使用器官培养的猪角膜评估治疗和化学毒性以及上皮伤口愈合

摘要

猪角膜 离体 器官培养和上皮伤口愈合为测试化学品的眼毒性提供了一种经济、合乎伦理、可重复和定量的方法。它们还有助于阐明上皮化和组织修复调节的潜在机制，以及评估治疗糖尿病角膜病变和伤口愈合延迟的治疗方法。

摘要

由于其解剖学和生理学与人眼的相似性，猪眼是生物医学研究和眼毒性评估的可靠模型。开发了一种使用猪眼的空气/液体角膜培养系统，离 体 上皮伤口愈合被用作这些研究的关键参数。新鲜猪角膜被处理用于器官培养，有或没有上皮损伤。将角膜在 37 °C 的加湿 5% CO₂ 培养箱中在 MEM 中培养，有或没有检测试剂。测量角膜通透性和伤口愈合率，上皮细胞和/或全角膜可以处理用于免疫组织化学、蛋白质印迹和 qPCR 以进行分子和细胞分析。本研究描述了一个详细的方案，并介绍了使用该 离体 系统的两项研究。数据显示，猪角膜器官培养结合上皮伤口愈合，是化学毒性测试、研究糖尿病角膜病变和确定潜在疗法的离体模型。

引言

虽然细胞模型具有有限的克隆群并且无法复制生物体的体内结构，但器官培养或外植体提供了对器官功能、发育、疾病机制和潜在疗法的见解，同时与其他实验模型相比具有伦理和生理优势^1,2.除了减少所需的动物数量外，培养外植体还可以控制和合理操纵周围条件，这非常适合在器官培养环境中详细探索控制细胞增殖、迁移、伤口反应和细胞分化的因素 ^2,3。在不同的组织/器官中，角膜外植体，包括人类的角膜外植体 ^4,5,6，已被广泛用于眼毒性、刺激性评估 ^7,8，研究干细胞功能⁹ 和伤口愈合的分子机制^10,11，以及原发性开角型青光眼¹²。

猪角膜与人类角膜在结构和生理学上具有一些相似之处，使其成为研究人类角膜生物学和疾病的优秀模型。在结构上，两者都具有鲍曼层、5-7 层上皮细胞以及相似的曲率和直径。在生理学上，它们是高度透明的，具有相似的泪膜组成和角膜水合作用，表现出相似的角膜神经支配模式和功能，并遵循相似的伤口愈合过程，使它们成为研究人类角膜生物学和疾病的优秀模型^13,14。虽然人类和猪角膜在胶原纤维排列和水分含量方面略有不同，但它们的免疫信号传导和反应并不相同。这些差异对异种移植¹⁵ 构成挑战。因此，在解释实验数据时必须考虑物种特异性差异。

与人类角膜相比，猪眼作为肉类工业的副产品很容易获得，这使得它们具有成本效益并且易于用于研究¹⁴。使用猪角膜有助于减少对人类供体角膜的需求，并最大限度地减少与动物试验相关的道德问题。此外，一次可获得许多猪角膜，可以进行一致且可重复的实验，这对于可靠的研究结果至关重要。

猪角膜器官培养系统最初用于替代化妆品化学品和眼部药物的动物试验⁷。该系统已用于研究角膜上皮伤口愈合并确定几个重要的信号通路，例如 HB-EGF 胞外域脱落、脂质介质溶血磷脂酸刺激和角膜伤口愈合的 EGFR 激活^16,17。以高血糖为病理因素，建立了上皮伤口愈合延迟的高血糖离体模型，以模拟人类糖尿病性角膜病变。使用该模型，IL-1β 与 IL-1Ra¹⁸ 和 TGFβ3 与 TGFβ1¹⁹ 的平衡表达被证明是角膜伤口正常愈合的重要因素，这些平衡的操纵可用于治疗糖尿病角膜病变。因此，猪器官培养代表了一种相关的、经济的和操纵性的实验系统，在化学毒性测试、生物医学研究、药物发现以及评估组织损伤和修复以应对眼部暴露于化学武器方面具有各种应用。

在本文中，描述了猪角膜器官培养的详细方案，并说明了其在评估眼部 NSAID （NS） 滴眼液对角膜健康的潜在影响以及确定参与糖尿病角膜病变发病机制的信号通路和生物过程的应用。

研究方案

由于新鲜猪角膜是食品工业的副产品，机构动物护理和使用委员会不需要批准将其用于研究。与研究中使用的人类角膜不同，没有生物危害问题，猪眼未使用的部分可以作为普通垃圾处理。用于本研究的试剂和设备列在 材料表中。

1. 器官培养的准备

1. 使用前将青霉素-链霉素作为补充剂添加到最低必需培养基 （MEM） 中。
2. 通过将 3.6 g D-葡萄糖添加到 1 L 补充的 MEM 中来制备高葡萄糖培养基，其中含有 5 mM 葡萄糖（等于 90 mg/dL），以达到 25 mM（相当于 450 mg/dL）的最终葡萄糖浓度，模拟糖尿病患者的高血糖。
3. 向 20 mL MEM 中加入 0.2 g 琼脂糖，并在微波炉中加热直至琼脂糖溶解，在含有 5 mM 或 25 mM 葡萄糖的补充 MEM 中制备 1% 琼脂糖。
4. 将含琼脂糖的溶液转移到维持在 48 °C 的水浴中。
5. 实验前，对所有实验试剂进行高压灭菌，例如蒸馏水、PBS 和手术设备：止血钳、镊子、手术刀手柄、剪刀和环钻，以及烧杯、纸巾、无绒湿巾、手套和移液器吸头。将硅模具、剃须刀片和刀架浸泡在 70% 酒精中 30 分钟，然后用无菌 PBS 洗涤 3 次。

2. 用于角膜培养的猪眼球制备

1. 从当地屠宰场获取猪眼球，并将它们在潮湿的冰上运输到实验室。
   注意：牛眼也可以以类似的方式使用。然而，牛眼和角膜与人的眼睛/角膜不同得更明显。例如，人和猪角膜有 5-7 层上皮细胞，而牛角膜大约有 20 层^13,14。此外，牛眼在角膜器官培养过程中更容易被污染;因此，需要更多的牛眼进行统计分析。
2. 将猪眼放入含有消毒 PBS 的 1 L 烧杯中。
   注意：在屠宰后 1 小时内收集猪眼球，并在约 2 小时内运输到实验室。总体而言，眼睛在 4 小时内使用（步骤 2.3）。
3. 用镊子握住眼球，用剪刀在无菌培养皿中去除眼外组织。
4. 用蒸馏水冲洗眼球一次，用 PBS 冲洗两次。
5. 用聚维酮碘消毒液冲洗眼球 10 秒，然后用消毒的 PBS 洗涤 3 次。
6. 将眼球在含有 20 μg/mL 庆大霉素的 PBS 中孵育 30 分钟，然后用 PBS 冲洗两次。

3. 上皮损伤

1. 用消毒的无绒湿巾握住眼球，并用 6 毫米环钻标记角膜中心。
2. 用小手术刀或带角钝的软剃须刀片轻轻刮擦环钻标记圆圈内的上皮细胞，去除所有细胞碎片，但保持基底膜完好无损，并用棉签清洁伤口区域。
   注意：可以将收集到的上皮细胞的手术刀转移到置于冰上的微量离心管中。细胞可以立即裂解或储存在 -20 °C 冰箱中作为对照。

4. 角膜器官培养和 离体 高血糖建模

1. 用手术刀和剪刀沿着角膜巩膜边缘切割眼球，然后在含有 PBS （pH 7.4） 的无菌 1000 mL 烧杯中冲洗角膜。
2. 将切除的角膜倒置放入由无毒液体制模硅胶制成的无菌模具中。
   注：将无毒硅胶制模液倒入 50 mL 组织培养物/试管架的孔中，使用 30 mL 超速离心管的底部制作半圆模具。
3. 用含有 1% 琼脂糖的 MEM 填充角膜腔，保持在 48 °C，并让混合物在室温下凝胶。
4. 将角膜倒置并转移到 35 毫米培养皿中，并在中央角膜表面滴加 2 mL MEM，含或不含检测试剂，以覆盖角膜缘结膜区域，使上皮暴露在空气中（图 1）。
5. 将培养皿置于 37 °C 的加湿 5% CO₂ 培养箱中，每天用新鲜的 MEM 培养基更换培养基，无论是否含有检测剂，持续 2 天。
6. 通过将 L-葡萄糖添加到 MEM 中以达到总共 25 mM 葡萄糖来建立 离体 高血糖模型，其用于 1% 琼脂糖凝胶制备和培养基。

5. 角膜功能评估

1. 通过用 Richardson 染色法对受伤的角膜进行染色来确定上皮伤口愈合率20 以标记剩余的伤口区域并拍照（图 2 和 图 3）。使用 Image-J 或 Photoshop 软件（直方图）量化伤口大小。
2. 通过将角膜嵌入 OCT 和低温恒温器切片中，处理角膜以进行组织学、组织化学和免疫组织化学分析（图 2 和 图 3）。用冰冷的丙酮固定切片，用 H&E 染色染色，或用 1% BSA 封闭 1 小时进行 TUNEL 染色或免疫组织化学，以检测蛋白质和信号分子（如磷酸化的 Erk 和 ATK）。
   注：大多数市售抗体未进行猪抗原检测。但是，如果抗体同时识别人类和小鼠抗原，则它主要可用于检测相应的猪抗原 Western blotting 和免疫组织化学。
3. 用 PBS 清洗染色的角膜，并使用相同大小的环钻标记原始伤口并报废标记圆圈内的上皮细胞。
   1. 用小手术刀收集上皮细胞，将收集的细胞浸入手术刀中，浸入在冰上预冷的离心管中。
   2. 将收集的细胞储存在 -80 °C 深冰箱中或立即提取，并进行裂解以进行蛋白质印迹和/或 ELISA 或用于 PCR 的 RNA 提取缓冲液（如果需要）10,16,21。

结果

白内障手术是全球最常用的手术之一，滴眼液在术后护理中起着至关重要的作用。白内障手术后滴眼液有助于预防眼部感染、炎症和黄斑水肿等并发症。NSAID （NS） 滴眼液，包括酮咯酸、溴芬酸和奈帕芬酸，通常用于治疗白内障手术前、手术中和手术后的眼睛疼痛和肿胀。长期使用这些含有不同量防腐剂（如苯扎氯铵）的滴眼液可能会对角膜的健康产生不利影响

讨论

培养的牛角膜和主要是猪角膜已被用于评估化妆品化学品、青光眼药物和非甾体抗炎药的毒性^21,26。猪角膜也被用作人类糖尿病角膜病变的离体模型。与兔子的眼睛不同，猪眼在解剖学、生理学和生物力学上都类似于 人的眼睛²⁷，因此，被用于异种移植到人类¹⁵ 中，包括?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL tubes	Axygen	AXYMCT175SP
Agarose	Thermo Scientific	R0491
Bromfenac (Prolensa) 0.09%
Camera	Canon	PowerShot A620
Cell Culture Dish	Corning	430165
D-glucose	Sigma	50-99-7
Dissecting microscope	Zeiss	Stemi 2000c
Forceps	FisherScientific	10-316A
Hemostat	FisherScientific	13-812-14
Ketorolac (Acular) 0.45%		Kresge Clinic
Kimwipes	Kimtech	34155
LL-37	Tocris	5213/1
Minimum essential medium (MEM)	Gibco	A1048901
Nepafenac (Ilevro) 0.1%
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070063
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417
Pig eyes	Bernthal Packing Inc.
Pipet tips	VWR	76322-164
Porcine corneas	Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI
Povidone-Iodine	Betadine
Q-Tips cotton swabs	Q-Tips
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72002-01
Razor blade holder	Stotz
Scalpel	Bard-Parker	377112
Scalpel Handle	Bard-Parker	#3
Scissors	FisherScientific	08-951-20
Silicon mold
Tissue culter enclosure	Labconco	5100000
Trephine	Acu.Punch	3813775
Water bath	VWR	1235