Establecimiento de un modelo de cáncer de vejiga superficial murino mediante una técnica de administración de células intravesicales

Resumen

Este protocolo describe un método único para construir un modelo ortotópico del cáncer de vejiga superficial.

Resumen

Este estudio presenta un método innovador para establecer un modelo ortotópico de tumor de vejiga murina con alta eficiencia y localización precisa del tumor. Después de anestesiar a ratones hembra C57BL/6J en posición supina, se inserta una aguja intravenosa de 24 G en la vejiga para evacuar su contenido. A continuación, se introduce una aguja dispensadora de 34 G a través del catéter, se gira cinco veces para crear una lesión focal en la mucosa de la cúpula vesical y, posteriormente, se retira. La suspensión celular MB49 se aspira y se conecta a una aguja dispensadora de 30 G, que se inserta en la vejiga a través del catéter. Las células tumorales se inyectan por vía submucosa en la vejiga bajo presión. Esta técnica da como resultado un trauma mínimo en los ratones, una alta tasa de toma de tumores y una ubicación fija del tumor. Se caracteriza por su simplicidad y excelente reproducibilidad. Este modelo proporciona una plataforma experimental ideal para el desarrollo de terapias intravesicales para el cáncer de vejiga, facilitando el avance y la optimización de las estrategias de tratamiento para esta neoplasia maligna.

Introducción

El cáncer de vejiga representa una importante carga para la salud mundial, con notables disparidades específicas de sexo en la incidencia y el pronóstico. Esta neoplasia maligna se caracteriza por distintos subtipos moleculares, cada uno asociado con diversas vías patogénicas. Las características moleculares y patológicas difieren significativamente entre el cáncer de vejiga no músculo invasivo (NMIBC) y el cáncer de vejiga músculo-invasivo (MIBC)^1,2. El NMIBC representa alrededor del 75 % de los casos, con tumores de origen epitelial transicional que permanecen localizados sin metástasis ni diseminación. Por el contrario, el MIBC se caracteriza por la infiltración de células cancerosas en la capa muscular de la vejiga, acompañada de un alto riesgo de diseminación, lo que frecuentemente requiere cistectomía en la práctica clínica³.

En la investigación preclínica, los modelos que representan con precisión la etapa superficial de la enfermedad son esenciales para evaluar las terapias farmacológicas. Por lo tanto, el establecimiento de un modelo de carcinoma vesical superficial in situ es de suma importancia, ya que sirve como una herramienta de investigación crítica para el desarrollo de fármacos clínicos y terapias de instilación innovadoras.

El desarrollo de modelos de cáncer de vejiga ortotópico murino se ha enfrentado tradicionalmente a desafíos. Los modelos inducidos químicamente a menudo comienzan como tumores superficiales, pero pueden evolucionar a formas invasivas, con una variabilidad que limita su utilidad en experimentos a gran escala⁴. Los modelos tradicionales de implantación ortotópica, que se basan en la inyección de células tumorales a través de la pared vesical⁵, tienen dificultades para reproducir fielmente el cáncer de vejiga superficial. Se han intentado métodos alternativos, como la lesión de la mucosa combinada con la instilación de células tumorales 6,7,8,9,10, pero se ven limitados por las altas tasas de mortalidad y las bajas tasas de extracción tumoral, lo que dificulta su aplicación más amplia.

Este estudio tiene como objetivo desarrollar un nuevo método para construir un modelo de cáncer de vejiga superficial que demuestre una mayor estabilidad, menor mortalidad y posicionamiento fijo del tumor en comparación con los modelos existentes. Al lograr una representación más precisa de la enfermedad en sus primeras etapas, el modelo actual está preparado para mejorar la evaluación rigurosa de las intervenciones preventivas y terapéuticas, avanzando así en el tratamiento del cáncer de vejiga.

Protocolo

Todos los protocolos y procedimientos de experimentación con animales fueron aprobados por el Comité de Revisión Ética para la Experimentación Animal de la Universidad Médica de Tianjin, Tianjin, China (número de aprobación SYXK: 2020-0010). Para este estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6J de seis a ocho semanas de edad. Los animales se alojaron en condiciones ambientales controladas, incluido un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas, temperaturas que oscilaban entre 21 y 25 °C, niveles de humedad ajustables entre el 30% y el 70% y acceso sin restricciones a alimentos y agua, a menos que se especificara lo contrario. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de la célula

1. Cultive la línea celular de cáncer de vejiga murina MB49 en el medio Eagle Modificado (DMEM) completo de Dulbecco, suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) para apoyar un crecimiento óptimo.
2. Mantener los cultivos celulares en condiciones estándar a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂. Actualice los medios cada 2-3 días para garantizar la salud y la viabilidad de las células.
3. Recolecta las células utilizando un procedimiento estandarizado de digestión de tripsina. Pipetear suavemente para desalojar las células del matraz de cultivo después de aplicar tripsina e incubar durante un breve período.
4. Cuente las células recolectadas con un hemocitómetro para determinar la densidad celular exacta. Prepare una suspensión unicelular resuspendiendo las células a 2 x 10³/μL en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Mantenga esta suspensión en hielo para mantener la viabilidad de la célula.

2. Preparación animal

1. El grupo aloja a los ratones (5 ratones por jaula) en jaulas de policarbonato ventiladas individualmente.
2. Permita que los ratones se aclimaten durante 7 días antes del inicio del estudio.

3. Generación de modelos de tumores ortotópicos animales

1. Administrar la anestesia a los ratones mediante inyección intraperitoneal utilizando una solución de Avertin al 2,5% (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).
2. Espere hasta que los ratones alcancen un nivel adecuado de anestesia para la cirugía, como lo indica una disminución de la frecuencia respiratoria con un aumento en la profundidad, la ausencia de reflejos palpebrales y corneales, disminución del tono muscular y las respuestas reflejas, y ninguna reacción a un pellizco de cola.
3. Coloque el ratón anestesiado en posición supina para facilitar el procedimiento.
4. Utilice un catéter intravenoso de 24 G con el estilete de la aguja retirado para el procedimiento de cateterismo uretral. Aplique abundante lubricación al catéter para minimizar las molestias y facilitar una inserción suave.
5. Identificar la uretra, situada inmediatamente posterior a los pliegues vulvares y anterior a la vagina, manteniendo al ratón en posición supina.
   1. Comience el cateterismo acercándose a la uretra en un ángulo de 45 grados para navegar por debajo del hueso púbico. Ajústelo a un ángulo más poco profundo para guiar el catéter a través de la uretra y hacia la vejiga.
6. Evite aplicar una fuerza excesiva contra la resistencia, ya que esto puede provocar la perforación de la uretra o la vejiga. Confirme la ubicación del catéter dentro de la luz de la vejiga verificando si hay orina dentro del catéter.
7. Aplique suavemente presión en la parte inferior del abdomen del ratón para facilitar el drenaje de la orina de la vejiga. Asegúrese de que la vejiga esté completamente vacía para prepararse para los pasos posteriores del procedimiento.
8. Empuje suavemente el catéter intravenoso de 24 g hacia la parte superior de la vejiga. Asegúrese de que la punta del catéter haga contacto con el ápice de la vejiga.
   1. Una vez confirmado el contacto, suelte el catéter, permitiendo que se retraiga ligeramente. Mantenga el catéter en una posición fija en relación con el ratón para garantizar la estabilidad y evitar el desplazamiento.
9. Inserte la aguja dispensadora modificada de 34 G a lo largo del catéter de 24 G. Haga avanzar la aguja hasta que llegue a la parte superior de la vejiga.
   1. Una vez colocada, gire la aguja seis veces para crear una lesión mucosa localizada en el ápice de la vejiga. Después de completar la rotación, retire con cuidado la aguja a lo largo del catéter.
10. Conecte la aguja dispensadora de 30 g a la parte superior de una jeringa de 1 ml. Asegúrese de que haya una conexión segura entre la aguja y la jeringa.
    1. Una vez conectada, introduzca la suspensión de celdas MB49 de 2 x 10 ³/μL preparada previamente en la jeringa tirando suavemente del émbolo hacia atrás. Verifique que la suspensión de celdas se aspire en la jeringa sin burbujas de aire.
11. Inserte la aguja dosificadora de 30 G a lo largo del catéter de 24 G. Asegúrese de que la aguja esté correctamente alineada y asegurada dentro del catéter.
    1. Una vez colocado, aplique presión al émbolo de la jeringa de 1 mL para inyectar el contenido (preparado en el paso 1). Mantenga una presión constante sobre el émbolo durante 60 s para garantizar que el contenido se entregue sin una reducción significativa del volumen.
    2. Después de 60 s, retire con cuidado la jeringa y la aguja dispensadora de 30 g del catéter.

4. Seguimiento postoperatorio

1. Coloque el ratón anestesiado en posición supina sobre una almohadilla térmica hasta que regrese el reflejo de enderezamiento.
2. Asegúrese de que el animal no quede desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente.
3. No devuelva el animal a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo.

Resultados

La eficacia de las inyecciones submucosas se evaluó inicialmente mediante la administración de Trypan Blue. Después de la inyección, se visualizó claramente la distribución del colorante dentro de la capa submucosa, lo que confirmó la administración precisa y controlada de las sustancias inyectadas (Figura 1).

El desarrollo tumoral se rastreó meticulosamente. Aproximadamente 14 días después de la implantación, se obser...

Discusión

La investigación sobre el cáncer de vejiga se basa en modelos animales, que son indispensables tanto para la investigación básica como para la aplicada. Para imitar mejor el entorno de crecimiento tumoral, los modelos de tumores ortotópicos de vejiga proporcionan un enfoque superior en comparación con los modelos de tumores subcutáneos¹¹.

En la actualidad, los modelos ortotópicos de cáncer de vejiga se pueden clasificar con fin...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
34 G dispensing needle	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
30 G dispensing needle	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
Avertin	Sigma-Aldrich LLC	T48402
Trypan blue	Sigma-Aldrich LLC	302643