JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

תרבית איברים של קרנית חזיר ex vivo וריפוי פצעי אפיתל מספקים אמצעי חסכוני, אתי, ניתן לשחזור וכמותי לבדיקת רעילות העין של כימיקלים. הם גם מסייעים בהבהרת המנגנונים העומדים בבסיס ויסות אפיתל ותיקון רקמות, ובהערכת טיפולים לטיפול בקרטופתיה סוכרתית ובריפוי פצעים מאוחר.

Abstract

בשל הדמיון האנטומי והפיזיולוגי שלה לעין האנושית, העין החזירית משמשת מודל חזק למחקר ביו-רפואי ולהערכת רעילות העין. פותחה מערכת תרבית קרנית אוויר/נוזל באמצעות עיניים חזיריות, וריפוי פצעים אפיתל ex vivo שימש כפרמטר קריטי למחקרים אלה. קרניות חזיר טריות עובדו לתרבית איברים, עם או בלי פצעי אפיתל. הקרניות תורבתו באינקובטור לח של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-MEM, עם או בלי חומרי בדיקה. נמדדו חדירות הקרנית ושיעורי ריפוי הפצעים, וניתן לעבד תאי אפיתל ו/או קרניות שלמות עבור אימונוהיסטוכימיה, כתמים מערביים ו-qPCR לאנליזות מולקולריות ותאיות. מחקר זה מתאר פרוטוקול מפורט ומציג שני מחקרים המשתמשים במערכת ex vivo זו. הנתונים מראים כי תרבית איברי קרנית חזירית, בשילוב עם ריפוי פצעי אפיתל, היא מודל אקס ויו מתאים לבדיקת רעילות כימית, חקר קרטופתיה סוכרתית וזיהוי טיפולים פוטנציאליים.

Introduction

בעוד שלמודלים של תאים יש אוכלוסיות שבטים מוגבלות והם אינם מצליחים לשחזר את ארכיטקטורת in vivo של אורגניזם, תרבית איברים או צמח אקספלנט מציעים תובנות לגבי תפקוד איברים, התפתחות, מנגנוני מחלה וטיפולים פוטנציאליים תוך מתן יתרונות אתיים ופיזיולוגיים על פני מודלים ניסיוניים אחרים 1,2. בנוסף להפחתת מספר בעלי החיים הדרושים, צמחי תרבית שולטים ומתפעלים בתבונה את התנאים הסובבים, וזה אידיאלי לחקירה מפורטת של גורמים השולטים בהתפשטות תאים, נדידה, תגובת פצעים והתמיינות תאית בסביבת תרבית איברים 2,3. בין רקמות/איברים שונים, צמחילי הקרנית, כולל זו של בני אדם 4,5,6, שימשו באופן נרחב לרעילות עינית, הערכות גירוי 7,8, לחקר מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס תפקוד תאי גזע9 וריפוי פצעים10,11, ולגלאוקומה ראשונית פתוחת זווית12.

קרניות חזיריות חולקות מספר קווי דמיון מבניים ופיזיולוגיים עם קרניות אנושיות, מה שהופך אותן למודל מצוין לחקר ביולוגיה ומחלות של הקרנית האנושית. מבחינה מבנית, לשניהם יש שכבת באומן, 5-7 שכבות של תאי אפיתל, ועקמומיות וקוטר דומים. מבחינה פיזיולוגית, הם שקופים מאוד, בעלי הרכב סרט דמעות דומה ולחות הקרנית, מציגים דפוסים ותפקודים דומים של עצבוב הקרנית, ועוקבים אחר תהליכי ריפוי פצעים דומים, מה שהופך אותם למודל מצוין לחקר ביולוגיה ומחלות של הקרנית האנושית13,14. אמנם בקרניות אנושיות וחזיריות יש הבדלים קלים בסידור סיבי הקולגן ובתכולת המים, אבל האיתות והתגובות החיסוניות שלהן אינם זהים. הבדלים אלה מציבים אתגרים להשתלת קסנו15. לפיכך, יש לקחת בחשבון הבדלים ספציפיים למינים בעת פירוש נתוני ניסוי.

בהשוואה לקרניות אנושיות, עיניים חזיריות זמינות בקלות כתוצרי לוואי של תעשיית הבשר, מה שהופך אותן לחסכוניות ונגישות בקלות למחקר14. שימוש בקרניות חזיריות עוזר להפחית את הצורך בקרניות מתורם אנושי וממזער את החששות האתיים הקשורים לניסויים בבעלי חיים. יתר על כן, זמינותן של קרניות חזיריות רבות בו זמנית מאפשרת ניסויים עקביים וניתנים לשחזור, דבר חיוני לתוצאות מחקר אמינות.

מערכת תרבית איברי קרנית חזירית שימשה בתחילה להחלפת ניסויים בבעלי חיים של כימיקלים קוסמטיים ותרופות עיניים7. מערכת זו שימשה לחקר ריפוי פצעי אפיתל בקרנית ולזיהוי מספר מסלולי איתות חשובים כגון נשירה אקטודומיינית HB-EGF, גירוי חומצה ליזופוספטידית מתווך שומנים והפעלת EGFR לריפוי פצעים בקרנית16,17. באמצעות גלוקוז גבוה כגורם פתולוגי, מודל ex vivo של היפרגליקמיה הוקם עם ריפוי פצע אפיתל מושהה כדי לחקות קרטופתיה סוכרתית אנושית. באמצעות מודל זה, ביטויי שיווי המשקל של IL-1β לעומתIL-1Ra 18 ו- TGFβ3 לעומת TGFβ119 הוכחו כגורמים חשובים לריפוי פצעים תקין בקרניות, וניתן להשתמש במניפולציה של איזונים אלה לטיפול בקרטופתיה סוכרתית. לפיכך, תרבית איברים חזיריים מייצגת מערכת ניסויים רלוונטית, חסכונית ומניפולטיבית עם יישומים שונים בבדיקות רעילות כימיות, מחקר ביו-רפואי, גילוי תרופות והערכת נזק לרקמות ותיקונן בתגובה לחשיפה עינית לנשק כימי.

במאמר זה מתואר פרוטוקול מפורט של תרבית איברי קרנית חזיריים, ומודגמים היישומים שלו להערכת ההשפעות האפשריות של טיפות עיניים NSAID (NS) על בריאות הקרנית ולקביעת מסלולי איתות ותהליכים ביולוגיים המעורבים בפתוגנזה של קרטופתיה סוכרתית.

Protocol

מכיוון שקרניות חזיר טריות הן תוצר לוואי של תעשיית המזון, הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים לא הייתה צריכה לאשר את השימוש בהן למחקר. שלא כמו קרניות אנושיות המשמשות במחקר, אין חששות לסיכון ביולוגי, וניתן להשליך חלקים שאינם בשימוש של עיני חזיר כזבל רגיל. הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה לתרבות איברים

  1. יש להוסיף פניצילין-סטרפטומיצין למדיום החיוני המינימלי (MEM) כתוספים לפני השימוש.
  2. הכינו תרבית עתירת סוכר על ידי הוספת 3.6 גרם D-גלוקוז ל-1 ליטר של תוספת MEM, המכילה 5 מ"מ גלוקוז (שווה ערך ל-90 מ"ג/ד"ל), כדי להגיע לריכוז גלוקוז סופי של 25 מילימטר (שווה ערך ל-450 מ"ג/ד"ל), המחקה היפרגליקמיה בחולי סוכרת.
  3. הכינו 1% אגרוז בתוסף MEM עם 5 מילימטר או 25 מ"מ גלוקוז על ידי הוספת 0.2 גרם אגרוז ל-20 מ"ל MEM וחימום במיקרוגל עד שהאגרוז יתמוסס.
  4. מעבירים את התמיסה המכילה אגרוז לאמבט מים המתוחזק בטמפרטורה של 48 מעלות צלזיוס.
  5. לפני הניסוי, autoclave כל ריאגנטים ניסיוני, כגון מים מזוקקים, PBS, וציוד כירורגי: hemostat, מלקחיים, ידית אזמל, מספריים, טרפין, כמו גם כוסות, מגבות נייר, מגבונים ללא מוך, כפפות, וקצוות פיפטה. השרו את תבנית הסיליקון, סכין הגילוח ומחזיק הלהב ב-70% אלכוהול למשך 30 דקות ושטפו עם PBS סטרילי שלוש פעמים.

2. הכנת גלגל עין חזירי לתרבית הקרנית

  1. השג גלגלי עיניים חזיריים מבית מטבחיים מקומי והעבר אותם למעבדה על קרח בתא לח.
    הערה: גם עיני בקר יכולות לשמש באופן דומה. עם זאת, עיני בקר וקרניות שונות מעיניים / קרניות אנושיות באופן בולט יותר. לדוגמה, לקרניות אדם וחזיר יש 5-7 שכבות של תאי אפיתל, בעוד שלקרניות בקר יש כ -20 שכבות13,14. יתר על כן, עיני בקר נוטות יותר להיות מזוהמות במהלך תרבית איברי הקרנית; לפיכך, יש צורך ביותר עיני בקר לניתוח סטטיסטי.
  2. הניחו את העיניים החזיריות בכד 1 ליטר המכיל PBS מעוקר.
    הערה: גלגלי העיניים החזיריים נאספים תוך שעה לאחר השחיטה ומועברים למעבדה תוך כשעתיים. בסך הכל, העיניים שימשו בתוך 4 שעות (שלב 2.3).
  3. החזיקו גלגל עין בפינצטה והוציאו את הרקמות החוץ-עיניות בעזרת מספריים בצלחת פטרי סטרילית.
  4. שטפו את גלגלי העיניים במים מזוקקים פעם אחת ופעמיים ב-PBS.
  5. שטפו את נורות העיניים בתמיסת חיטוי פובידון-יוד במשך 10 שניות, ולאחר מכן שטיפת PBS מעוקרת שלוש פעמים.
  6. יש לדגור על גלגלי העיניים ב-PBS המכילים 20 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין למשך 30 דקות ולשטוף אותם פעמיים עם PBS.

3. פצע אפיתל

  1. החזיקו גלגל עין עם מגבונים מעוקרים ללא סיבים וסמנו את מרכז הקרניות בטרפין 6 מ"מ.
  2. גרדו בעדינות תאי אפיתל בתוך העיגול המסומן בטרפין בעזרת אזמל קטן או סכין גילוח רך קהה פינה, הסירו את כל פסולת התאים אך השאירו את קרום המרתף שלם, ונקו את אזור הפצע עם צמר גפן.
    הערה: ניתן להעביר את האזמל עם תאי אפיתל שנאספו לצינור מיקרוצנטריפוגה המונח על קרח. ניתן ליזה את התאים באופן מיידי או לאחסן אותם במקפיא של -20 °C כדי לשמש כבקרות.

4. תרבית איברי הקרנית ומידול היפרגליקמיה ex vivo

  1. נתחו את גלגל העין על ידי חיתוך לאורך שולי הקרנית-סקלרלית בעזרת אזמל ומספריים ושטפו את הקרניות בכד מעוקר של 1000 מ"ל המכיל PBS (pH 7.4).
  2. הניחו את הקרניות שנכרתו הפוכות לתוך תבנית סטרילית העשויה מסיליקון נוזלי לא רעיל המייצר עובש.
    הערה: שפכו את הנוזל הלא רעיל לייצור עובש סיליקון לתוך החורים של תרבית רקמות/מתלה מבחנה בנפח 50 מ"ל, תוך שימוש בתחתית צינור האולטרה-צנטריפוגה בנפח 30 מ"ל ליצירת תבנית חצי עגולה.
  3. מלאו את חלל הקרנית האנדותל ב-MEM המכיל 1% אגרוז בטמפרטורה של 48°C ואפשרו לתערובת לג'ל בטמפרטורת החדר.
  4. הפכו והעבירו את הקרניות לצלחת של 35 מ"מ, והוסיפו 2 מ"ל של MEM עם או בלי חומרי בדיקה טיפתיים לפני השטח של הקרנית המרכזית כדי לכסות את אזור הלחמית הלימבלית, ולהשאיר את האפיתל חשוף לאוויר (איור 1).
  5. הניחו את צלחות התרבית באינקובטור לח של 5% CO2 בטמפרטורה של 37°C והחליפו את המדיה במדיית MEM טרייה עם או בלי חומר בדיקה מדי יום למשך יומיים.
  6. ביסוס מודל היפרגליקמיה ex vivo על ידי הוספת L-גלוקוז ל- MEM כדי להגיע לסך של 25 mM גלוקוז, המשמש להכנת ג'ל אגרוז 1% וכאמצעי תרבית.

5. הערכת תפקוד הקרנית

  1. קבעו את קצב ריפוי פצעי האפיתל על-ידי צביעת הקרניות הפצועות בכתמים של ריצ'רדסון20 כדי לסמן את אזור הפצע שנותר ולצלם אותו (איור 2 ואיור 3). כמת את גודל הפצע באמצעות תוכנת Image-J או Photoshop (היסטוגרמה).
  2. עבד את הקרניות עבור ניתוחי היסטולוגיה, היסטוכימיה ואימונוהיסטוכימיה (איור 2 ואיור 3) על-ידי הטמעתן בחתך OCT והקריוסטט. תקן את המקטעים עם אצטון קר כקרח, כתם עם צביעת H&E, או חסום עם 1% BSA למשך שעה אחת עבור צביעת TUNEL או אימונוהיסטוכימיה כדי לזהות חלבונים ומולקולות איתות (כגון Erk זרחני ו- ATK).
    הערה: רוב הנוגדנים הזמינים מסחרית לא נבדקו עבור אנטיגנים חזיריים. עם זאת, אם נוגדן מזהה אנטיגנים אנושיים ועכבריים כאחד, ניתן להשתמש בו בעיקר כדי לזהות את האנטיגן החזירי המתאים לכתמים מערביים ואימונוהיסטוכימיה.
  3. שטפו את הקרניות המוכתמות עם PBS והשתמשו בטרפין באותו גודל כדי לסמן את הפצע המקורי ולגרד תאי אפיתל בתוך עיגולי הסמן.
    1. לאסוף תאי אפיתל עם אזמל קטן, לטבול את האזמל עם תאים שנאספו צינור צנטריפוגה מראש על קרח.
    2. אחסנו את התאים שנאספו במקפיא עמוק בטמפרטורה של -80°C או חלצו אותם מיד ובצעו ליזה עבור כתמים מערביים ו/או ELISA או במאגר מיצוי RNA עבור PCR (במידת הצורך)10,16,21.

תוצאות

ניתוח קטרקט הוא אחד ההליכים המבוצעים בתדירות הגבוהה ביותר בעולם, וטיפות עיניים ממלאות תפקיד מכריע בטיפול שלאחר הניתוח. מריחת טיפות עיניים לאחר ניתוח קטרקט מסייעת במניעת סיבוכים כגון דלקות עיניים, דלקת ובצקת מקולרית. טיפות עיניים NSAID (NS), כולל ketorolac, bromfenac, ו nepafenac, שימשו בד?...

Discussion

בקר מתורבת וקרניות חזיריות בעיקר שימשו להערכת הרעילות של כימיקלים קוסמטיים, תרופות לגלאוקומה ותרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות21,26. קרניות חזיר שימשו גם כמודל ex vivo של קרטופתיה סוכרתית אנושית. בניגוד לעין ארנב, עין החזיר דומה לעי?...

Disclosures

ללא.

Acknowledgements

אנו מודים לד"ר קפינג שו (M.D. ו-O.D) ולד"ר ג'יה יין (M.D. ו-Ph.D.) על תרומתם לפיתוח תרבית איברי הקרנית של בקר וחזיר, ולריי גואו ואנדי וו מבית הספר התיכון טרויה על יצירת האמנות של איור 1. מחקר המעבדה של ד"ר יו מומן על ידי מענקי NIH (R01 EY010869, R01EY035785, P30 EY04068) ועל ידי מחקר למניעת עיוורון במכון העיניים Kresge.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 mL tubesAxygenAXYMCT175SP
Agarose Thermo ScientificR0491
Bromfenac (Prolensa) 0.09% 
CameraCanonPowerShot A620
Cell Culture DishCorning430165
D-glucose Sigma50-99-7
Dissecting microscope ZeissStemi 2000c
ForcepsFisherScientific10-316A
HemostatFisherScientific13-812-14
Ketorolac (Acular) 0.45%Kresge Clinic
KimwipesKimtech34155
LL-37Tocris5213/1
Minimum essential medium (MEM) GibcoA1048901
Nepafenac (Ilevro) 0.1% 
Penicillin-streptomycin Gibco15070063
Phosphate buffered salineSigmaP4417
Pig eyes Bernthal Packing Inc.
Pipet tipsVWR76322-164
Porcine corneasBernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI 
Povidone-Iodine Betadine
Q-Tips cotton swabsQ-Tips
Razor bladeElectron Microscopy Sciences72002-01
Razor blade holder Stotz
ScalpelBard-Parker377112
Scalpel HandleBard-Parker#3
ScissorsFisherScientific08-951-20
Silicon mold
Tissue culter enclosureLabconco5100000
TrephineAcu.Punch3813775
Water bath VWR1235

References

  1. Post, A., et al. Elucidating the role of graft compliance mismatch on intimal hyperplasia using an ex vivo organ culture model. Acta Biomater. 8, 84-94 (2019).
  2. Verma, A., Verma, M., Singh, A. Animal tissue culture principles and applications. Animal Biotechnol. , 269-293 (2020).
  3. Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell Tissue Bank. 19 (3), 269-276 (2018).
  4. Ljubimov, A. V., et al. Human corneal epithelial basement membrane and integrin alterations in diabetes and diabetic retinopathy. J Histochem Cytochem. 46 (9), 1033-1041 (1998).
  5. Shah, R., et al. Reversal of dual epigenetic repression of non-canonical Wnt-5a normalizes diabetic corneal epithelial wound healing and stem cells. Diabetologia. 66 (10), 1943-1958 (2023).
  6. Poe, A. J., et al. Regulatory role of miR-146a in corneal epithelial wound healing via its inflammatory targets in human diabetic cornea. Ocul Surf. 25, 92-100 (2022).
  7. Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol Sci. 58 (2), 306-314 (2000).
  8. Wilson, S. L., Ahearne, M., Hopkinson, A. An overview of current techniques for ocular toxicity testing. Toxicology. 327, 32-46 (2015).
  9. Rose, J. S., et al. An experimental study to test the efficacy of mesenchymal stem cells in reducing corneal scarring in an ex-vivo organ culture model. Exp Eye Res. 190, 107891 (2020).
  10. Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing. Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).
  11. Seyed-Safi, A. G., Daniels, J. T. A validated porcine corneal organ culture model to study the limbal response to corneal epithelial injury. Exp Eye Res. 197, 108063 (2020).
  12. Peng, M., et al. An ex vivo model of human corneal rim perfusion organ culture. Exp Eye Res. 214, 108891 (2022).
  13. Elsheikh, A., Alhasso, D., Rama, P. Biomechanical properties of human and porcine corneas. Exp Eye Res. 86 (5), 783-790 (2008).
  14. Zeng, Y., Yang, J., Huang, K., Lee, Z., Lee, X. A comparison of biomechanical properties between human and porcine cornea. J Biomech. 34 (4), 533-537 (2001).
  15. Yoon, C. H., Choi, H. J., Kim, M. K. Corneal xenotransplantation: Where are we standing. Prog Retin Eye Res. 80, 100876 (2021).
  16. Xu, K. P., Ding, Y., Ling, J., Dong, Z., Yu, F. S. Wound-induced HB-EGF ectodomain shedding and EGFR activation in corneal epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (3), 813-820 (2004).
  17. Xu, K. P., Yin, J., Yu, F. S. Lysophosphatidic acid promoting corneal epithelial wound healing by transactivation of epidermal growth factor receptor. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 636-643 (2007).
  18. Yan, C., et al. Targeting Imbalance between IL-1beta and IL-1 receptor antagonist ameliorates delayed epithelium wound healing in diabetic mouse corneas. Am J Pathol. 186 (6), 1466-1480 (2016).
  19. Gao, N., Yu, F. S. Lack of elevated expression of TGFbeta3 contributes to the delay of epithelial wound healing in diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 35 (2024).
  20. Richardson, K. C., Jarett, L., Finke, E. H. Embedding in epoxy resins for ultrathin sectioning in electron microscopy. Stain Technol. 35, 313-323 (1960).
  21. Xu, K., McDermott, M., Villanueva, L., Schiffman, R. M., Hollander, D. A. Ex vivo corneal epithelial wound healing following exposure to ophthalmic nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Clinical Ophthalmol. 5, 269-274 (2011).
  22. Goldstein, M. H., Silva, F. Q., Blender, N., Tran, T., Vantipalli, S. Ocular benzalkonium chloride exposure: problems and solutions. Eye (Lond). 36 (2), 361-368 (2022).
  23. Xu, K., Yu, F. S. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 3301-3308 (2011).
  24. Gao, N., Yin, J., Yoon, G. S., Mi, Q. S., Yu, F. S. Dendritic cell-epithelium interplay is a determinant factor for corneal epithelial wound repair. Am J Pathol. 179 (5), 2243-2253 (2011).
  25. Yin, J., Yu, F. S. LL-37 via EGFR transactivation to promote high glucose-attenuated epithelial wound healing in organ-cultured corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1891-1897 (2010).
  26. Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol Sci. 58 (2), 306-314 (2000).
  27. Abhari, S., et al. Anatomic studies of the miniature swine cornea. Anat Rec (Hoboken). 301 (11), 1955-1967 (2018).
  28. Araj, H., Tseng, H., Yeung, D. T. Supporting discovery and development of medical countermeasures for chemical injury to eye and skin. Exp Eye Res. 221, 109156 (2022).
  29. Araj, H., Tumminia, S. J., Yeung, D. T. Ocular surface: Merging challenges and opportunities. Transl Vis Sci Technol. 9 (12), 3 (2020).
  30. Lee, M., Hwang, J. H., Lim, K. M. Alternatives to in vivo draize rabbit eye and skin irritation tests with a focus on 3D reconstructed human cornea-like epithelium and epidermis models. Toxicol Res. 33 (3), 191-203 (2017).
  31. Xu, K., McDermott, M., Villanueva, L., Schiffman, R. M., Hollander, D. A. Ex vivo corneal epithelial wound healing following exposure to ophthalmic nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Clin Ophthalmol. 5, 269-274 (2011).
  32. Bettahi, I., et al. Genome-wide transcriptional analysis of differentially expressed genes in diabetic, healing corneal epithelial cells: Hyperglycemia-suppressed TGFbeta3 expression contributes to the delay of epithelial wound healing in diabetic corneas. Diabetes. 63 (2), 715-727 (2014).
  33. Yeung, D. T., Araj, H., Harper, J. R., Platoff, G. E. Considerations in developing medical countermeasures against chemical ocular toxicity. Toxicol Lett. 334, 1-3 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

215

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved