Etablierung eines Modells für oberflächliches Blasenkarzinom der Maus mittels intravesikaler Zellverabreichungstechnik

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine einzigartige Methode zur Konstruktion eines orthotopen Modells des oberflächlichen Blasenkrebses.

Zusammenfassung

Diese Studie stellt eine innovative Methode zur Etablierung eines orthotopen murinen Blasentumormodells mit hoher Effizienz und präziser Tumorlokalisierung vor. Nach der Anästhesie weiblicher C57BL/6J-Mäuse in Rückenlage wird eine intravenöse 24-G-Nadel in die Blase eingeführt, um den Inhalt zu evakuieren. Anschließend wird eine 34-G-Dosiernadel durch den Katheter eingeführt, fünfmal gedreht, um eine fokale Verletzung der Blasendomschleimhaut zu erzeugen, und anschließend entfernt. Die MB49-Zellsuspension wird aspiriert und mit einer 30 G Dosiernadel verbunden, die über den Katheter in die Blase eingeführt wird. Tumorzellen werden unter Druck submukösal in die Blase injiziert. Diese Technik führt zu einem minimalen Trauma der Mäuse, einer hohen Tumoraufnahmerate und einer festen Tumorlokalisation. Es zeichnet sich durch Einfachheit und hervorragende Reproduzierbarkeit aus. Dieses Modell bietet eine ideale experimentelle Plattform für die Entwicklung intravesikaler Therapien für Blasenkrebs und erleichtert die Weiterentwicklung und Optimierung von Behandlungsstrategien für diese Malignität.

Einleitung

Blasenkrebs stellt eine erhebliche globale Gesundheitsbelastung dar, mit bemerkenswerten geschlechtsspezifischen Unterschieden in Inzidenz und Prognose. Diese Malignität ist durch unterschiedliche molekulare Subtypen gekennzeichnet, die jeweils mit unterschiedlichen pathogenen Signalwegen assoziiert sind. Die molekularen und pathologischen Merkmale unterscheiden sich signifikant zwischen dem nicht-muskelinvasiven Blasenkrebs (NMIBC) und dem muskelinvasiven Blasenkrebs (MIBC)^1,2. NMIBC macht etwa 75 % der Fälle aus, wobei Tumoren transitären epithelialen Ursprungs ohne Metastasierung oder Ausbreitung lokalisiert bleiben. Umgekehrt ist MIBC gekennzeichnet durch die Infiltration von Krebszellen in die Muskelschicht der Blase, begleitet von einem hohen Risiko der Verbreitung, was in der klinischen Praxis häufig eine Zystektomie erforderlich macht³.

In der präklinischen Forschung sind Modelle, die das oberflächliche Stadium der Erkrankung genau abbilden, essentiell für die Evaluierung von medikamentösen Therapien. Die Etablierung eines oberflächlichen Blasenkarzinom-in-situ-Modells ist daher von größter Bedeutung und dient als wichtiges Forschungsinstrument für die Entwicklung klinischer Medikamente und innovativer Instillationstherapien.

Die Entwicklung von orthotopen Blasenkrebsmodellen für murine Patienten stand traditionell vor Herausforderungen. Chemisch induzierte Modelle beginnen oft als oberflächliche Tumore, können sich aber zu invasiven Formen entwickeln, mit einer Variabilität, die ihren Nutzen in groß angelegten Experimenten einschränkt⁴. Traditionelle orthotope Implantationsmodelle, die auf der Injektion von Tumorzellen durch die Blasenwand^{beruhen 5}, haben Schwierigkeiten, oberflächlichen Blasenkrebs originalgetreu zu reproduzieren. Alternative Methoden, einschließlich Schleimhautschädigung in Kombination mit Tumorzellinstillation 6,7,8,9,10, wurden versucht, sind aber durch hohe Mortalitätsraten und niedrige Tumorentnahmeraten eingeschränkt, was ihre breitere Anwendung behindert.

Ziel dieser Studie ist es, eine neue Methode zur Konstruktion eines oberflächlichen Blasenkrebsmodells zu entwickeln, das im Vergleich zu bestehenden Modellen eine höhere Stabilität, eine geringere Mortalität und eine fixierte Tumorpositionierung aufweist. Durch eine genauere Darstellung der Krankheit in ihren frühen Stadien ist das aktuelle Modell in der Lage, die strenge Bewertung präventiver und therapeutischer Interventionen zu verbessern und so die Behandlung von Blasenkrebs voranzutreiben.

Protokoll

Alle tierexperimentellen Protokolle und Verfahren wurden vom Ethical Review Committee for Animal Experimentation der Tianjin Medical University, Tianjin, China, genehmigt (Zulassungsnummer SYXK: 2020-0010). Für diese Studie wurden sechs bis acht Wochen alte weibliche C57BL/6J-Mäuse verwendet. Die Tiere wurden unter kontrollierten Umgebungsbedingungen untergebracht, einschließlich eines 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus, Temperaturen zwischen 21 und 25 °C, einstellbarer Luftfeuchtigkeit zwischen 30 % und 70 % und uneingeschränktem Zugang zu Futter und Wasser, sofern nicht anders angegeben. Die Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Zellen

1. Kulturieren Sie die murine Blasenkrebszelllinie MB49 in vollständigem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), um ein optimales Wachstum zu unterstützen.
2. Halten Sie die Zellkulturen unter Standardbedingungen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂. Aktualisieren Sie das Medium alle 2-3 Tage, um die Gesundheit und Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten.
3. Ernten Sie die Zellen mit einem standardisierten Trypsin-Verdauungsverfahren. Die Zellen nach dem Auftragen von Trypsin und einer kurzen Inkubation vorsichtig aus dem Kulturkolben pipettieren.
4. Zählen Sie die geernteten Zellen mit einem Hämozytometer, um die genaue Zelldichte zu bestimmen. Bereiten Sie eine einzellige Suspension vor, indem Sie die Zellen auf 2 x 10³/μl in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendieren. Bewahren Sie diese Suspension auf Eis auf, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

2. Vorbereitung der Tiere

1. Die Mäuse (5 Mäuse pro Käfig) werden in Gruppen in individuell belüfteten Polycarbonat-Käfigen untergebracht.
2. Lassen Sie die Mäuse vor Beginn der Studie 7 Tage lang akklimatisieren.

3. Generierung von orthotopen Tumormodellen an Tieren

1. Verabreichen Sie den Mäusen eine Anästhesie durch intraperitoneale Injektion mit einer 2,5%igen Lösung von Avertin (gemäß institutionell anerkannten Protokollen).
2. Warten Sie, bis die Mäuse ein angemessenes Anästhesieniveau für die Operation erreicht haben, was durch eine Abnahme der Atemfrequenz mit zunehmender Tiefe, das Fehlen von Augenlid- und Hornhautreflexen, einen verminderten Muskeltonus und Reflexreaktionen und keine Reaktion auf ein Schwanzkneifen angezeigt wird.
3. Positionieren Sie die anästhesierte Maus in Rückenlage, um den Eingriff zu erleichtern.
4. Verwenden Sie einen intravenösen 24-G-Katheter mit entferntem Nadelstilett für die Harnröhrenkatheterisierung. Tragen Sie reichlich Gleitmittel auf den Katheter auf, um Beschwerden zu minimieren und ein reibungsloses Einführen zu erleichtern.
5. Identifizieren Sie die Harnröhre, die sich unmittelbar hinter den Vulvafalten und vor der Vagina befindet, während Sie die Maus in Rückenlage halten.
   1. Beginnen Sie die Katheterisierung, indem Sie sich der Harnröhre in einem 45-Grad-Winkel nähern, um unter dem Schambein zu navigieren. Stellen Sie einen flacheren Winkel ein, um den Katheter durch die Harnröhre und in die Blase zu führen.
6. Vermeiden Sie es, übermäßige Kraft auf den Widerstand auszuüben, da dies zu einer Harnröhren- oder Blasenperforation führen kann. Bestätigen Sie die Position des Katheters im Blasenlumen, indem Sie nach Urin im Katheter suchen.
7. Üben Sie vorsichtig Druck auf den Unterbauch der Maus aus, um den Urinabfluss aus der Blase zu erleichtern. Stellen Sie sicher, dass die Blase vollständig entleert ist, um sich auf die nachfolgenden Schritte des Eingriffs vorzubereiten.
8. Schieben Sie den intravenösen 24-G-Katheter vorsichtig in Richtung des oberen Teils der Blase. Stellen Sie sicher, dass die Spitze des Katheters die Spitze der Blase berührt.
   1. Sobald der Kontakt bestätigt ist, lassen Sie den Katheter los und lassen Sie ihn leicht zurückziehen. Halten Sie den Katheter in einer festen Position relativ zur Maus, um die Stabilität zu gewährleisten und ein Lösen zu verhindern.
9. Führen Sie die modifizierte 34-G-Dosiernadel entlang des 24-G-Katheters ein. Schieben Sie die Nadel vor, bis sie die Spitze der Blase erreicht.
   1. Sobald die Nadel positioniert ist, drehen Sie sie sechsmal, um eine lokalisierte Schleimhautverletzung an der Spitze der Blase zu erzeugen. Ziehen Sie die Nadel nach Abschluss der Drehung vorsichtig entlang des Katheters zurück.
10. Verbinden Sie die 30-G-Dosiernadel mit der Oberseite einer 1-mL-Spritze. Sorgen Sie für eine sichere Verbindung zwischen Nadel und Spritze.
    1. Nach dem Anschließen ziehen Sie die vorbereitete 2 x 10³/μl MB49-Zellsuspension in die Spritze, indem Sie den Kolben vorsichtig zurückziehen. Vergewissern Sie sich, dass die Zellsuspension ohne Luftblasen in die Spritze aspiriert wird.
11. Führen Sie die 30-G-Dosiernadel entlang des 24-G-Katheters ein. Stellen Sie sicher, dass die Nadel richtig ausgerichtet und im Katheter befestigt ist.
    1. Sobald sie positioniert ist, üben Sie Druck auf den Kolben der 1-ml-Spritze aus, um den Inhalt zu injizieren (vorbereitet in Schritt 1). Halten Sie den Kolben 60 s lang konstant unter Druck, um sicherzustellen, dass der Inhalt ohne nennenswerte Volumenreduzierung abgegeben wird.
    2. Ziehen Sie nach 60 s die Spritze und die 30 G Dosiernadel vorsichtig aus dem Katheter zurück.

4. Postoperative Überwachung

1. Legen Sie die betäubte Maus in Rückenlage auf ein Heizkissen, bis der Aufrichtreflex zurückkehrt.
2. Stellen Sie sicher, dass das Tier nicht unbeaufsichtigt gelassen wird, bis es wieder ausreichend bei Bewusstsein ist.
3. Geben Sie das Tier nicht in die Gesellschaft anderer Tiere zurück, bis es sich vollständig erholt hat.

Ergebnisse

Die Wirksamkeit submuköser Injektionen wurde zunächst durch die Verabreichung von Trypanblau beurteilt. Nach der Injektion wurde die Verteilung des Farbstoffs in der submukösen Schicht deutlich sichtbar gemacht, was die präzise und kontrollierte Abgabe der injizierten Substanzen bestätigt (Abbildung 1).

Die Tumorentwicklung wurde akribisch verfolgt. Etwa 14 Tage nach der Implantation wurde eine bemerkenswerte Inzidenz von Hä...

Diskussion

Die Forschung zu Blasenkrebs stützt sich auf Tiermodelle, die sowohl für die Grundlagen- als auch für die angewandte Forschung unverzichtbar sind. Um die Umgebung des Tumorwachstums besser nachzuahmen, bieten orthotope Blasentumormodelle im Vergleich zu subkutanen Tumormodellen einen überlegenen Ansatz¹¹.

Derzeit können orthotope Blasenkrebsmodelle auf der Grundlage von experimentellen Zwecken in zwei Haupttypen eingeteilt werden: ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
34 G dispensing needle	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
30 G dispensing needle	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
Avertin	Sigma-Aldrich LLC	T48402
Trypan blue	Sigma-Aldrich LLC	302643