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Method Article
La coltura di organi corneali suini ex vivo e la guarigione delle ferite epiteliali forniscono un mezzo economico, etico, riproducibile e quantitativo per testare la tossicità oculare delle sostanze chimiche. Aiutano anche a chiarire i meccanismi alla base della regolazione dell'epitelizzazione e della riparazione dei tessuti e a valutare le terapie per il trattamento della cheratopatia diabetica e della guarigione ritardata delle ferite.
Grazie alle sue somiglianze anatomiche e fisiologiche con l'occhio umano, l'occhio suino funge da modello robusto per la ricerca biomedica e la valutazione della tossicità oculare. È stato sviluppato un sistema di coltura corneale aria/liquido che utilizza occhi suini e la guarigione delle ferite epiteliali ex vivo è stata utilizzata come parametro critico per questi studi. Le cornee fresche di suino sono state processate per la coltura d'organo, con o senza ferita epiteliale. Le cornee sono state coltivate in un incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 °C in MEM, con o senza agenti di test. Sono stati misurati la permeabilità corneale e i tassi di guarigione delle ferite e le cellule epiteliali e/o intere cornee possono essere processate per l'immunoistochimica, il western blotting e la qPCR per analisi molecolari e cellulari. Questo studio descrive un protocollo dettagliato e presenta due studi che utilizzano questo sistema ex vivo . I dati mostrano che la coltura di organi corneali suini, combinata con la guarigione delle ferite epiteliali, è un modello ex vivo adatto per i test di tossicità chimica, lo studio della cheratopatia diabetica e l'identificazione di potenziali terapie.
Sebbene i modelli cellulari possiedano popolazioni clonali limitate e non riescano a riprodurre l'architettura in vivo di un organismo, la coltura o l'espianto di organi offre informazioni sulla funzione degli organi, sullo sviluppo, sui meccanismi patologici e sulle potenziali terapie, fornendo al contempo vantaggi etici e fisiologici rispetto ad altri modelli sperimentali 1,2. Oltre a ridurre il numero di animali necessari, la coltura degli espianti controlla e manipola in modo sensato le condizioni circostanti, il che è ideale per un'esplorazione dettagliata dei fattori che controllano la proliferazione cellulare, la migrazione, la risposta delle ferite e la differenziazione cellulare in un ambiente di coltura di organi 2,3. Tra i diversi tessuti/organi, gli espianti corneali, compreso quello dell'uomo 4,5,6, sono stati ampiamente utilizzati per la tossicità oculare, le valutazioni dell'irritazione 7,8, per studiare i meccanismi molecolari alla base della funzione delle cellule staminali9 e della guarigione delle ferite 10,11 e per il glaucoma primario ad angolo aperto12.
Le cornee suine condividono diverse somiglianze strutturali e fisiologiche con le cornee umane, rendendole un modello eccellente per lo studio della biologia e delle malattie della cornea umana. Strutturalmente, entrambi hanno lo strato di Bowman, 5-7 strati di cellule epiteliali e curvatura e diametro simili. Fisiologicamente, sono altamente trasparenti, hanno una composizione del film lacrimale e un'idratazione corneale simili, mostrano modelli e funzioni comparabili di innervazione corneale e seguono processi di guarigione delle ferite simili, rendendoli un modello eccellente per lo studio della biologia e delle malattie della cornea umana13,14. Mentre le cornee umane e suine presentano lievi differenze nella disposizione delle fibrille di collagene e nel contenuto di acqua, la loro segnalazione e le loro risposte immunitarie non sono identiche. Queste differenze pongono sfide per lo xenotrapianto15. Pertanto, le differenze specie-specifiche devono essere considerate durante l'interpretazione dei dati sperimentali.
Rispetto alle cornee umane, gli occhi suini sono facilmente reperibili come sottoprodotti dell'industria della carne, il che li rende convenienti e facilmente accessibili per la ricerca14. L'uso di cornee suine aiuta a ridurre la necessità di cornee di donatori umani e riduce al minimo le preoccupazioni etiche associate ai test sugli animali. Inoltre, la disponibilità di molte cornee suine contemporaneamente consente esperimenti coerenti e riproducibili, il che è fondamentale per risultati di ricerca affidabili.
Un sistema di coltura di organi corneali suini è stato inizialmente utilizzato per sostituire i test sugli animali di sostanze chimiche cosmetiche e farmaci oculari7. Questo sistema è stato utilizzato per studiare la guarigione delle ferite epiteliali corneali e per identificare diverse importanti vie di segnale come la perdita di ectodomini HB-EGF, la stimolazione dell'acido lisofosfatidico del mediatore lipidico e l'attivazione dell'EGFR per la guarigione delle ferite corneali16,17. Utilizzando l'alto glucosio come fattore patologico, è stato stabilito un modello ex vivo di iperglicemia con guarigione ritardata delle ferite epiteliali per imitare la cheratopatia diabetica umana. Utilizzando questo modello, le espressioni dell'equilibrio di IL-1β rispetto a IL-1Ra18 e TGFβ3 rispetto a TGFβ119 hanno dimostrato di essere fattori importanti per la corretta guarigione delle ferite nelle cornee e la manipolazione di questi equilibri può essere utilizzata per trattare la cheratopatia diabetica. Pertanto, la coltura di organi suini rappresenta un sistema sperimentale rilevante, economico e manipolante con varie applicazioni nei test di tossicità chimica, nella ricerca biomedica, nella scoperta di farmaci e nella valutazione del danno e della riparazione dei tessuti in risposta all'esposizione oculare ad armi chimiche.
In questo articolo viene descritto un protocollo dettagliato di coltura di organi corneali suini e vengono illustrate le sue applicazioni per valutare i potenziali effetti dei colliri oculari dei FANS (NS) sulla salute della cornea e per determinare le vie di segnalazione e i processi biologici coinvolti nella patogenesi della cheratopatia diabetica.
Poiché le cornee fresche di maiale sono un sottoprodotto dell'industria alimentare, il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali non ha avuto bisogno di approvarne l'uso per la ricerca. A differenza delle cornee umane utilizzate nella ricerca, non ci sono problemi di rischio biologico e le parti inutilizzate degli occhi di maiale possono essere smaltite come normale spazzatura. I reagenti e le attrezzature utilizzate per questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Preparazione per la coltura d'organo
2. Preparazione del bulbo oculare suino per la coltura corneale
3. Ferita all'epitelio
4. Coltura di organi corneali e modellazione dell'iperglicemia ex vivo
5. Valutazione della funzione corneale
La chirurgia della cataratta è una delle procedure più frequentemente eseguite a livello globale e i colliri svolgono un ruolo cruciale nella cura post-operatoria. L'applicazione di colliri dopo l'intervento di cataratta aiuta a prevenire complicazioni come infezioni oculari, infiammazioni ed edema maculare. I colliri FANS (NS), tra cui ketorolac, bromfenac e nepafenac, sono stati comunemente usati per trattare il dolore e il gonfiore dell'occhio prima, durante e dopo l'intervento di c...
Le cornee bovine e per lo più suine sono state utilizzate per valutare la tossicità di sostanze chimiche cosmetiche, farmaci per il glaucoma e farmaci antinfiammatori non steroidei 21,26. Le cornee di maiale sono state utilizzate anche come modello ex vivo di cheratopatia diabetica umana. A differenza degli occhi di coniglio, l'occhio di maiale assomiglia all'occhio umano anatomicamente, fisiologicame...
Nessuno.
Ringraziamo i dottori Keping Xu (M.D. e O.D.) e Jia Yin (M.D. e Ph.D.) per i loro contributi allo sviluppo della coltura degli organi corneali bovini e suini e Ray Guo e Andy Wu della Troy High School per l'opera d'arte della Figura 1. La ricerca di laboratorio del Dr. Yu è stata finanziata da sovvenzioni NIH (R01 EY010869, R01EY035785, P30 EY04068) e da Research to Prevent Blindness presso il Kresge Eye Institute.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.7 mL tubes | Axygen | AXYMCT175SP | |
Agarose | Thermo Scientific | R0491 | |
Bromfenac (Prolensa) 0.09% | |||
Camera | Canon | PowerShot A620 | |
Cell Culture Dish | Corning | 430165 | |
D-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000c | |
Forceps | FisherScientific | 10-316A | |
Hemostat | FisherScientific | 13-812-14 | |
Ketorolac (Acular) 0.45% | Kresge Clinic | ||
Kimwipes | Kimtech | 34155 | |
LL-37 | Tocris | 5213/1 | |
Minimum essential medium (MEM) | Gibco | A1048901 | |
Nepafenac (Ilevro) 0.1% | |||
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Phosphate buffered saline | Sigma | P4417 | |
Pig eyes | Bernthal Packing Inc. | ||
Pipet tips | VWR | 76322-164 | |
Porcine corneas | Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI | ||
Povidone-Iodine | Betadine | ||
Q-Tips cotton swabs | Q-Tips | ||
Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72002-01 | |
Razor blade holder | Stotz | ||
Scalpel | Bard-Parker | 377112 | |
Scalpel Handle | Bard-Parker | #3 | |
Scissors | FisherScientific | 08-951-20 | |
Silicon mold | |||
Tissue culter enclosure | Labconco | 5100000 | |
Trephine | Acu.Punch | 3813775 | |
Water bath | VWR | 1235 |
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