通过膀胱内细胞给药技术建立小鼠浅表性膀胱癌模型

摘要

该协议描述了一种构建浅表性膀胱癌原位模型的独特方法。

摘要

本研究提出了一种建立高效、精确肿瘤定位的原位鼠膀胱肿瘤模型的创新方法。在仰卧位麻醉雌性 C57BL/6J 小鼠后，将 24 G 静脉注射针头插入膀胱以排空其内容物。然后将 34 G 分配针穿过导管，旋转 5 次以对膀胱圆顶粘膜造成局灶性损伤，随后取出。MB49 细胞悬液被吸出并连接到 30 G 分配针头，该分配针 通过 导管插入膀胱。在压力下将肿瘤细胞粘膜下注射到膀胱中。该技术对小鼠的创伤最小，肿瘤发生率高，肿瘤位置固定。它的特点是简单和出色的可重复性。该模型为开发膀胱癌的膀胱内疗法提供了一个理想的实验平台，促进了这种恶性肿瘤治疗策略的推进和优化。

引言

膀胱癌代表着重大的全球健康负担，在发病率和预后方面存在显着的性别特异性差异。这种恶性肿瘤的特征是不同的分子亚型，每种亚型都与不同的致病途径有关。非肌层浸润性膀胱癌 （NMIBC） 和肌层浸润性膀胱癌 （MIBC） 的分子和病理特征存在显著差异^1,2。NMIBC 约占病例的 75%，以移行性上皮起源的肿瘤为特征，这些肿瘤保持局部，没有转移或扩散。相反，MIBC 的特征是癌细胞浸润到膀胱的肌肉层中，伴有较高的播散风险，在临床实践中经常需要进行膀胱切除术³。

在临床前研究中，准确代表疾病浅表阶段的模型对于评估药物治疗至关重要。因此，浅表性膀胱癌原位模型的建立至关重要，是开发临床药物和创新滴注疗法的关键研究工具。

小鼠原位膀胱癌模型的开发传统上面临挑战。化学诱导模型通常从浅表肿瘤开始，但可能会演变成侵袭性形式，其可变性限制了它们在大规模实验中的实用性⁴。传统的原位植入模型依赖于通过膀胱壁⁵ 注射肿瘤细胞，难以忠实地再现浅表性膀胱癌。已经尝试了替代方法，包括粘膜损伤联合肿瘤细胞滴注 6,7,8,9,10，但受到高死亡率和低肿瘤服用率的限制，阻碍了其更广泛的应用。

本研究旨在开发一种构建浅表性膀胱癌模型的新方法，与现有模型相比，该方法表现出更高的稳定性、更低的死亡率和固定的肿瘤定位。通过在疾病的早期阶段更精确地表示疾病，目前的模型有望加强对预防和治疗干预措施的严格评估，从而推进膀胱癌的治疗。

研究方案

所有动物实验方案和程序均已获得中国天津医科大学动物实验伦理审查委员会的批准（批准号 SYXK：2020-0010）。本研究使用 6 至 8 周龄雌性 C57BL/6J 小鼠。动物被饲养在受控的环境条件下，包括 12 小时的明暗循环、21-25 °C 的温度范围、30%-70% 之间的可调湿度水平以及不受限制地获取食物和水，除非另有说明。所用试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 细胞制备

1. 在补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 的 Dulbecco 改良 Eagle 完全培养基 （DMEM） 中培养小鼠膀胱癌细胞系 MB49 以支持最佳生长。
2. 将细胞培养物保持在 37 °C 的标准条件下，在含 5% CO₂ 的加湿培养箱中。每 2-3 天刷新一次培养基，以确保细胞健康和活力。
3. 使用标准化胰蛋白酶消化程序收获细胞。轻轻移液，在涂上胰蛋白酶并短暂孵育后，将细胞从培养瓶中移出。
4. 使用血细胞计数器对收获的细胞进行计数，以确定确切的细胞密度。通过在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中将细胞重悬至 2 x 10³/μL 来制备单细胞悬液。将此悬浮液保存在冰上以保持细胞活力。

2. 动物准备

1. 将小鼠（每个笼 5 只小鼠）组饲养在单独通风的聚碳酸酯笼中。
2. 在研究开始前让小鼠适应 7 天。

3. 动物原位肿瘤模型生成

1. 使用 2.5% 的 Avertin 溶液（遵循机构批准的方案）， 通过 腹膜内注射对小鼠进行麻醉。
2. 等到小鼠达到适当的手术麻醉水平，如呼吸频率降低而深度增加、眼睑和角膜反射消失、肌肉张力和反射反应降低以及对尾部挤压没有反应所示。
3. 将麻醉的鼠标置于仰卧位以促进手术。
4. 使用 24 G 静脉导管，去除针头管心针进行尿道导管插入术。对导管进行充分润滑，以尽量减少不适并促进顺利插入。
5. 确定位于外阴皱襞后方和阴道前方的尿道，同时保持鼠标仰卧位。
   1. 通过以 45 度角接近尿道以在耻骨下方导航来开始导管插入术。调整到更浅的角度，引导导管穿过尿道进入膀胱。
6. 避免对阻力施加过大的力，因为这会导致尿道或膀胱穿孔。通过检查导管内的尿液来确认导管在膀胱腔内的位置。
7. 轻轻地对小鼠的下腹部施加压力，以促进尿液从膀胱中排出。确保膀胱完全排空，为手术的后续步骤做准备。
8. 轻轻地将 24 G 静脉导管推向膀胱顶部。确保导管尖端与膀胱的尖端接触。
   1. 确认接触后，松开导管，使其略微缩回。将导管保持在相对于鼠标的固定位置，以确保稳定性并防止移位。
9. 将改良的 34 G 分配针沿 24 G 导管插入。推进针头，直到它到达气囊的顶部。
   1. 定位后，将针头旋转六次，在膀胱顶端造成局部粘膜损伤。完成旋转后，小心地沿着导管拔出针头。
10. 将 30 G 分液针头连接到 1 mL 注射器的顶部。确保针头和注射器之间的连接牢固。
    1. 连接后，轻轻拉回柱塞，将预先准备好的 2 x 10³/μL MB49 细胞悬液吸入注射器中。确认细胞悬液被吸入注射器中，没有任何气泡。
11. 将 30 G 分配针沿 24 G 导管插入。确保针头正确对齐并固定在导管内。
    1. 定位后，对 1 mL 注射器的柱塞施加压力以注入内容物（在步骤 1 中制备）。在柱塞上保持稳定的压力 60 秒，以确保内容物的输送不会显着减少体积。
    2. 60 秒后，小心地从导管中取出注射器和 30 G 分配针。

4. 术后监测

1. 将麻醉的鼠标仰卧在加热垫上，直到扶正反射恢复。
2. 确保动物在恢复足够的意识之前不要无人看管。
3. 在动物完全康复之前，不要将动物送回其他动物的陪伴下。

结果

粘膜下注射的疗效最初通过台盼蓝的给药进行评估。注射后，染料在粘膜下层内的分布清晰可见，证实了注射物质的精确和受控输送（图 1）。

对肿瘤的发展进行了仔细跟踪。植入后约 14 天，观察到血尿的显着发生率，这是提示膀胱肿瘤的严重症状。肿瘤被确定为牢固地建立在膀胱的粘膜下层内。这些肿瘤的早期生长模式以扩?...

讨论

膀胱癌的研究依赖于动物模型，这对于基础和应用研究都是必不可少的。为了更好地模拟肿瘤生长环境，与皮下肿瘤模型相比，原位膀胱肿瘤模型提供了一种更好的方法¹¹。

目前，根据实验目的，原位膀胱癌模型可分为两种主要类型：利用免疫缺陷小鼠的模型，例如患者来源的异种移植 （PDX） 模型¹ 和细胞系来源?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
34 G dispensing needle	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
30 G dispensing needle	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
Avertin	Sigma-Aldrich LLC	T48402
Trypan blue	Sigma-Aldrich LLC	302643