膀胱内細胞投与技術 による マウス表在性膀胱癌モデルの確立

要約

このプロトコルは、表在性膀胱がんの同所性モデルを構築するための独自の方法を説明しています。

要約

この研究は、高効率で正確な腫瘍局在化を備えた同所性マウス膀胱腫瘍モデルを確立するための革新的な方法を提示します。雌のC57BL/6Jマウスを仰臥位で麻酔した後、24Gの静脈注射針を膀胱に挿入して内容物を排出します。次に、34 G の分注針をカテーテルに通し、5 回回転させて膀胱ドーム粘膜に限局性損傷を生じさせ、その後抜去します。MB49細胞懸濁液は吸引され、30Gの分注針に接続され、カテーテル を介して 膀胱に挿入されます。腫瘍細胞は、圧力下で膀胱に粘膜下注入されます。この技術により、マウスへの外傷が最小限に抑えられ、腫瘍の取り込み率が高くなり、腫瘍の位置が固定されます。シンプルさと優れた再現性が特徴です。このモデルは、膀胱がんの膀胱内療法を開発するための理想的な実験プラットフォームを提供し、この悪性腫瘍の治療戦略の進歩と最適化を促進します。

概要

膀胱がんは世界的に大きな健康負担となっており、発生率と予後には性差が顕著である。この悪性腫瘍は、それぞれが多様な病原性経路に関連する異なる分子サブタイプによって特徴付けられます。非筋層浸潤性膀胱がん(NMIBC)と筋層浸潤性膀胱がん(MIBC^)では、分子的および病理学的特徴が大きく異なります^1,2。NMIBCは症例の約75%を占め、転移や転移を伴わずに限局性が残る移行性上皮起源の腫瘍を特徴としています。一方、MIBCは、がん細胞が膀胱の筋肉層に浸潤することを特徴とし、播種のリスクが高いため、臨床現場では膀胱切除術が必要になることがよくあります³。

前臨床研究では、薬物療法の評価には、疾患の表在性を正確に表すモデルが不可欠です。したがって、表在性膀胱がんのin situモデルの確立は最も重要であり、臨床薬の開発や革新的な点滴療法のための重要な研究ツールとして機能します。

マウスの同所性膀胱がんモデルの開発は、伝統的に課題に直面してきました。化学的に誘導されたモデルは、多くの場合、表在性の腫瘍として開始されますが、浸潤性に進化する可能性があり、大規模な実験ではその有用性を制限する変動性があります⁴。従来の同所性移植モデルは、膀胱壁⁵からの腫瘍細胞の注入に依存しており、表在性膀胱がんを忠実に再現するのに苦労しています。腫瘍細胞点滴^6,7,8,9,10と組み合わせた粘膜損傷を含む代替方法が試みられてきたが、高い死亡率と低い腫瘍摂取率によって制限され、それらの広範な適用を妨げている。

この研究は、既存のモデルと比較して、より高い安定性、低い死亡率、および固定された腫瘍の位置を示す表在性膀胱がんモデルを構築するための新しい方法を開発することを目的としています。現在のモデルは、疾患の初期段階をより正確に表現することで、予防的および治療的介入の厳密な評価を強化し、それによって膀胱がんの治療を前進させる態勢を整えています。

プロトコル

すべての動物実験のプロトコルと手順は、中国天津の天津医科大学の動物実験倫理審査委員会によって承認されました(承認番号SYXK:2020-0010)。この研究では、6〜8週齢の雌C57BL / 6Jマウスを使用しました。動物は、12時間の明暗サイクル、21〜25°Cの範囲の温度、30%〜70%の調整可能な湿度レベル、特に指定がない限り食物と水への無制限のアクセスなど、制御された環境条件下で飼育されました。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1. 細胞調製

1. マウス膀胱がん細胞株MB49を完全ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で培養し、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加して最適な増殖をサポートします。
2. 細胞培養物を37°Cの標準条件下で、5%_CO2の加湿インキュベーターで維持します。細胞の健康と生存率を確保するために、2〜3日ごとに培地を更新してください。
3. 標準化されたトリプシン消化手順を使用して細胞を回収します。トリプシンを塗布し、短時間インキュベートした後、静かにピペットで細胞を培養フラスコから取り除きます。
4. 血球計算盤を使用して採取した細胞をカウントし、正確な細胞密度を決定します。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を2 x 10³/μLに再懸濁して、シングルセル懸濁液を調製します。この懸濁液を氷上に置いて、細胞の生存率を維持します。

2.動物の調理

1. マウス(ケージあたり5匹)をグループハウスで、個別に換気されたポリカーボネートケージに入れます。
2. 研究開始の7日前からマウスを順応させます。

3. 動物同所性腫瘍モデル作製

1. Avertin の 2.5% 溶液を使用して腹腔内注射 により マウスに麻酔を投与します (施設で承認されたプロトコルに従います)。
2. マウスが手術に適したレベルの麻酔に達するまで待ちます。これは、深さの増加に伴う呼吸数の減少、まぶたと角膜反射の欠如、筋緊張と反射反応の低下、尻尾のピンチに対する反応がないことから示されます。
3. 麻酔をかけたマウスを仰臥位にして、手順を容易にします。
4. 尿道カテーテル法のために針スタイレットを取り外した24G静脈内カテーテルを使用してください。カテーテルに十分な潤滑剤を塗布して、不快感を最小限に抑え、スムーズな挿入を容易にします。
5. マウスを仰臥位に保ちながら、外陰部のひだのすぐ後方、膣の前方に位置する尿道を特定します。
   1. カテーテル法は、恥骨の下を移動するために45度の角度で尿道に近づくことから開始します。より浅い角度に調整して、カテーテルを尿道を通って膀胱に導きます。
6. 抵抗に対して過度の力を加えると、尿道や膀胱の穿孔につながる可能性があるため、避けてください。カテーテル内の尿をチェックして、膀胱内腔内のカテーテルの位置を確認します。
7. マウスの下腹部にやさしく圧力をかけ、膀胱からの尿の排出を促進します。手順の後続のステップに備えるために、膀胱が完全に空になっていることを確認してください。
8. 24G静脈カテーテルを膀胱の上部に向かってそっと押します。カテーテルの先端が膀胱の頂点に接触していることを確認します。
   1. 接触が確認されたら、カテーテルを放し、カテーテルがわずかに引っ込められるのを待ちます。カテーテルをマウスに対して固定位置に保持して、安定性を確保し、脱落を防ぎます。
9. 修正した34Gディスペンシングニードルを24Gカテーテルに沿って挿入します。針が膀胱の上部に達するまで針を進めます。
   1. 位置を特定したら、針を6回回転させて、膀胱の頂点に局所的な粘膜損傷を作成します。回転が完了したら、カテーテルに沿って針を慎重に引き抜きます。
10. 30 Gの分注針を1 mLシリンジの上部に接続します。針とシリンジをしっかりと接続してください。
    1. 接続したら、プランジャーを静かに引き戻して、事前に調製した2 x 10³/μL MB49細胞懸濁液をシリンジに引き込みます。細胞懸濁液が気泡なしでシリンジに吸引されることを確認します。
11. 30Gのディスペンシングニードルを24Gのカテーテルに沿って挿入します。針が適切に位置合わせされ、カテーテル内に固定されていることを確認してください。
    1. 位置決めしたら、1 mLシリンジのプランジャーに圧力を加えて内容物を注入します(ステップ1で調製)。プランジャーに一定の圧力を60秒間維持して、内容物が大幅に体積を減少させることなく供給されるようにします。
    2. 60秒後、シリンジと30Gの分注針をカテーテルから慎重に引き出します。.

4. 術後モニタリング

1. 麻酔をかけたマウスを、右向き反射が戻るまで加熱パッドの仰臥位に置きます。
2. 動物が十分な意識を取り戻すまで、動物が放置されていないことを確認してください。
3. 動物が完全に回復するまで、動物を他の動物と一緒に戻さないでください。

結果

粘膜下注射の有効性は、最初にトリパンブルーの投与によって評価されました。.注入後、粘膜下層内の色素の分布が明確に可視化され、注入された物質の正確かつ制御された送達が確認されました(図1)。

腫瘍の発生は細心の注意を払って追跡されました。着床後約14日で、膀胱腫瘍を示す重篤な症状である血尿の顕著な発?...

ディスカッション

膀胱がんの研究は、基礎研究と応用研究の両方に不可欠な動物モデルに依存しています。腫瘍の成長環境をよりよく模倣するために、同所性膀胱腫瘍モデルは、皮下腫瘍モデル¹¹と比較して優れたアプローチを提供します。

現在、同所性膀胱がんモデルは、実験目的に基づいて、免疫不全マウスを利用するもの(PDX)モデル

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
34 G dispensing needle	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
30 G dispensing needle	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
Avertin	Sigma-Aldrich LLC	T48402
Trypan blue	Sigma-Aldrich LLC	302643