Etablissement d’un modèle murin de cancer de la vessie superficielle au moyen d’une technique d’administration de cellules intravésicales

Résumé

Ce protocole décrit une méthode unique de construction d’un modèle orthotopique du cancer superficiel de la vessie.

Résumé

Cette étude présente une méthode innovante pour établir un modèle de tumeur orthotopique de la vessie murine avec une efficacité élevée et une localisation tumorale précise. Après avoir anesthésié des souris femelles C57BL/6J en position couchée, une aiguille intraveineuse de 24 G est insérée dans la vessie pour évacuer son contenu. Une aiguille de distribution de 34 G est ensuite introduite à travers le cathéter, tournée cinq fois pour créer une lésion focale de la muqueuse du dôme de la vessie, puis retirée. La suspension cellulaire MB49 est aspirée et reliée à une aiguille de distribution de 30 G, qui est insérée dans la vessie via le cathéter. Les cellules tumorales sont injectées sous-muqueusement dans la vessie sous pression. Cette technique entraîne un traumatisme minimal pour les souris, un taux élevé d’absorption de la tumeur et un emplacement fixe de la tumeur. Il se caractérise par sa simplicité et son excellente reproductibilité. Ce modèle fournit une plate-forme expérimentale idéale pour développer des thérapies intravésicales pour le cancer de la vessie, facilitant l’avancement et l’optimisation des stratégies de traitement de cette tumeur maligne.

Introduction

Le cancer de la vessie représente un fardeau important pour la santé mondiale, avec des disparités notables selon le sexe en matière d’incidence et de pronostic. Cette malignité est caractérisée par des sous-types moléculaires distincts, chacun associé à diverses voies pathogènes. Les caractéristiques moléculaires et pathologiques diffèrent considérablement entre le cancer de la vessie non invasif sur le plan musculaire (NMIBC) et le cancer de la vessie invasif sur le plan musculaire (MIBC)^1,2. Le NMIBC représente environ 75 % des cas, avec des tumeurs d’origine épithéliale transitionnelle qui restent localisées sans métastases ni propagation. À l’inverse, la MIBC se caractérise par l’infiltration de cellules cancéreuses dans la couche musculaire de la vessie, accompagnée d’un risque élevé de dissémination, nécessitant fréquemment une cystectomie en pratique clinique³.

Dans la recherche préclinique, des modèles qui représentent avec précision le stade superficiel de la maladie sont essentiels pour évaluer les traitements médicamenteux. La mise en place d’un modèle in situ de carcinome superficiel de la vessie est donc d’une importance capitale, car elle constitue un outil de recherche essentiel pour le développement de médicaments cliniques et de thérapies innovantes par instillation.

Le développement de modèles murins de cancer de la vessie orthotopique a toujours été confronté à des défis. Les modèles induits chimiquement commencent souvent par des tumeurs superficielles, mais peuvent évoluer vers des formes invasives, avec une variabilité qui limite leur utilité dans les expériences à grande échelle⁴. Les modèles d’implantation orthotopique traditionnels, qui reposent sur l’injection de cellules tumorales à travers la paroi de la vessie⁵, ont du mal à reproduire fidèlement le cancer superficiel de la vessie. Des méthodes alternatives, y compris les lésions de la muqueuse combinées à l’instillation de cellules tumorales 6,7,8,9,10, ont été tentées mais sont limitées par des taux de mortalité élevés et de faibles taux d’absorption de tumeurs, ce qui entrave leur application plus large.

Cette étude vise à développer une nouvelle méthode de construction d’un modèle de cancer de la vessie superficiel qui démontre une plus grande stabilité, une mortalité plus faible et un positionnement tumoral fixe par rapport aux modèles existants. En obtenant une représentation plus précise de la maladie à ses débuts, le modèle actuel est sur le point d’améliorer l’évaluation rigoureuse des interventions préventives et thérapeutiques, faisant ainsi progresser le traitement du cancer de la vessie.

Protocole

Tous les protocoles et procédures d’expérimentation animale ont été approuvés par le Comité d’examen éthique de l’expérimentation animale de l’Université de médecine de Tianjin, Tianjin, Chine (numéro d’approbation SYXK : 2020-0010). Des souris femelles C57BL/6J âgées de six à huit semaines ont été utilisées pour cette étude. Les animaux ont été logés dans des conditions environnementales contrôlées, y compris un cycle lumière-obscurité de 12 heures, des températures variant de 21 à 25 °C, des niveaux d’humidité réglables entre 30 % et 70 % et un accès illimité à la nourriture et à l’eau, sauf indication contraire. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation cellulaire

1. Cultivez la lignée cellulaire MB49 du cancer de la vessie murine dans le milieu complet Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) pour favoriser une croissance optimale.
2. Maintenir les cultures cellulaires dans des conditions standard à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂. Rafraîchissez le support tous les 2 à 3 jours pour assurer la santé et la viabilité des cellules.
3. Récoltez les cellules à l’aide d’une procédure normalisée de digestion à la trypsine. Pipeter doucement pour déloger les cellules du ballon de culture après avoir appliqué de la trypsine et incubé pendant une brève période.
4. Comptez les cellules récoltées à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer la densité cellulaire exacte. Préparez une suspension unicellulaire en les remettant en suspension à 2 x 10³/μL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Gardez cette suspension sur de la glace pour maintenir la viabilité cellulaire.

2. Préparation des animaux

1. Le groupe loge les souris (5 souris par cage) dans des cages en polycarbonate ventilées individuellement.
2. Laissez les souris s’acclimater pendant 7 jours avant le début de l’étude.

3. Génération de modèles de tumeurs orthotopiques animales

1. Administrer l’anesthésie aux souris par injection intrapéritonéale à l’aide d’une solution à 2,5 % d’Avertin (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
2. Attendez que les souris atteignent un niveau d’anesthésie approprié pour la chirurgie, comme l’indiquent une diminution de la fréquence respiratoire avec une augmentation de la profondeur, l’absence de réflexes des paupières et de la cornée, une réduction du tonus musculaire et des réponses réflexes, et aucune réaction à un pincement de la queue.
3. Positionnez la souris anesthésiée en position couchée pour faciliter l’intervention.
4. Utilisez un cathéter intraveineux de 24 G avec le stylet de l’aiguille retiré pour la procédure de cathétérisme urétral. Appliquez une lubrification suffisante sur le cathéter pour minimiser l’inconfort et faciliter l’insertion en douceur.
5. Identifiez l’urètre, situé immédiatement en arrière des plis vulvaires et en avant du vagin, tout en maintenant la souris en position couchée.
   1. Commencez le cathétérisme en vous approchant de l’urètre à un angle de 45 degrés pour naviguer sous l’os pubien. Ajustez à un angle plus faible pour guider le cathéter à travers l’urètre et dans la vessie.
6. Évitez d’appliquer une force excessive contre la résistance, car cela peut entraîner une perforation de l’urètre ou de la vessie. Confirmez l’emplacement du cathéter dans la lumière de la vessie en vérifiant s’il y a de l’urine dans le cathéter.
7. Appliquez doucement une pression sur le bas-ventre de la souris pour faciliter l’évacuation de l’urine de la vessie. Assurez-vous que la vessie est complètement vidée pour vous préparer aux étapes ultérieures de la procédure.
8. Poussez doucement le cathéter intraveineux de 24 G vers le haut de la vessie. Assurez-vous que l’extrémité du cathéter entre en contact avec l’apex de la vessie.
   1. Une fois le contact confirmé, relâchez le cathéter, ce qui lui permet de se rétracter légèrement. Maintenez le cathéter dans une position fixe par rapport à la souris pour assurer la stabilité et éviter le délogement.
9. Insérez l’aiguille de distribution modifiée de 34 G le long du cathéter de 24 G. Avancez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle atteigne le haut de la vessie.
   1. Une fois positionné, tournez l’aiguille six fois pour créer une lésion muqueuse localisée à l’apex de la vessie. Après avoir terminé la rotation, retirez délicatement l’aiguille le long du cathéter.
10. Connectez l’aiguille de distribution de 30 g au haut d’une seringue de 1 ml. Assurez-vous d’une connexion sûre entre l’aiguille et la seringue.
    1. Une fois connecté, aspirez la suspension de cellules MB49 de 2 x 10³/μL pré-préparée dans la seringue en tirant doucement le piston vers l’arrière. Vérifiez que la suspension cellulaire est aspirée dans la seringue sans bulles d’air.
11. Insérez l’aiguille de distribution de 30 G le long du cathéter de 24 G. Assurez-vous que l’aiguille est correctement alignée et fixée à l’intérieur du cathéter.
    1. Une fois positionné, appliquez une pression sur le piston de la seringue de 1 mL pour injecter le contenu (préparé à l’étape 1). Maintenez une pression constante sur le piston pendant 60 s pour vous assurer que le contenu est distribué sans réduction significative du volume.
    2. Après 60 s, retirez avec précaution la seringue et l’aiguille de distribution de 30 G du cathéter.

4. Suivi postopératoire

1. Placez la souris anesthésiée en position couchée sur un coussin chauffant jusqu’à ce que le réflexe de redressement revienne.
2. Assurez-vous que l’animal n’est pas laissé sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris suffisamment conscience.
3. Ne retournez pas l’animal en compagnie d’autres animaux avant qu’il ne soit complètement rétabli.

Résultats

L’efficacité des injections sous-muqueuses a d’abord été évaluée par l’administration de Trypan Blue. Après l’injection, la distribution du colorant dans la couche sous-muqueuse a été clairement visualisée, confirmant l’administration précise et contrôlée des substances injectées (Figure 1).

Le développement de la tumeur a été méticuleusement suivi. Environ 14 jours après l’implantation, une incidence...

Discussion

La recherche sur le cancer de la vessie s’appuie sur des modèles animaux, indispensables à la fois pour la recherche fondamentale et appliquée. Pour mieux imiter l’environnement de croissance tumorale, les modèles de tumeurs orthotopiques de la vessie offrent une approche supérieure par rapport aux modèles de tumeurs sous-cutanées¹¹.

À l’heure actuelle, les modèles de cancer de la vessie orthotopique peuvent être classé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
34 G dispensing needle	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
30 G dispensing needle	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
Avertin	Sigma-Aldrich LLC	T48402
Trypan blue	Sigma-Aldrich LLC	302643