صياغة المواد النانوية القائمة على الزنك باستخدام مستخلص لحاء Eucommia ulmoides وقدرتها على التئام الجروح

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لتصنيع الجسيمات النانوية لأكسيد الزنك (ZnO) باستخدام المستخلص المائي الغني بالبولي إيزوبرين الذي تم الحصول عليه من لحاء شجرة Eucommia ulmoides . تم تقييم إمكانات التئام الجروح التي أظهرتها جسيمات ZnO النانوية المركبة على الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) باستخدام مقايسة الخدش ، وهي طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة وفعالة.

Abstract

يعمل المستخلص المائي من لحاء Eucommia ulmoides كمصدر غني للمركبات النشطة بيولوجيا مع العديد من الفوائد الصحية. يهدف البروتوكول هنا إلى استكشاف تحضير الجسيمات النانوية لأكسيد الزنك (ZnO) باستخدام المستخلص المائي الغني بالبولي إيزوبرين بوساطة اللحاء Eucommia ulmoides . وفي الوقت نفسه ، يرتبط البروتوكول المقترح بإعداد مواد التئام الجروح عن طريق تسهيل العملية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم إمكانات التئام الجروح للجسيمات النانوية المركبة (Eu-ZnO-NPs) باستخدام اختبار خدش بسيط على طبقة أحادية للخلية البطانية للوريد السري البشري (HUVEC). بعد 24 ساعة من العلاج ب Eu-ZnO-NPs ، تم تقييم تكاثر الخلايا وهجرة خلايا HUVEC. في نهاية الدراسة ، لوحظ تكاثر الخلايا وهجرتها في طبقة أحادية مخدوشة معالجة بتركيزات مختلفة من Eu-ZnO-NPs ، بينما لوحظت معدلات هجرة وتكاثر الخلايا الضعيفة في الخلايا الضابطة. من بين التركيزات المختارة ، أظهرت 20 ميكروغرام / مل من المواد النانوية Eu-ZnO هجرة أفضل للخلايا وإمكانية معززة لالتئام الجروح.

Introduction

ثبت أن النباتات الطبية والمركبات المشتقة من النباتات تظهر العديد من الفوائد الصحية¹. أفادت منظمة الصحة العالمية (WHO) أن 80٪ من سكان العالم يعتمدون على النباتات الطبية التقليدية في الرعاية الصحية الأولية. الصين معروفة جيدا وشعبية لممارسات الطب الصيني التقليدي (TCM). تم الإبلاغ عن الأعشاب الطبية الصينية لعلاج الأمراض المختلفة واستخدامها لإمكاناتها البيولوجية. تعمل النباتات الطبية كخزانات للمركبات النشطة بيولوجيا والأدوار العلاجية المتعددة. كما تم استخدام النباتات الطبية لعلاج الجروح. هناك عدة أنواع من الأساليب المطبقة لعلاج الجروح^{المزمنة 2}. كشف تحقيق حديث أن النباتات الطبية شاركت في عملية التئام الجروح من خلال توفير ظروف مواتية للشفاء ، خالية من الالتهابات ، وتجديد الأنسجة^{المثبتة 3}. وفي الوقت نفسه ، يمكن أن تساعد الخصائص المضادة للبكتيريا والفطريات للمركبات النشطة بيولوجيا الموجودة في النباتات الطبية في علاج الجروح وتثبيت كفاءة التئام^{الجروح 4}.

تكتسب المواد النانوية القائمة على المعادن الاهتمام بسبب خصائصها المتوافقة حيويا والقابلة للتحلل. Eucommia ulmoides ، المعروف باسم شجرة المطاط الصينية ، هي نوع محلي في الصين. تستخدم أوراق ولحاء الشجرة في الممارسات الطبية. الأهم من ذلك ، تمت زراعة الأنواع النباتية في المقاطعات الوسطى والغربية من الصين⁵. أفاد Peng et ^al.6أن الأوراق واللحاء والزهور السداة كانت صالحة للأكل مع إمكانات علاجية. بالإضافة إلى ذلك ، تعمل E. ulmoides كأفضل مصدر للقشور ، والفينيل بروبانويدات ، والقزحية ، والفلافونويد ، والأحماض الأمينية ، والعناصر النزرة. علاوة على ذلك ، تم استخدام اللحاء في العديد من التطبيقات الطبية الحيوية مثل التحكم في ضغط الدم ، وخفض الدهون ، وتعزيز مضادات هشاشة العظام ونشاط نقص السكر^{في الدم 7}. ومن ثم ، مما لا شك فيه ، فقد ثبت أن مستخلص لحاء E. ulmoides له تاريخ طويل في الطب الصيني التقليدي. أشارت التقارير السابقة إلى أن بولي إيزوبرين البوليمر الطبيعي غني بلحاء Eucommia ulmoides⁸. بناء على المعلومات الواردة أعلاه ، يهدف العمل الحالي إلى تصنيع مواد نانوية باستخدام مستخلصات لحاء Eucommia ulmoides . يعد مزيج الزنك مع مستخلص اللحاء خيارا جذابا لتحضير المواد النانوية. بشكل عام ، كان الهدف النهائي من هذا التحقيق هو تصنيع مادة نانوية هجينة جديدة لتطبيقات التئام الجروح.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: قبل تحضير المستخلص ، تم غسل مادة اللحاء التي تم الحصول عليها مرتين باستخدام الماء منزوع الأيونات وتجفيفها في مكان مظلل. تم تخزين اللحاء المجفف في الظل في حاوية محكمة الإغلاق.

1. تحضير مستخلص لحاء Eucommia ulmoides

1. يقطع اللحاء الذي تم جمعه من شجرة Eucommia ulmoides إلى قطع صغيرة باستخدام المقص.
2. اغسل مواد اللحاء المفرومة مرتين بالماء المقطر المزدوج.
3. جفف قطع اللحاء تحت 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في ظروف مظللة.
   1. اضبط مدة عملية التجفيف بناء على كمية اللحاء المستخدمة في الدراسة. تأكد من تجفيف اللحاء تماما قبل تقطيع اللحاء إلى قطع صغيرة. تجنب أشعة الشمس المباشرة.
4. انقل 20 جم من اللحاء المجفف بالظل إلى قارورة مخروطية تحتوي على 220 مل من الماء المقطر المزدوج المعقم وسخنها على حرارة 130 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
   1. يتغير لون محلول التفاعل إلى الأصفر الفاتح. تحدث التغييرات في لون المحلول بعد 10 دقائق. اترك المحلول يسخن لمدة 10 دقائق أخرى. اضبط حجم الماء المقطر المزدوج بناء على كمية العينة.
5. قم بتخزين المستخلص الخام المحتوي على البولي إيزوبرين عند 4 درجات مئوية لاستخدامه مرة أخرى. يشير تكوين هيكل يشبه الخيط إلى وجود مادة البولي إيزوبرين في المستخلصات.

2. التخليق الحيوي لجسيمات ZnO النانوية بوساطة اللحاء

1. أضف 1 م من نيترات الزنك ثنائي هيدرات الزنك (NO₃) ₂ إلى 50 مل من الماء منزوع الأيونات في قارورة مخروطية سعة 500 مل. يقلب باستمرار باستخدام التقليب المغناطيسي (60 دورة في الدقيقة). يستغرق الزنك (NO₃) ₂ 30 دقيقة ليذوب تماما.
2. أضف 15 مل من مستخلص لحاء E. ulmoides بالتنقيط إلى 20 مل من محلول ثنائي هيدرات نترات الزنك 1 M (Zn (NO₃) ₂).
3. ضع خليط التفاعل المغطى على محرك مغناطيسي ، وقم بتشغيل النمام ، وقم بالدوران عند (60 دورة في الدقيقة) لمدة 3 ساعات.
4. أضف 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم هيدروكسيد الصوديوم (3 مل) محلول قطريا إلى خليط التفاعل لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 9. أضف هيدروكسيد الصوديوم حتى يتحول خليط المحلول إلى اللون الأبيض اللبني ولا يزيد الرقم الهيدروجيني عن 9. يصبح المحلول لونه أبيض حليبي عندما تتشكل جسيمات ZnO النانوية.
   1. قد يختلف تحضير 1 متر من نيترات الزنك ثنائي هيدرات الزنك (NO₃)₂ حجم محلول بناء على الاحتياجات التجريبية. تأكد من استخدام مستخلصات اللحاء الطازجة. إذا تجاوز الرقم الهيدروجيني 10 ، فسيؤدي ذلك إلى تراكم الجسيمات النانوية.
5. انقل Eu-ZnO-NPs المركبة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وقم بطرده عند 100 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: يمكن تجنب الشوائب عن طريق الغسيل الفوري.
6. اجمع Eu-ZnO-NPs المغسولة في طبق زجاجي وجففها عند 45-50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في فرن الهواء الساخن.
   ملاحظة: إذا تم الاحتفاظ ب Eu-ZnO-NPs لأكثر من 30 دقيقة ، فقد يؤثر ذلك على الطبيعة الفيزيائية والكيميائية للجسيمات النانوية

3. تأكيد الحجم باستخدام TEM

1. قم بإعداد 1 مجم / مل من الجسيمات النانوية في DDH₂O وقم بتحميل 5 ميكرولتر من عينة Eu-ZnO-NP في الشبكة النحاسية وانتظر حتى تجف تماما. دوامة العينة قبل التحميل على الشبكة النحاسية.
2. قم بتحميل الشبكة النحاسية التي تحتوي على Eu-ZnO-NPs على حامل عينة TEM واحصل على صور بتكبير 50x و 100x.
   ملاحظة: يجب التقاط الشبكات باستخدام الملقط خلال هذه الخطوة.

4. تقييم السمية الخلوية

1. البذور 1 × 10⁴ HUVECs في كل بئر من صفيحة 96 بئر وضعها في حاضنة 5٪ CO₂ 37 °C.
2. أضف 10 ميكرولتر بتركيزات مختلفة 0 و 10 و 20 و 30 و 40 و 50 ميكروغرام / مل من Eu-ZnO-NPs في الخلايا المتقاربة بنسبة 90٪ واحتضانها لمدة 24 ساعة.
3. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسط القديم دون إزعاج الخلايا ، وأضف 10 ميكرولتر من محلول CCK-8 إلى كل بئر يحتوي على 90 ميكرولتر من وسط DMEM الطازج ، واحتضنه في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 5٪ 2} ، 37 درجة مئوية.
4. قم بقياس امتصاص الخلايا المعالجة بمحلول CCK8 عند 450 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
   ملاحظة: تم قياس الامتصاص على الفور في غضون 15 دقيقة لتجنب التغيرات في الامتصاص.

5. تحضير خلايا HUVEC لمقايسة الخدش

1. زرع كمية مناسبة (1 × 10⁵) من HUVECs في 12 صفيحة استزراع آبار تحتوي على وسط النسر المعدل من Dulbecco مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بكتيريا بقرية واحتضانها في حاضنة 5٪ CO₂ 37 °C.
   1. قبل إجراء فحص الخدش ، تحقق من التقاء باستخدام المجهر المقلوب.
      ملاحظة: لإجراء فحص الخدش ، سيتم استخدام 6 ألواح بئر أو 12 لوحة بناء على المتطلبات ، وستختلف كثافة الخلية باختلاف لوحات الاستزراع. يعد استخدام 70٪ -80٪ من الخلايا المتجانسة مثاليا ويوصى به لفحص الخدش. قد يختلف حجم وسيط DMEM بناء على لوحات الاستزراع المستخدمة في الدراسة. على سبيل المثال ، تتطلب 6 ألواح آبار 1-1.5 مل من وسط الاستزراع ، و 12 لوحة بئر تتطلب 0.5-1.0 مل من وسط النمو.
2. قم بعمل خدش برفق باستخدام طرف ماصة معقم سعة 200 ميكرولتر في الجرح التمثيلي بعرض جرح يبلغ 200 ميكرومتر.
3. تأكد من أن الطرف المستخدم في عمل خدوش على طبقة أحادية الخلية يتلامس مع سطح الخلايا.
   ملاحظة: في كل مرة يتم فيها إجراء خدش ، استخدم الطرف المعقم.
4. قم بإزالة الوسط الكامل واغسل الطبقة الأحادية HUVEC باستخدام 1 مل من 1x PBS لإزالة الخلايا المنفصلة.
   ملاحظة: تأكد من إزالة الخلايا أحادية الطبقة المنفصلة تماما من الآبار المعنية. تأكد من عدم حدوث أي ضرر في المنطقة الناتجة عن الجرح.
5. لتقييم إمكانات التئام الجروح لمركبات Eu-ZnO-NPs المركبة ، أضف تركيزات 0 (تحكم) و 10 و 20 ميكروغرام / مل من الجسيمات النانوية Eu-ZnO جنبا إلى جنب مع وسط كامل مع 10٪ FBS في الآبار. حافظ على الألواح التجريبية عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 5٪.}
   ملاحظة: لا تزعج طبقة خلية أحادية اللون أثناء إضافة الوسط الجديد الكامل. تأكد من بقاء الخلايا أحادية الطبقة دون إزعاج أثناء الحضانة.
6. احصل على صورة مجهرية في 0 ساعة و 24 ساعة باستخدام مجهر مقلوب. استخدم أداة التعليقات التوضيحية لقياس إغلاق الجرح في فترات زمنية مختلفة.
   1. احسب النسبة المئوية لإغلاق الجرح باستخدام الصيغة التالية: إغلاق الجرح (٪) = [(هجرة الخلايا (بالميكرومتر) عند 0 ساعة - هجرة الخلايا (بالميكرومتر) عند 24 ساعة) / هجرة الخلايا (بالميكرومتر) عند 0 ساعة] × 100.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يهدف هذا البحث إلى تصنيع الجسيمات النانوية باستخدام لحاء شجرة Eucommia ulmoides . تم تجفيف مادة اللحاء تماما في بيئة مظللة (الشكل 1). تم استخدام مواد اللحاء لتحضير المستخلص الخام المائي بالماء الساخن عن طريق تسخين العينات عند 130 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قد يؤد?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ال E. ulmoides لحاء, ويعتقد أن البذور, والأوراق تظهر العديد من الفوائد الصحية. أظهرت نتائجنا أن تخليق الجسيمات النانوية EU-ZnO تم تحقيقه باستخدام نهج بسيط وفعال من حيث التكلفة. تم استخدام المستخلص المائي لتصنيع الجسيمات النانوية. قد يتسبب تسخين مادة اللحاء في درجات حرارة عا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plate	NEST	703011	Used for cell culture and assay
Centrifuge	SCILOGEX	SC1406	Used to separate the nanoparticles from the colloidal mixture
Centrifuge Tube – 15 mL	BIOFIL	CFT-312150	To centrifuge the synthesized solution
Centrifuge tube – 5 mL	Biosharp	BS-50-CM-S	To store the nanoparticles
CO2 incubator	Thermo scientific	3010	To culture the HUVEC cells
Denoised water	Millipore	Not applicable	For preparation of the extract
DMEM medium	Cytiva	SH30243.01	Used for cell culture work
Funnel	Thermo scientific	42600060	To hold the filter paper during the filtration
Glass beakers	Borosilicate	1102-50	Used to prepare the aqueous extract
Hot air oven	Genetimes	Not Applicable	Used to dry the nanoparticles and collect in the powder form
Magnetic stirrer	KYLIN-BELL	GL-5250-A	Used for nanoparticles synthesis
Microscope	Nikon Eclipse	Ts2	Used to take microphotographs
Petri dish	NEST	753001	Used to collect the nanoparticles
Pipette 1 mL	Lab Science	YEA17AD0055580	To take/add the specific volume of solution/extract
Pipette tips 1 mL	SAINING	3014200-T	To take/add the specific volume of solution/extract
PTFE Magnetic Mixer Stir Bars	LAN RAN	Not applicable	Used for nanomaterial synthesis process
Sodium hydroxide	Sigma Alrich	71690	Used to adjust pH during the synthesis
Stainless Scissor	Deli	6034	Used for chopping the bark materials
T25 tissue culture flask	NEST	707001	Used to maintain the cells
Weighing Balance	Radwag	AS220R2	Used to weigh the chemicals
Whatman filter paper No.1	Newstar	GB/T1914-2017	Used to filter the extract for synthesis
Zinc nitrate	Sigma Alrich	13778-30-8	Used as precursor for the nanoparticle’s synthesis