Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Domuz korneasının ex vivo organ kültürü ve epitelyal yara iyileşmesi, kimyasalların oküler toksisitesini test etmek için ekonomik, etik, tekrarlanabilir ve kantitatif bir araç sağlar. Ayrıca, epitelizasyon ve doku onarımının düzenlenmesinin altında yatan mekanizmaların aydınlatılmasına ve diyabetik keratopati ve gecikmiş yara iyileşmesinin tedavisi için terapötiklerin değerlendirilmesine yardımcı olurlar.
İnsan gözüne anatomik ve fizyolojik benzerlikleri nedeniyle domuz gözü, biyomedikal araştırmalar ve oküler toksisite değerlendirmesi için sağlam bir model görevi görür. Domuz gözleri kullanılarak hava/sıvı kornea kültürü sistemi geliştirildi ve bu çalışmalar için kritik bir parametre olarak ex vivo epitelyal yara iyileşmesi kullanıldı. Taze domuz korneaları, epitel yarası olsun ya da olmasın organ kültürü için işlendi. Kornealar, MEM'de 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörinde, test ajanları olsun veya olmasın kültürlendi. Kornea geçirgenliği ve yara iyileşme oranları ölçüldü ve epitel hücreleri ve/veya tüm kornealar immünohistokimya, western blotlama ve moleküler ve hücresel analizler için qPCR için işlenebilir. Bu çalışma ayrıntılı bir protokolü açıklamakta ve bu ex vivo sistemi kullanan iki çalışma sunmaktadır. Veriler, epitelyal yara iyileşmesi ile birlikte domuz kornea organ kültürünün, kimyasal toksisite testi, diyabetik keratopatinin incelenmesi ve potansiyel tedavilerin belirlenmesi için uygun bir ex vivo model olduğunu göstermektedir.
Hücre modelleri sınırlı klonal popülasyonlara sahipken ve bir organizmanın in vivo mimarisini yeniden üretemezken, organ kültürü veya eksplant, diğer deneysel modellere göre etik ve fizyolojik avantajlar sağlarken organ fonksiyonu, gelişimi, hastalık mekanizmaları ve potansiyel tedaviler hakkında içgörüler sunar 1,2. İhtiyaç duyulan hayvan sayısını azaltmanın yanı sıra, kültür eksplantları çevre koşullarını kontrol eder ve mantıklı bir şekilde manipüle eder, bu da bir organ kültürü ortamında hücre çoğalmasını, göçünü, yara tepkisini ve hücresel farklılaşmayı kontrol eden faktörlerin ayrıntılı bir şekilde araştırılması için idealdir 2,3. Farklı dokular/organlar arasında, insanlarınki de dahil olmak üzerekornea eksplantları 4,5,6, oküler toksisite, tahriş değerlendirmeleri 7,8, kök hücre fonksiyonunun altında yatan moleküler mekanizmalarıincelemek 9 ve yara iyileşmesi10,11 ve Primer açık açılı glokom12.
Domuz korneaları, insan korneaları ile çeşitli yapısal ve fizyolojik benzerlikleri paylaşır ve bu da onları insan kornea biyolojisi ve hastalıklarını incelemek için mükemmel bir model haline getirir. Yapısal olarak, her ikisi de Bowman katmanına, 5-7 kat epitel hücresine ve benzer eğrilik ve çapa sahiptir. Fizyolojik olarak, oldukça şeffaftırlar, benzer gözyaşı filmi bileşimine ve kornea hidrasyonuna sahiptirler, kornea innervasyonunun karşılaştırılabilir modellerini ve işlevlerini sergilerler ve benzer yara iyileşme süreçlerini takip ederler, bu da onları insan kornea biyolojisi ve hastalıklarını incelemek için mükemmel bir model haline getirir13,14. İnsan ve domuz korneaları, kollajen fibril düzenlemesi ve su içeriğinde küçük farklılıklara sahip olsa da, bağışıklık sinyalleri ve yanıtları aynı değildir. Bu farklılıklar ksenotransplantasyon için zorluklar doğurmaktadır15. Bu nedenle, deneysel veriler yorumlanırken türe özgü farklılıklar göz önünde bulundurulmalıdır.
İnsan kornealarıyla karşılaştırıldığında, domuz gözleri et endüstrisinin yan ürünleri olarak kolayca bulunabilmekte, bu da onları uygun maliyetli ve araştırma için kolay erişilebilir hale getirmektedir14. Domuz kornealarının kullanılması, insan donör kornealarına olan ihtiyacı azaltmaya yardımcı olur ve hayvan testleriyle ilgili etik kaygıları en aza indirir. Ayrıca, aynı anda birçok domuz korneasının mevcudiyeti, güvenilir araştırma sonuçları için çok önemli olan tutarlı ve tekrarlanabilir deneylere izin verir.
Domuz kornea organ kültürü sistemi başlangıçta kozmetik kimyasalların ve oküler ilaçların hayvan testlerinin yerini almak için kullanıldı7. Bu sistem, kornea epitel yara iyileşmesini incelemek ve HB-EGF ektodomain dökülmesi, lipid aracı lizofosfatidik asit stimülasyonu ve kornea yara iyileşmesi için EGFR aktivasyonu gibi birkaç önemli sinyal yolunu tanımlamak için kullanılmıştır16,17. Patolojik bir faktör olarak yüksek glukoz kullanılarak, insan diyabetik keratopatisini taklit etmek için gecikmiş epitelyal yara iyileşmesi ile ex vivo bir hiperglisemi modeli oluşturulmuştur. Bu model kullanılarak, IL-1β'ya karşı IL-1Ra18 ve TGFβ3'e karşı TGFβ119'un denge ekspresyonlarının kornealarda uygun yara iyileşmesi için önemli faktörler olduğu gösterilmiştir ve bu dengelerin manipülasyonu diyabetik keratopatiyi tedavi etmek için kullanılabilir. Bu nedenle, domuz organ kültürü, kimyasal toksisite testleri, biyomedikal araştırmalar, ilaç keşfi ve kimyasal silahlara oküler maruziyete yanıt olarak doku hasarı ve onarımının değerlendirilmesinde çeşitli uygulamalarla ilgili, ekonomik ve manipüle edici bir deney sistemini temsil eder.
Bu makalede, domuz kornea organ kültürünün ayrıntılı bir protokolü anlatılmış ve oküler NSAİİ (NS) göz damlalarının kornea sağlığı üzerindeki potansiyel etkilerini değerlendirmek ve diyabetik keratopatinin patogenezinde rol oynayan sinyal yolaklarını ve biyolojik süreçleri belirlemek için uygulamaları gösterilmiştir.
Taze domuz korneaları gıda endüstrisinin bir yan ürünü olduğundan, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin araştırma için kullanımlarını onaylaması gerekmemiştir. Araştırmada kullanılan insan kornealarının aksine, biyolojik tehlike endişeleri yoktur ve domuz gözlerinin kullanılmayan kısımları normal çöp olarak atılabilir. Bu çalışma için kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Organ kültürü için hazırlık
2. Kornea kültürü için domuz göz küresi hazırlığı
3. Epitel yaralanması
4. Kornea organ kültürü ve ex vivo hiperglisemi modellemesi
5. Kornea fonksiyonunun değerlendirilmesi
Katarakt ameliyatı, dünya çapında en sık uygulanan prosedürlerden biridir ve göz damlası ameliyat sonrası bakımda çok önemli bir rol oynar. Katarakt ameliyatından sonra göz damlası uygulamak, göz enfeksiyonları, iltihaplanma ve makula ödemi gibi komplikasyonların önlenmesine yardımcı olur. Ketorolak, bromfenak ve nepafenak dahil olmak üzere NSAID (NS) göz damlaları, katarakt ameliyatı öncesinde, sırasında ve sonrasında gözün ağrı ve şişmesini tedavi et...
Kültürlenmiş sığır ve çoğunlukla domuz korneaları, kozmetik kimyasalların, glokom ilaçlarının ve steroid olmayan antienflamatuar ilaçların toksisitelerini değerlendirmek için kullanılmıştır21,26. Domuz korneaları ayrıca insan diyabetik keratopatisinin ex vivo modeli olarak da kullanılmıştır. Tavşan gözlerinden farklı olarak, domuz gözü anatomik, fizyolojik ve biyomekanik olarak insan <...
Hiç kimse.
Sığır ve domuz kornea organ kültürünün geliştirilmesine katkılarından dolayı Dr. Keping Xu (MD ve OD) ve Jia Yin'e (MD ve Ph.D.) ve Şekil 1'in sanat eseri için Troy Lisesi'nden Ray Guo ve Andy Wu'ya teşekkür ederiz. Dr. Yu'nun laboratuvar araştırması, NIH hibeleri (R01 EY010869, R01EY035785, P30 EY04068) ve Kresge Göz Enstitüsü'nde Körlüğü Önleme Araştırmaları tarafından finanse edildi.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.7 mL tubes | Axygen | AXYMCT175SP | |
Agarose | Thermo Scientific | R0491 | |
Bromfenac (Prolensa) 0.09% | |||
Camera | Canon | PowerShot A620 | |
Cell Culture Dish | Corning | 430165 | |
D-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000c | |
Forceps | FisherScientific | 10-316A | |
Hemostat | FisherScientific | 13-812-14 | |
Ketorolac (Acular) 0.45% | Kresge Clinic | ||
Kimwipes | Kimtech | 34155 | |
LL-37 | Tocris | 5213/1 | |
Minimum essential medium (MEM) | Gibco | A1048901 | |
Nepafenac (Ilevro) 0.1% | |||
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Phosphate buffered saline | Sigma | P4417 | |
Pig eyes | Bernthal Packing Inc. | ||
Pipet tips | VWR | 76322-164 | |
Porcine corneas | Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI | ||
Povidone-Iodine | Betadine | ||
Q-Tips cotton swabs | Q-Tips | ||
Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72002-01 | |
Razor blade holder | Stotz | ||
Scalpel | Bard-Parker | 377112 | |
Scalpel Handle | Bard-Parker | #3 | |
Scissors | FisherScientific | 08-951-20 | |
Silicon mold | |||
Tissue culter enclosure | Labconco | 5100000 | |
Trephine | Acu.Punch | 3813775 | |
Water bath | VWR | 1235 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır