Создание модели поверхностного рака мочевого пузыря у мышей с помощью метода внутрипузырного введения клеток

Резюме

Этот протокол описывает уникальный метод построения ортотопической модели поверхностного рака мочевого пузыря.

Аннотация

В данном исследовании представлен инновационный метод создания ортотопической модели опухоли мышиного мочевого пузыря с высокой эффективностью и точной локализацией опухоли. После обезболивания самок мышей C57BL/6J в лежачем положении в мочевой пузырь вводят внутривенную иглу 24 G для эвакуации его содержимого. Затем через катетер вводится дозирующая игла 34 G, которая вращается пять раз для создания очагового повреждения слизистой оболочки купола мочевого пузыря, а затем удаляется. Клеточная суспензия MB49 аспирируется и подключается к дозирующей игле 30 G, которая вводится в мочевой пузырь через катетер. Опухолевые клетки под давлением вводятся подслизистым путем в мочевой пузырь. Этот метод приводит к минимальной травматизации мышей, высокой скорости удаления опухоли и фиксированному расположению опухоли. Он отличается простотой и отличной воспроизводимостью. Эта модель обеспечивает идеальную экспериментальную платформу для разработки внутрипузырной терапии рака мочевого пузыря, способствуя продвижению и оптимизации стратегий лечения этого злокачественного новообразования.

Введение

Рак мочевого пузыря представляет собой значительное глобальное бремя для здоровья с заметными гендерными различиями в заболеваемости и прогнозе. Эта злокачественная опухоль характеризуется различными молекулярными подтипами, каждый из которых связан с различными патогенными путями. Молекулярные и патологические особенности значительно различаются между немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря (NMIBC) и мышечно-инвазивным раком мочевого пузыря (MIBC)^1,2. На долю NMIBC приходится примерно 75% случаев, при этом опухоли переходного эпителиального происхождения остаются локализованными без метастазирования или распространения. И наоборот, ММРЖ характеризуется инфильтрацией раковых клеток в мышечный слой мочевого пузыря, что сопровождается высоким риском диссеминации, что часто требует цистэктомии в клинической практике³.

В доклинических исследованиях модели, которые точно представляют поверхностную стадию заболевания, имеют важное значение для оценки лекарственной терапии. Таким образом, создание модели поверхностной карциномы мочевого пузыря in situ имеет первостепенное значение, поскольку она служит важнейшим исследовательским инструментом для разработки клинических препаратов и инновационных инстилляционных методов лечения.

Разработка моделей ортотопического рака мочевого пузыря у мышей традиционно сталкивалась с трудностями. Химически индуцированные модели часто начинаются как поверхностные опухоли, но могут эволюционировать в инвазивные формы с изменчивостью, которая ограничивает их полезность в крупномасштабных^{экспериментах}. Традиционные модели ортотопической имплантации, которые основаны на введении опухолевых клеток^{через стенку} мочевого пузыря, изо всех сил пытаются точно воспроизвести поверхностный рак мочевого пузыря. Альтернативные методы, включая повреждение слизистой оболочки в сочетании с инстилляцией опухолевых клеток 6,7,8,9,10, были опробованы, но они ограничены высокими показателями смертности и низкими показателями выноса опухолей, что препятствует их более широкому применению.

Данное исследование направлено на разработку нового метода построения поверхностной модели рака мочевого пузыря, которая демонстрирует большую стабильность, меньшую смертность и фиксированное расположение опухоли по сравнению с существующими моделями. Достигая более точного представления заболевания на ранних стадиях, нынешняя модель готова улучшить строгую оценку профилактических и терапевтических вмешательств, тем самым продвигая лечение рака мочевого пузыря.

протокол

Все протоколы и процедуры экспериментов на животных были одобрены Комитетом по этической экспертизе экспериментов на животных Тяньцзиньского медицинского университета, Тяньцзинь, Китай (номер одобрения SYXK: 2020-0010). Для исследования были использованы самки мышей C57BL/6J в возрасте от 6 до 8 недель. Животные содержались в контролируемых условиях окружающей среды, включая 12-часовой цикл света и темноты, температуру от 21 до 25 °C, регулируемый уровень влажности от 30% до 70% и неограниченный доступ к пище и воде, если не указано иное. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка клеток

1. Культивируйте клеточную линию мышиного рака мочевого пузыря MB49 в полной модифицированной среде Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) для поддержки оптимального роста.
2. Клеточные культуры должны содержаться при стандартных условиях при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержанием_CO2 5%. Обновляйте среду каждые 2-3 дня, чтобы обеспечить здоровье и жизнеспособность клеток.
3. Соберите клетки с помощью стандартизированной процедуры расщепления трипсина. Аккуратно пипеткой, чтобы выбить клетки из колбы с культурой после применения трипсина и инкубации в течение короткого периода времени.
4. Подсчитайте собранные клетки с помощью гемоцитометра, чтобы определить точную плотность клеток. Приготовьте суспензию для одиночных клеток путем ресуспендирования клеток до 2 x 10³/мкл в фосфатно-солевом буфере (PBS). Держите эту суспензию на льду, чтобы сохранить жизнеспособность клеток.

2. Подготовка животных

1. Групповое содержание мышей (5 мышей в клетке) в индивидуально вентилируемых клетках из поликарбоната.
2. Дайте мышам акклиматизироваться в течение 7 дней до начала исследования.

3. Создание модели ортотопической опухоли у животных

1. Вводите мышам анестезию путем внутрибрюшинной инъекции с использованием 2,5% раствора авертина (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
2. Подождите, пока мыши не достигнут соответствующего уровня анестезии для операции, на что указывает снижение частоты дыхания с увеличением глубины, отсутствие рефлексов век и роговицы, снижение мышечного тонуса и рефлекторных реакций, а также отсутствие реакции на пощипывание хвоста.
3. Расположите мышь под наркозом в положении лежа на спине, чтобы облегчить процедуру.
4. Для процедуры катетеризации уретры используйте внутривенный катетер 24 G с удаленным стилетом иглы. Нанесите достаточное количество смазки на катетер, чтобы свести к минимуму дискомфорт и обеспечить плавное введение.
5. Определите мочеиспускательный канал, расположенный непосредственно позади складок вульвы и спереди от влагалища, при этом удерживая мышь в лежачем положении.
   1. Начните катетеризацию с приближения к мочеиспускательному каналу под углом 45 градусов для навигации под лобковой костью. Отрегулируйте более мелкий угол, чтобы провести катетер через мочеиспускательный канал в мочевой пузырь.
6. Избегайте приложения чрезмерной силы против сопротивления, так как это может привести к перфорации уретры или мочевого пузыря. Подтвердите расположение катетера в просвете мочевого пузыря, проверив наличие мочи в катетере.
7. Аккуратно надавите на нижнюю часть живота мыши, чтобы облегчить отток мочи из мочевого пузыря. Убедитесь, что мочевой пузырь полностью опорожнен, чтобы подготовиться к следующим этапам процедуры.
8. Осторожно протолкните внутривенный катетер 24 G к верхней части мочевого пузыря. Убедитесь, что кончик катетера соприкасается с верхушкой мочевого пузыря.
   1. Как только контакт подтвердится, отпустите катетер, позволив ему немного втянуться. Удерживайте катетер в фиксированном положении относительно мыши, чтобы обеспечить устойчивость и предотвратить смещение.
9. Введите модифицированную дозирующую иглу 34 G вдоль катетера 24 G. Продвигайте иглу вперед, пока она не достигнет верхней части мочевого пузыря.
   1. После установки поверните иглу шесть раз, чтобы создать локализованное повреждение слизистой оболочки в верхней части мочевого пузыря. Завершив вращение, осторожно извлеките иглу вдоль катетера.
10. Подсоедините дозирующую иглу 30 г к верхней части шприца объемом 1 мл. Обеспечьте надежное соединение между иглой и шприцем.
    1. После подключения наберите в шприц заранее подготовленную суспензию элементов MB49 2 x 10³/μл, осторожно оттянув поршень. Убедитесь, что клеточная суспензия аспирирована в шприц без пузырьков воздуха.
11. Введите дозирующую иглу 30 G вдоль катетера 24 G. Убедитесь, что игла правильно выровнена и закреплена внутри катетера.
    1. После установки надавите на поршень шприца объемом 1 мл, чтобы ввести содержимое (подготовлено на шаге 1). Поддерживайте постоянное давление на поршень в течение 60 с, чтобы обеспечить подачу содержимого без значительного уменьшения объема.
    2. Через 60 с осторожно извлеките шприц и дозирующую иглу 30 G из катетера.

4. Послеоперационный мониторинг

1. Поместите мышь под наркозом в лежачее положение на грелку до тех пор, пока не вернется рефлекс выпрямления.
2. Следите за тем, чтобы животное не оставляли без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание.
3. Не возвращайте животное в компанию других животных до тех пор, пока оно полностью не выздоровеет.

Результаты

Эффективность подслизистых инъекций первоначально оценивали с помощью введения Трипана Блю. После инъекции распределение красителя в подслизистом слое было четко визуализировано, что подтвердило точную и контролируемую доставку вводимых веществ (рис. 1<...

Обсуждение

Исследования рака мочевого пузыря опираются на животных моделях, которые незаменимы как для фундаментальных, так и для прикладных исследований. Для лучшей имитации среды роста опухоли ортотопические модели опухолей мочевого пузыря обеспечивают превосходный подход...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
34 G dispensing needle	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
30 G dispensing needle	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
Avertin	Sigma-Aldrich LLC	T48402
Trypan blue	Sigma-Aldrich LLC	302643