إنشاء نموذج سرطان المثانة السطحي للفئران عبر تقنية إدارة الخلايا داخل المثانة

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة فريدة لبناء نموذج تقويم العظام لسرطان المثانة السطحي.

Abstract

تقدم هذه الدراسة طريقة مبتكرة لإنشاء نموذج ورم مثانة الفئران تقويم العظام بكفاءة عالية وتوطين دقيق للورم. بعد تخدير إناث الفئران C57BL / 6J في وضع ضعيف ، يتم إدخال إبرة وريدية 24 جم في المثانة لإخلاء محتوياتها. ثم يتم إدخال إبرة توزيع 34 جم من خلال القسطرة ، ويتم تدويرها خمس مرات لإحداث إصابة بؤرية في الغشاء المخاطي لقبة المثانة ، ثم إزالتها لاحقا. يتم شفط معلق الخلية MB49 وتوصيله بإبرة توزيع 30 G ، والتي يتم إدخالها في المثانة عبر القسطرة. يتم حقن الخلايا السرطانية تحت المخاطية في المثانة تحت الضغط. تؤدي هذه التقنية إلى الحد الأدنى من الصدمة للفئران ، ومعدل ارتفاع الورم ، وموقع الورم الثابت. يتميز بالبساطة والاستنساخ الممتاز. يوفر هذا النموذج منصة تجريبية مثالية لتطوير العلاجات داخل المثانة لسرطان المثانة ، مما يسهل تطوير وتحسين استراتيجيات العلاج لهذا الورم الخبيث.

Introduction

يمثل سرطان المثانة عبئا صحيا عالميا كبيرا ، مع تفاوتات ملحوظة حسب الجنس في الإصابة والتشخيص. يتميز هذا الورم الخبيث بأنواع فرعية جزيئية مميزة ، يرتبط كل منها بمسارات مسببة للأمراض متنوعة. تختلف السمات الجزيئية والمرضية اختلافا كبيرا بين سرطان المثانة غير الغازي للعضلات (NMIBC) وسرطان المثانة الغازي للعضلات (MIBC) ^1،2. يمثل NMIBC ما يقرب من 75٪ من الحالات ، ويضم أورام من أصل ظهاري انتقالي تظل موضعية دون ورم خبيث أو انتشار. على العكس من ذلك ، يتميز MIBC بتسلل الخلايا السرطانية إلى طبقة عضلات المثانة ، مصحوبا بخطر كبير للانتشار ، مما يستلزم في كثير من الأحيان استئصال المثانة في الممارسة السريرية³.

في الأبحاث قبل السريرية ، تعتبر النماذج التي تمثل بدقة المرحلة السطحية للمرض ضرورية لتقييم العلاجات الدوائية. لذلك ، فإن إنشاء نموذج لسرطان المثانة السطحي في الموقع له أهمية قصوى ، حيث يعمل كأداة بحثية حاسمة لتطوير الأدوية السريرية وعلاجات التقطير المبتكرة.

واجه تطوير نماذج سرطان المثانة تقويم العظام للفئران تقليديا تحديات. غالبا ما تبدأ النماذج المستحثة كيميائيا كأورام سطحية ولكنها قد تتطور إلى أشكال غازية ، مع تباين يحد من فائدتها في التجارب واسعة النطاق⁴. تكافح نماذج زرع تقويم العظام التقليدية ، التي تعتمد على حقن الخلايا السرطانية من خلال جدار المثانة⁵ ، لإعادة إنتاج سرطان المثانة السطحي بأمانة. تمت تجربة طرق بديلة ، بما في ذلك إصابة الغشاء المخاطي جنبا إلى جنب مع تقطير الخلايا السرطانية^{6،7،8،9،10} ، ولكنها محدودة بسبب معدلات الوفيات العالية ومعدلات أخذ الورم المنخفضة ، مما يعيق تطبيقها على نطاق أوسع.

تهدف هذه الدراسة إلى تطوير طريقة جديدة لبناء نموذج سرطان المثانة السطحي الذي يوضح استقرارا أكبر ووفيات أقل ووضعا ثابتا للورم مقارنة بالنماذج الحالية. من خلال تحقيق تمثيل أكثر دقة للمرض في مراحله المبكرة ، يستعد النموذج الحالي لتعزيز التقييم الدقيق للتدخلات الوقائية والعلاجية ، وبالتالي تطوير علاج سرطان المثانة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات وإجراءات التجارب الحيوانية من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية للتجارب على التابعة لجامعة تيانجين الطبية ، تيانجين ، الصين (رقم الموافقة SYXK: 2020-0010). تم استخدام إناث الفئران C57BL / 6J التي تتراوح أعمارها بين ستة إلى ثمانية أسابيع في هذه الدراسة. تم إيواء في ظروف بيئية خاضعة للرقابة ، بما في ذلك دورة الضوء والظلام لمدة 12 ساعة ، ودرجات حرارة تتراوح بين 21-25 درجة مئوية ، ومستويات رطوبة قابلة للتعديل بين 30٪ -70٪ ، والوصول غير المقيد إلى الطعام والماء ما لم ينص على خلاف ذلك. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير الخلية

1. استزراع خط خلايا سرطان مثانة الفئران MB49 في وسط النسر المعدل الكامل من Dulbecco (DMEM) ، مع استكمال مصل بقري الجنين بنسبة 10٪ (FBS) لدعم النمو الأمثل.
2. الحفاظ على مزارع الخلايا في ظل الظروف القياسية عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. قم بتحديث الوسائط كل 2-3 أيام لضمان صحة الخلية وقابليتها للحياة.
3. احصد الخلايا باستخدام إجراء هضم التربسين الموحد. ماصة برفق لإخراج الخلايا من قارورة الثقافة بعد وضع التربسين واحتضانها لفترة وجيزة.
4. عد الخلايا المحصودة باستخدام مقياس كثافة الدم لتحديد كثافة الخلية بالضبط. قم بإعداد معلق أحادي الخلية عن طريق تعليق الخلايا إلى 2 × 10³ / ميكرولتر في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). احتفظ بهذا التعليق على الجليد للحفاظ على صلاحية الخلية.

2. تحضير

1. مجموعة إيواء الفئران (5 فئران لكل قفص) في أقفاص من البولي كربونات ذات تهوية فردية.
2. اسمح للفئران بالتأقلم لمدة 7 أيام قبل بدء الدراسة.

3. توليد نموذج ورم تقويم العظام الحيواني

1. قم بإعطاء التخدير للفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق باستخدام محلول 2.5٪ من أفيرتين (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
2. انتظر حتى تصل الفئران إلى مستوى مناسب من التخدير للجراحة ، كما يتضح من انخفاض معدل التنفس مع زيادة العمق ، وغياب ردود الفعل للجفن والقرنية ، وانخفاض قوة العضلات والاستجابات الانعكاسية ، وعدم وجود رد فعل على قرص الذيل.
3. ضع الفأر المخدر في وضع ضعيف لتسهيل الإجراء.
4. استخدم قسطرة وريدية 24 جم مع إزالة نمط الإبرة لإجراء قسطرة مجرى البول. ضع تزييتا وافرا على القسطرة لتقليل الانزعاج وتسهيل الإدخال السلس.
5. حدد مجرى البول ، الموجود مباشرة خلف طيات الفرج وأمام المهبل ، مع إبقاء الفأر في وضع ضعيف.
   1. ابدأ القسطرة عن طريق الاقتراب من مجرى البول بزاوية 45 درجة للتنقل أسفل عظم العانة. اضبط على زاوية ضحلة لتوجيه القسطرة عبر مجرى البول إلى المثانة.
6. تجنب استخدام القوة المفرطة ضد المقاومة ، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى ثقب مجرى البول أو المثانة. تأكد من موقع القسطرة داخل تجويف المثانة عن طريق التحقق من وجود بول داخل القسطرة.
7. اضغط برفق على أسفل بطن الفأر لتسهيل تصريف البول من المثانة. تأكد من إفراغ المثانة تماما للتحضير للخطوات اللاحقة للإجراء.
8. ادفع القسطرة الوريدية 24 جم برفق باتجاه الجزء العلوي من المثانة. تأكد من أن طرف القسطرة يتلامس مع قمة المثانة.
   1. بمجرد تأكيد الاتصال ، حرر القسطرة ، مما يسمح لها بالتراجع قليلا. حافظ على القسطرة في وضع ثابت بالنسبة للفأر لضمان الاستقرار ومنع الإزاحة.
9. أدخل إبرة الاستغناء المعدلة 34 G على طول القسطرة 24 G. تقدم الإبرة حتى تصل إلى أعلى المثانة.
   1. بمجرد وضعه ، قم بتدوير الإبرة ست مرات لإحداث إصابة مخاطية موضعية في قمة المثانة. بعد الانتهاء من الدوران ، اسحب الإبرة بعناية على طول القسطرة.
10. قم بتوصيل إبرة الاستغناء 30 جيجا بالجزء العلوي من حقنة سعة 1 مل. تأكد من اتصال آمن بين الإبرة والحقنة.
    1. بمجرد التوصيل ، ارسم نظام التعليق الخلوي MB49 المعد مسبقا 2 × 10 ³ / ميكرولتر MB49 في المحقنة عن طريق سحب المكبس برفق. تحقق من شفط تعليق الخلية في المحقنة دون أي فقاعات هواء.
11. أدخل إبرة الاستغناء 30 جم على طول القسطرة 24 G. تأكد من محاذاة الإبرة بشكل صحيح وتثبيتها داخل القسطرة.
    1. بمجرد وضعه ، اضغط على مكبس المحقنة سعة 1 مل لحقن المحتويات (المحضرة في الخطوة 1). حافظ على ضغط ثابت على المكبس لمدة 60 ثانية لضمان تسليم المحتويات دون تقليل الحجم بشكل كبير.
    2. بعد 60 ثانية ، اسحب بعناية المحقنة وإبرة الاستغناء 30 جم من القسطرة.

4. مراقبة ما بعد الجراحة

1. ضع الفأر المخدر في وضع ضعيف على وسادة التدفئة حتى يعود المنعكس الصحيح.
2. تأكد من عدم ترك دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي.
3. لا تعيد إلى صحبة الأخرى حتى يتعافى تماما.

النتائج

تم تقييم فعالية الحقن تحت المخاطية في البداية من خلال إعطاء Trypan Blue. بعد الحقن ، تم تصور توزيع الصبغة داخل الطبقة تحت المخاطية بوضوح ، مما يؤكد التوصيل الدقيق والخاضع للرقابة للمواد المحقونة (الشكل 1).

تم تتبع تطور الورم بدقة. بعد حوالي 14 يوما...

Discussion

تعتمد الأبحاث حول سرطان المثانة على النماذج الحيوانية ، والتي لا غنى عنها لكل من البحوث الأساسية والتطبيقية. لتقليد بيئة نمو الورم بشكل أفضل ، توفر نماذج أورام المثانة التقويمية نهجا متفوقا مقارنة بنماذج الأورام تحت الجلد¹¹.

حاليا ، يمكن تصني...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
34 G dispensing needle	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
30 G dispensing needle	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
Avertin	Sigma-Aldrich LLC	T48402
Trypan blue	Sigma-Aldrich LLC	302643