Valutazione della tossicità terapeutica e chimica mediante cornee suine coltivate in organo e guarigione delle ferite epiteliali

Riepilogo

La coltura di organi corneali suini ex vivo e la guarigione delle ferite epiteliali forniscono un mezzo economico, etico, riproducibile e quantitativo per testare la tossicità oculare delle sostanze chimiche. Aiutano anche a chiarire i meccanismi alla base della regolazione dell'epitelizzazione e della riparazione dei tessuti e a valutare le terapie per il trattamento della cheratopatia diabetica e della guarigione ritardata delle ferite.

Abstract

Grazie alle sue somiglianze anatomiche e fisiologiche con l'occhio umano, l'occhio suino funge da modello robusto per la ricerca biomedica e la valutazione della tossicità oculare. È stato sviluppato un sistema di coltura corneale aria/liquido che utilizza occhi suini e la guarigione delle ferite epiteliali ex vivo è stata utilizzata come parametro critico per questi studi. Le cornee fresche di suino sono state processate per la coltura d'organo, con o senza ferita epiteliale. Le cornee sono state coltivate in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ a 37 °C in MEM, con o senza agenti di test. Sono stati misurati la permeabilità corneale e i tassi di guarigione delle ferite e le cellule epiteliali e/o intere cornee possono essere processate per l'immunoistochimica, il western blotting e la qPCR per analisi molecolari e cellulari. Questo studio descrive un protocollo dettagliato e presenta due studi che utilizzano questo sistema ex vivo . I dati mostrano che la coltura di organi corneali suini, combinata con la guarigione delle ferite epiteliali, è un modello ex vivo adatto per i test di tossicità chimica, lo studio della cheratopatia diabetica e l'identificazione di potenziali terapie.

Introduzione

Sebbene i modelli cellulari possiedano popolazioni clonali limitate e non riescano a riprodurre l'architettura in vivo di un organismo, la coltura o l'espianto di organi offre informazioni sulla funzione degli organi, sullo sviluppo, sui meccanismi patologici e sulle potenziali terapie, fornendo al contempo vantaggi etici e fisiologici rispetto ad altri modelli sperimentali ^1,2. Oltre a ridurre il numero di animali necessari, la coltura degli espianti controlla e manipola in modo sensato le condizioni circostanti, il che è ideale per un'esplorazione dettagliata dei fattori che controllano la proliferazione cellulare, la migrazione, la risposta delle ferite e la differenziazione cellulare in un ambiente di coltura di organi ^2,3. Tra i diversi tessuti/organi, gli espianti corneali, compreso quello dell'uomo ^4,5,6, sono stati ampiamente utilizzati per la tossicità oculare, le valutazioni dell'irritazione ^7,8, per studiare i meccanismi molecolari alla base della funzione delle cellule staminali⁹ e della guarigione delle ferite ^10,11 e per il glaucoma primario ad angolo aperto¹².

Le cornee suine condividono diverse somiglianze strutturali e fisiologiche con le cornee umane, rendendole un modello eccellente per lo studio della biologia e delle malattie della cornea umana. Strutturalmente, entrambi hanno lo strato di Bowman, 5-7 strati di cellule epiteliali e curvatura e diametro simili. Fisiologicamente, sono altamente trasparenti, hanno una composizione del film lacrimale e un'idratazione corneale simili, mostrano modelli e funzioni comparabili di innervazione corneale e seguono processi di guarigione delle ferite simili, rendendoli un modello eccellente per lo studio della biologia e delle malattie della cornea umana^13,14. Mentre le cornee umane e suine presentano lievi differenze nella disposizione delle fibrille di collagene e nel contenuto di acqua, la loro segnalazione e le loro risposte immunitarie non sono identiche. Queste differenze pongono sfide per lo xenotrapianto¹⁵. Pertanto, le differenze specie-specifiche devono essere considerate durante l'interpretazione dei dati sperimentali.

Rispetto alle cornee umane, gli occhi suini sono facilmente reperibili come sottoprodotti dell'industria della carne, il che li rende convenienti e facilmente accessibili per la ricerca¹⁴. L'uso di cornee suine aiuta a ridurre la necessità di cornee di donatori umani e riduce al minimo le preoccupazioni etiche associate ai test sugli animali. Inoltre, la disponibilità di molte cornee suine contemporaneamente consente esperimenti coerenti e riproducibili, il che è fondamentale per risultati di ricerca affidabili.

Un sistema di coltura di organi corneali suini è stato inizialmente utilizzato per sostituire i test sugli animali di sostanze chimiche cosmetiche e farmaci oculari⁷. Questo sistema è stato utilizzato per studiare la guarigione delle ferite epiteliali corneali e per identificare diverse importanti vie di segnale come la perdita di ectodomini HB-EGF, la stimolazione dell'acido lisofosfatidico del mediatore lipidico e l'attivazione dell'EGFR per la guarigione delle ferite corneali^16,17. Utilizzando l'alto glucosio come fattore patologico, è stato stabilito un modello ex vivo di iperglicemia con guarigione ritardata delle ferite epiteliali per imitare la cheratopatia diabetica umana. Utilizzando questo modello, le espressioni dell'equilibrio di IL-1β rispetto a IL-1Ra¹⁸ e TGFβ3 rispetto a TGFβ1¹⁹ hanno dimostrato di essere fattori importanti per la corretta guarigione delle ferite nelle cornee e la manipolazione di questi equilibri può essere utilizzata per trattare la cheratopatia diabetica. Pertanto, la coltura di organi suini rappresenta un sistema sperimentale rilevante, economico e manipolante con varie applicazioni nei test di tossicità chimica, nella ricerca biomedica, nella scoperta di farmaci e nella valutazione del danno e della riparazione dei tessuti in risposta all'esposizione oculare ad armi chimiche.

In questo articolo viene descritto un protocollo dettagliato di coltura di organi corneali suini e vengono illustrate le sue applicazioni per valutare i potenziali effetti dei colliri oculari dei FANS (NS) sulla salute della cornea e per determinare le vie di segnalazione e i processi biologici coinvolti nella patogenesi della cheratopatia diabetica.

Protocollo

Poiché le cornee fresche di maiale sono un sottoprodotto dell'industria alimentare, il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali non ha avuto bisogno di approvarne l'uso per la ricerca. A differenza delle cornee umane utilizzate nella ricerca, non ci sono problemi di rischio biologico e le parti inutilizzate degli occhi di maiale possono essere smaltite come normale spazzatura. I reagenti e le attrezzature utilizzate per questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione per la coltura d'organo

1. Aggiungere la penicillina-streptomicina al terreno essenziale minimo (MEM) come integratori prima dell'uso.
2. Preparare terreni di coltura ad alto contenuto di glucosio aggiungendo 3,6 g di D-glucosio a 1 L di MEM integrato, che contiene 5 mM di glucosio (pari a 90 mg/dL), per raggiungere una concentrazione finale di glucosio di 25 mM (pari a 450 mg/dL), imitando l'iperglicemia nei pazienti diabetici.
3. Preparare l'agarosio all'1% in MEM integrato con 5 mM o 25 mM di glucosio aggiungendo 0,2 g di agarosio a 20 mL di MEM e riscaldandolo in un forno a microonde fino a quando l'agarosio non si scioglie.
4. Trasferire la soluzione contenente agarosio in un bagnomaria mantenuto a 48 °C.
5. Prima dell'esperimento, sterilizzare in autoclave tutti i reagenti sperimentali, come acqua distillata, PBS e attrezzature chirurgiche: emostatico, pinze, manico di bisturi, forbici e trafina, nonché becher, asciugamani di carta, salviette prive di lanugine, guanti e puntali per pipette. Immergere lo stampo in silicone, la lama del rasoio e il portalama in alcol al 70% per 30 minuti e lavare con PBS sterile tre volte.

2. Preparazione del bulbo oculare suino per la coltura corneale

1. Procuratevi bulbi oculari suini da un macello locale e trasportateli in laboratorio su ghiaccio in una camera umida.
   NOTA: Anche gli occhi bovini possono essere utilizzati in modo simile. Tuttavia, gli occhi e le cornee dei bovini differiscono dagli occhi/cornee umane in modo più notevole. Ad esempio, le cornee umane e suine hanno 5-7 strati di cellule epiteliali, mentre le cornee bovine hanno circa 20 strati^13,14. Inoltre, gli occhi bovini hanno maggiori probabilità di essere contaminati durante la coltura degli organi corneali; Pertanto, sono necessari più occhi bovini per l'analisi statistica.
2. Mettere gli occhi suini in un becher da 1 litro contenente PBS sterilizzato.
   NOTA: I bulbi oculari suini vengono raccolti entro 1 ora dalla macellazione e trasportati in laboratorio in circa 2 ore. Nel complesso, gli occhi sono stati utilizzati entro 4 ore (passaggio 2.3).
3. Tenere un bulbo oculare con una pinzetta e rimuovere i tessuti extraoculari con una forbice in una piastra di Petri sterile.
4. Sciacquare i bulbi oculari con acqua distillata una volta e PBS due volte.
5. Sciacquare i bulbi oculari con una soluzione antisettica di iodio povidone per 10 s, seguita da PBS sterilizzato tre volte di lavaggio.
6. Incubare i bulbi oculari in PBS contenente 20 μg/mL di gentamicina per 30 minuti e risciacquarli due volte con PBS.

3. Ferita all'epitelio

1. Tenere un bulbo oculare con salviette sterilizzate prive di lanugine e segnare il centro delle cornee con una trefina da 6 mm.
2. Raschiare delicatamente le cellule epiteliali all'interno del cerchio contrassegnato dalla trefina con un piccolo bisturi o una lama di rasoio morbida smussata agli angoli, rimuovere tutti i detriti cellulari ma lasciare intatta la membrana basale e pulire l'area della ferita con tamponi di cotone.
   NOTA: Il bisturi con le cellule epiteliali raccolte può essere trasferito in una provetta da microcentrifuga posta sul ghiaccio. Le celle possono essere lisate immediatamente o conservate in un congelatore a -20 °C per fungere da controlli.

4. Coltura di organi corneali e modellazione dell'iperglicemia ex vivo

1. Sezionare il bulbo oculare tagliando lungo i bordi corneali-sclerali con un bisturi e delle forbici e sciacquare le cornee in un becher sterilizzato da 1000 ml contenente PBS (pH 7,4).
2. Posizionare le cornee asportate capovolte in uno stampo sterile realizzato in silicone liquido atossico.
   NOTA: Versare il liquido non tossico per la produzione di stampi in silicone nei fori di un rack per colture tissutali/provette da 50 mL, utilizzando il fondo della provetta per ultracentrifuga da 30 mL per creare uno stampo semicircolare.
3. Riempire la cavità corneale endoteliale con MEM contenente agarosio all'1% mantenuto a 48 °C e lasciare gelificare la miscela a temperatura ambiente.
4. Capovolgere e trasferire le cornee in una piastra da 35 mm e aggiungere 2 ml di MEM con o senza agente di prova goccia a goccia sulla superficie della cornea centrale per coprire la regione della congiuntiva limbare, lasciando l'epitelio esposto all'aria (Figura 1).
5. Collocare le piastre di coltura in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ a 37 °C e sostituire il terreno con terreno MEM fresco con o senza agente di prova ogni giorno per 2 giorni.
6. Stabilire un modello di iperglicemia ex vivo aggiungendo L-glucosio alla MEM per raggiungere un totale di 25 mM di glucosio, che viene utilizzato per la preparazione di gel di agarosio all'1% e come terreno di coltura.

5. Valutazione della funzione corneale

1. Determinare il tasso di guarigione della ferita epiteliale colorando le cornee ferite con la colorazione di Richardson20 per contrassegnare l'area rimanente della ferita e fotografarla (Figura 2 e Figura 3). Quantifica la dimensione della ferita con il software Image-J o Photoshop (istogramma).
2. Processare le cornee per analisi istologiche, istochimiche e immunoistochimiche (Figura 2 e Figura 3) incorporandole nell'OCT e nel sezionamento del criostato. Fissare le sezioni con acetone ghiacciato, colorare con colorazione H&E o bloccare con BSA all'1% per 1 ora per la colorazione TUNEL o l'immunoistochimica per rilevare proteine e molecole di segnalazione (come Erk e ATK fosforilati).
   NOTA: La maggior parte degli anticorpi disponibili in commercio non è stata testata per gli antigeni suini. Tuttavia, se un anticorpo riconosce sia l'antigene umano che quello di topo, può essere utilizzato principalmente per rilevare il Western blotting e l'immunoistochimica dell'antigene suino corrispondenti.
3. Lavare le cornee colorate con PBS e utilizzare la trefina della stessa dimensione per contrassegnare la ferita originale e raschiare le cellule epiteliali all'interno dei cerchi marcatori.
   1. Raccogliere le cellule epiteliali con un piccolo bisturi, immergere il bisturi con le cellule raccolte in una provetta da centrifuga preraffreddata sul ghiaccio.
   2. Conservare le cellule raccolte in congelatore a -80 °C o estrarle immediatamente ed eseguire la lisi per Western blotting e/o ELISA o in tampone di estrazione dell'RNA per PCR (se necessario)10,16,21.

Risultati

La chirurgia della cataratta è una delle procedure più frequentemente eseguite a livello globale e i colliri svolgono un ruolo cruciale nella cura post-operatoria. L'applicazione di colliri dopo l'intervento di cataratta aiuta a prevenire complicazioni come infezioni oculari, infiammazioni ed edema maculare. I colliri FANS (NS), tra cui ketorolac, bromfenac e nepafenac, sono stati comunemente usati per trattare il dolore e il gonfiore dell'occhio prima, durante e dopo l'intervento di c...

Discussione

Le cornee bovine e per lo più suine sono state utilizzate per valutare la tossicità di sostanze chimiche cosmetiche, farmaci per il glaucoma e farmaci antinfiammatori non steroidei ^21,26. Le cornee di maiale sono state utilizzate anche come modello ex vivo di cheratopatia diabetica umana. A differenza degli occhi di coniglio, l'occhio di maiale assomiglia all'occhio umano anatomicamente, fisiologicame...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL tubes	Axygen	AXYMCT175SP
Agarose	Thermo Scientific	R0491
Bromfenac (Prolensa) 0.09%
Camera	Canon	PowerShot A620
Cell Culture Dish	Corning	430165
D-glucose	Sigma	50-99-7
Dissecting microscope	Zeiss	Stemi 2000c
Forceps	FisherScientific	10-316A
Hemostat	FisherScientific	13-812-14
Ketorolac (Acular) 0.45%		Kresge Clinic
Kimwipes	Kimtech	34155
LL-37	Tocris	5213/1
Minimum essential medium (MEM)	Gibco	A1048901
Nepafenac (Ilevro) 0.1%
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417
Pig eyes	Bernthal Packing Inc.
Pipet tips	VWR	76322-164
Porcine corneas	Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI
Povidone-Iodine	Betadine
Q-Tips cotton swabs	Q-Tips
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72002-01
Razor blade holder	Stotz
Scalpel	Bard-Parker	377112
Scalpel Handle	Bard-Parker	#3
Scissors	FisherScientific	08-951-20
Silicon mold
Tissue culter enclosure	Labconco	5100000
Trephine	Acu.Punch	3813775
Water bath	VWR	1235