño y la reparación de tejidos en respuesta a la exposición ocular a armas químicas.

En este artículo, se describe un protocolo detallado de cultivo de órganos corneales porcinos, y se ilustran sus aplicaciones para evaluar los efectos potenciales de las gotas oftálmicas de AINE (NS) oculares en la salud de la córnea y para determinar las vías de señalización y los procesos biológicos implicados en la patogénesis de la queratopatía diabética.

Protocolo

Dado que las córneas frescas de cerdo son un subproducto de la industria alimentaria, el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales no necesitó aprobar su uso para la investigación. A diferencia de las córneas humanas utilizadas en la investigación, no hay problemas de riesgo biológico y las partes no utilizadas de los ojos de cerdo se pueden desechar como basura normal. Los reactivos y equipos utilizados para este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación para el cultivo de órganos

1. Agregue penicilina-estreptomicina al medio esencial mínimo (MEM) como suplementos antes de usar.
2. Prepare medios de cultivo con alto contenido de glucosa añadiendo 3,6 g de D-glucosa a 1 L de MEM suplementado, que contiene 5 mM de glucosa (igual a 90 mg/dL), para alcanzar una concentración final de glucosa de 25 mM (igual a 450 mg/dL), imitando la hiperglucemia en pacientes diabéticos.
3. Prepare agarosa al 1% en MEM suplementada con 5 mM o 25 mM de glucosa agregando 0,2 g de agarosa a 20 mL de MEM y calentándola en un microondas hasta que la agarosa se disuelva.
4. Transferir la solución que contiene agarosa a un baño de agua mantenido a 48 °C.
5. Antes del experimento, autoclave todos los reactivos experimentales, como el agua destilada, el PBS y el equipo quirúrgico: hemostático, pinzas, mango de bisturí, tijeras y trefina, así como vasos de precipitados, toallas de papel, toallitas sin pelusa, guantes y puntas de pipeta. Remoje el molde de silicona, la hoja de afeitar y el soporte de la hoja en alcohol al 70% durante 30 minutos y lave con PBS estéril tres veces.

2. Preparación del globo ocular porcino para el cultivo de córnea

1. Obtenga globos oculares porcinos de un matadero local y transpórtelos al laboratorio en hielo en una cámara húmeda.
   NOTA: Los ojos bovinos también se pueden usar de manera similar. Sin embargo, los ojos y las córneas bovinos difieren más notablemente de los ojos/córneas humanos. Por ejemplo, las córneas humanas y porcinas tienen de 5 a 7 capas de células epiteliales, mientras que las córneas bovinas tienen alrededor de 20 capas^13,14. Además, los ojos bovinos tienen más probabilidades de contaminarse durante el cultivo de órganos corneales; Por lo tanto, se necesitan más ojos bovinos para el análisis estadístico.
2. Coloque los ojos porcinos en un vaso de precipitados de 1 L que contenga PBS esterilizado.
   NOTA: Los globos oculares porcinos se recogen dentro de 1 h después del sacrificio y se transportan al laboratorio en aproximadamente 2 h. En general, los ojos se utilizaron en 4 h (paso 2.3).
3. Sujete un globo ocular con pinzas y extraiga los tejidos extraoculares con una tijera en una placa de Petri estéril.
4. Enjuague los globos oculares con agua destilada una vez y PBS dos veces.
5. Enjuague los bulbos oculares con una solución antiséptica de povidona yodada durante 10 s, seguido de un lavado con PBS esterilizado tres veces.
6. Incubar los globos oculares en PBS que contenga 20 μg/mL de gentamicina durante 30 min y enjuagarlos dos veces con PBS.

3. Herida epitelial

1. Sostenga un globo ocular con toallitas esterilizadas sin pelusa y marque el centro de las córneas con un trépano de 6 mm.
2. Raspe suavemente las células epiteliales dentro del círculo marcado con trépano con un bisturí pequeño o una hoja de afeitar suave sin filo en las esquinas, elimine todos los restos celulares pero deje intacta la membrana basal y limpie el área de la herida con hisopos de algodón.
   NOTA: El bisturí con las células epiteliales recolectadas se puede transferir a un tubo de microcentrífuga colocado en hielo. Las células pueden lisarse inmediatamente o almacenarse en un congelador a -20 °C para que sirvan como controles.

4. Cultivo de órganos corneales y modelado de hiperglucemia ex vivo

1. Diseccionar el globo ocular cortando a lo largo de los bordes corneal-esclerales con un bisturí y unas tijeras y enjuagar las córneas en un vaso de precipitados esterilizado de 1000 ml que contenga PBS (pH 7,4).
2. Coloque las córneas extirpadas boca abajo en un molde estéril hecho de silicona líquida no tóxica para la fabricación de moldes.
   NOTA: Vierta el líquido de silicona no tóxico para hacer moldes en los orificios de una gradilla de tubos de ensayo/cultivo de tejidos de 50 mL, utilizando la parte inferior del tubo de ultracentrífuga de 30 mL para hacer un molde de media caña.
3. Rellene la cavidad corneal endotelial con MEM que contenga un 1% de agarosa mantenida a 48 °C y deje que la mezcla se gelifique a temperatura ambiente.
4. Invierta y transfiera las córneas a una placa de 35 mm, y agregue 2 mL de MEM con o sin agente de prueba gota a gota a la superficie de la córnea central para cubrir la región de la conjuntiva limbal, dejando el epitelio expuesto al aire (Figura 1).
5. Coloque las placas de cultivo en una incubadora humidificada de CO₂ al 5% a 37 °C y reemplace el medio con medio MEM fresco con o sin agente de prueba diariamente durante 2 días.
6. Establecer un modelo de hiperglucemia ex vivo mediante la adición de L-glucosa a MEM para alcanzar un total de 25 mM de glucosa, que se utiliza para la preparación de gel de agarosa al 1% y como medio de cultivo.

5. Evaluación de la función corneal

1. Determine la tasa de cicatrización de la herida epitelial tiñendo las córneas heridas con la tinción de Richardson20 para marcar el área restante de la herida y fotografiarla (Figura 2 y Figura 3). Cuantifique el tamaño de la herida con el software Image-J o Photoshop (histograma).
2. Procese las córneas para análisis histológicos, histoquímicos e inmunohistoquímicos (Figura 2 y Figura 3) incorporándolas en el corte de OCT y criostato. Fije las secciones con acetona helada, tiña con tinción H&E o bloquee con BSA al 1 % durante 1 h para la tinción TUNEL o inmunohistoquímica para detectar proteínas y moléculas de señalización (como Erk y ATK fosforiladas).
   NOTA: La mayoría de los anticuerpos disponibles en el mercado no se analizaron para detectar antígenos porcinos. Sin embargo, si un anticuerpo reconoce antígenos tanto humanos como de ratón, se puede utilizar principalmente para detectar el antígeno porcino correspondiente Western blot e inmunohistoquímica.
3. Lave las córneas teñidas con PBS y use la trefina del mismo tamaño para marcar la herida original y raspar las células epiteliales dentro de los círculos marcadores.
   1. Recoja las células epiteliales con un pequeño bisturí, sumerja el bisturí con las células recogidas en un tubo de centrífuga preenfriado en hielo.
   2. Almacene las células recolectadas en un congelador a -80 °C o extráigalas inmediatamente y realice lisis para Western blot y/o ELISA o en tampón de extracción de ARN para PCR (si es necesario)10,16,21.

Resultados

La cirugía de cataratas es uno de los procedimientos que se realizan con más frecuencia a nivel mundial, y las gotas oftálmicas desempeñan un papel crucial en la atención postoperatoria. La aplicación de gotas para los ojos después de la cirugía de cataratas ayuda a prevenir complicaciones como infecciones oculares, inflamación y edema macular. Las gotas oftálmicas para los AINE, incluidos el ketorolaco, el bromfenaco y el nepafenaco, se han utilizado comúnmente para tratar el...

Discusión

Se han utilizado córneas bovinas cultivadas y mayoritariamente porcinas para evaluar la toxicidad de productos químicos cosméticos, medicamentos para el glaucoma y antiinflamatorios no esteroideos^21,26. Las córneas de cerdo también se han utilizado como modelo ex vivo de la queratopatía diabética humana. A diferencia de los ojos de conejo, el ojo de cerdo se asemeja al ojo humano anatómica, fisi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL tubes	Axygen	AXYMCT175SP
Agarose	Thermo Scientific	R0491
Bromfenac (Prolensa) 0.09%
Camera	Canon	PowerShot A620
Cell Culture Dish	Corning	430165
D-glucose	Sigma	50-99-7
Dissecting microscope	Zeiss	Stemi 2000c
Forceps	FisherScientific	10-316A
Hemostat	FisherScientific	13-812-14
Ketorolac (Acular) 0.45%		Kresge Clinic
Kimwipes	Kimtech	34155
LL-37	Tocris	5213/1
Minimum essential medium (MEM)	Gibco	A1048901
Nepafenac (Ilevro) 0.1%
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417
Pig eyes	Bernthal Packing Inc.
Pipet tips	VWR	76322-164
Porcine corneas	Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI
Povidone-Iodine	Betadine
Q-Tips cotton swabs	Q-Tips
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72002-01
Razor blade holder	Stotz
Scalpel	Bard-Parker	377112
Scalpel Handle	Bard-Parker	#3
Scissors	FisherScientific	08-951-20
Silicon mold
Tissue culter enclosure	Labconco	5100000
Trephine	Acu.Punch	3813775
Water bath	VWR	1235