ניסוח ננו-חומרים מבוססי אבץ באמצעות תמצית קליפת Eucommia ulmoides ופוטנציאל ריפוי הפצעים שלהם

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסינתזה של ננו-חלקיקי תחמוצת האבץ (ZnO) באמצעות תמצית מימית עשירה בפוליאיזופרן המתקבלת מקליפת עץ Eucommia ulmoides . פוטנציאל ריפוי הפצעים המוצג על ידי ננו-חלקיקי ZnO המסונתזים על תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVECs) הוערך באמצעות בדיקת שריטות, שיטה פשוטה, חסכונית ויעילה.

Abstract

התמצית המימית מקליפת Eucommia ulmoides משמשת כמקור עשיר לתרכובות ביו-אקטיביות עם יתרונות בריאותיים רבים. הפרוטוקול כאן נועד לחקור את ההכנה של ננו-חלקיקי תחמוצת אבץ (ZnO) באמצעות תמצית מימית עשירה בפוליאיזופרן בתיווך קליפת עץ Eucommia ulmoides . בינתיים, הפרוטוקול המוצע קשור להכנת חומר לריפוי פצעים על ידי הקלת התהליך. בנוסף, פוטנציאל ריפוי הפצעים של הננו-חלקיקים המסונתזים (Eu-ZnO-NPs) הוערך באמצעות בדיקת שריטות פשוטה על חד-שכבת תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVEC). לאחר 24 שעות של טיפול ב-Eu-ZnO-NPs, הוערכה התפשטות התאים והנדידה של תאי HUVEC. בסוף המחקר נצפו התפשטות ונדידת תאים בשכבה חד-שכבתית שרוטה שטופלה בריכוזים שונים של Eu-ZnO-NPs, בעוד ששיעורי נדידה והתפשטות תאים גרועים נצפו בתאי ביקורת. מבין הריכוזים שנבחרו, 20 מיקרוגרם/מ"ל ננו-חומרים Eu-ZnO הראו נדידת תאים טובה יותר ופוטנציאל ריפוי פצעים משופר.

Introduction

צמחי מרפא ותרכובות שמקורן בצמחים הוכחו כבעלי יתרונות בריאותיים רבים¹. ארגון הבריאות העולמי (WHO) דיווח כי 80% מאוכלוסיית העולם תלויה בצמחי מרפא מסורתיים לטיפול רפואי ראשוני. סין מוכרת ופופולרית בזכות שיטות הרפואה הסינית המסורתית שלה. צמחי מרפא סיניים דווחו כמטפלים במחלות שונות ומנוצלים לפוטנציאל הביולוגי שלהם. צמחי מרפא משמשים כמאגרים לתרכובות ביו-אקטיביות ותפקידים טיפוליים מרובים. צמחי מרפא שימשו גם לטיפול בפצעים. ישנם מספר סוגים של גישות המיושמות לטיפול בפצעים כרוניים². חקירה שנערכה לאחרונה גילתה כי צמחי מרפא היו מעורבים בתהליך ריפוי הפצעים על ידי מתן תנאים נוחים לריפוי, ללא זיהומים, והידוק התחדשות רקמות³. בינתיים, התכונות האנטיבקטריאליות והאנטי פטרייתיות של תרכובות ביו-אקטיביות הקיימות בצמחי מרפא יכולות לסייע בריפוי פצעים ולהדק את יעילות ריפוי הפצעים⁴.

ננו-חומרים מבוססי מתכת זוכים לתשומת לב בשל תכונותיהם התואמות ביולוגית והמתכלות. Eucommia ulmoides, המכונה בדרך כלל עץ הגומי הסיני, הוא מין מקומי של סין. העלים והקליפה של העץ משמשים בשיטות רפואיות. והכי חשוב, מיני הצמחים טופחו במחוזות המרכזיים והמערביים של סין⁵. Peng et ^al.6דיווחו כי עלים, קליפות ופרחים אבקניים היו אכילים עם פוטנציאל טיפולי. בנוסף, E. ulmoides משמשים כמקור הטוב ביותר לליגננים, פנילפרופנואידים, אירידואידים, פלבנואידים, חומצות אמינו ויסודות קורט. יתר על כן, הקליפה שימשה ליישומים ביו-רפואיים שונים כגון שליטה בלחץ הדם, הורדת שומן וקידום אנטי-אוסטרופורוזיס ופעילות היפוגליקמית⁷. לפיכך, ללא ספק, הוכח כי לתמצית קליפת E . ulmoides יש היסטוריה ארוכה ברפואה הסינית המסורתית. דיווחים קודמים הציעו כי פולימר פוליאיזופרן טבעי עשיר בקליפות של Eucommia ulmoides⁸. בהתבסס על המידע לעיל, העבודה הנוכחית שואפת לייצר ננו-חומרים באמצעות תמציות קליפת Eucommia ulmoides . השילוב של אבץ עם תמצית קליפת עץ הוא בחירה אטרקטיבית להכנת ננו-חומרים. בסך הכל, המטרה הסופית של המחקר הנוכחי הייתה לייצר ננו-חומר היברידי חדש ליישומי ריפוי פצעים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: לפני הכנת התמצית, חומר הקליפה שהתקבל נשטף פעמיים במים נטולי יונים ויובש במקום מוצל. הקליפות המיובשות בצל אוחסנו במיכל אטום.

1. הכנת תמצית קליפת עץ Eucommia ulmoides

1. קוצצים את הקליפה שנאספה מעץ Eucommia ulmoides לחתיכות קטנות בעזרת מספריים.
2. שוטפים את חומרי הקליפה הקצוצים פעמיים במים מזוקקים כפולים.
3. יבש את חתיכות הקליפה מתחת ל-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות בתנאים מוצלים.
   1. התאם את משך תהליך הייבוש על סמך כמות הקליפה המשמשת למחקר. ודא שהקליפות מיובשות לחלוטין לפני שחותכים את הקליפות לחתיכות קטנות. יש להימנע מאור שמש ישיר.
4. מעבירים 20 גרם קליפות מיובשות בצל לבקבוק חרוטי המכיל 220 מ"ל מים מזוקקים כפולים סטריליים ומחממים ב-130 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   1. צבע תמיסת התגובה משתנה לצהוב בהיר. השינויים בצבע התמיסה מתרחשים לאחר 10 דקות. הניחו לתמיסה להתחמם למשך 10 דקות נוספות. התאם את נפח המים המזוקקים הכפולים על סמך כמות הדגימה.
5. אחסן את התמצית הגולמית המכילה פוליאיזופרן ב-4 מעלות צלזיוס לשימוש נוסף. היווצרות מבנה דמוי חוט מעידה על נוכחות של פוליאיזופרן בתמציות.

2. ביוסינתזה של ננו-חלקיקי ZnO בתיווך קליפה של E. ulmoides

1. הוסף 1 M אבץ חנקתי דיהידראט Zn (NO₃)₂ עד 50 מ"ל מים נטולי יונים בבקבוק חרוטי של 500 מ"ל. מערבבים ללא הרף באמצעות ערבוב מגנטי (60 סל"ד). ל-Zn (NO₃)₂ לוקח 30 דקות להתמוסס לחלוטין.
2. יש להוסיף 15 מ"ל של תמצית קליפת E . ulmoides טיפתית ל-20 מ"ל של תמיסת אבץ חנקתי דיהידרט (Zn (NO₃)₂) של 1 M.
3. מניחים את תערובת התגובה המכוסה על מערבל מגנטי, מפעילים את המערבל וסובבים במהירות (60 סל"ד) למשך 3 שעות.
4. הוסף תמיסת 1 N נתרן הידרוקסיד NaOH (3 מ"ל) טיפתית לתערובת התגובה כדי להתאים את ה-pH ל-9. מוסיפים NaOH עד שתערובת התמיסה הופכת לבנה חלבית וה-pH אינו עולה על 9. התמיסה הופכת לצבע לבן חלבי כאשר נוצרים ננו-חלקיקי ZnO.
   1. ההכנה של 1 M של נפח תמיסת אבץ חנקתי דיהידראט Zn (NO₃)₂ עשויה להשתנות בהתאם לצרכי הניסוי. הקפידו להשתמש בתמציות הקליפה הטריות שהוכנו. אם ה-pH עולה על 10, זה יגרום לצבירת ננו-חלקיקים.
5. העבירו את ה-Eu-ZnO-NPs המסונתזים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל וצנטריפוגה ב-100 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   הערה: ניתן להימנע מהזיהומים על ידי כביסה מיידית.
6. אוספים את ה-Eu-ZnO-NPs השטופים בצלחת זכוכית ומייבשים אותם בטמפרטורה של 45-50 מעלות צלזיוס למשך שעה בתנור אוויר חם.
   הערה: אם ה-Eu-ZnO-NPs נשמרים יותר מ-30 דקות יכול להשפיע על האופי הפיזיקוכימי של הננו-חלקיקים

3. אישור גודל באמצעות TEM

1. הכן 1 מ"ג/מ"ל של ננו-חלקיקים ב-DDH₂O וטען 5 מיקרוליטר של דגימת Eu-ZnO-NP ברשת הנחושת והמתן עד שיתייבש לחלוטין. מערבולת הדגימה לפני הטעינה על רשת הנחושת.
2. טען את רשת הנחושת המכילה Eu-ZnO-NPs על מחזיק הדגימה TEM ורכוש תמונות בהגדלות של פי 50 ו-100x.
   הערה: יש לאסוף רשתות באמצעות פינצטה במהלך שלב זה.

4. הערכת ציטוטוקסיות

1. זרע 1 × 10⁴ HUVECs בכל באר של צלחת 96 בארות והנח אותה בחממה של 5% CO₂ 37 מעלות צלזיוס.
2. הוסף 10 מיקרוליטר בריכוזים שונים 0, 10, 20, 30, 40 ו-50 מיקרוגרם/מ"ל של Eu-ZnO-NPs לתאים המתכנסים של 90% ודגר אותו למשך 24 שעות.
3. לאחר הדגירה, הסר את המדיום הישן מבלי להפריע לתאים, הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת CCK-8 לכל באר המכילה 90 מיקרוליטר של מדיום DMEM טרי, ודגירה בחממה של 5% CO₂, 37 מעלות צלזיוס.
4. למדוד את הספיגה של תאים שטופלו בתמיסת CCK8 ב-450 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
   הערה: הספיגה נמדדה מיד תוך 15 דקות כדי למנוע את השינויים בספיגה.

5. הכנת תאי HUVEC לבדיקת שריטות

1. זרעו כמות מתאימה (1 × 10⁵) של HUVECs ב-12 צלחות תרבית באר המכילות את מדיום הנשר המותאם של Dulbecco עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% עט סטרפטוקוקוס ודגרו אותו בחממה של 5% CO₂ 37 מעלות צלזיוס.
   1. לפני ביצוע בדיקת השריטה, בדוק את המפגש באמצעות המיקרוסקופ ההפוך.
      הערה: לביצוע בדיקת השריטה ישמשו 6 צלחות באר או 12 צלחות בהתאם לדרישות, וצפיפות התאים תשתנה עבור לוחות תרבית שונים. השימוש ב-70%-80% תאים קונפלואנטים הוא אידיאלי ומומלץ לבדיקת שריטות. נפח מדיום ה-DMEM עשוי להשתנות בהתאם ללוחות התרבות ששימשו במחקר. לדוגמה, 6 צלחות באר דורשות 1-1.5 מ"ל של מדיום תרבית, ו-12 צלחות באר דורשות 0.5-1.0 מ"ל של מדיום גידול.
2. בצע שריטה בעדינות באמצעות קצה פיפטה סטרילי של 200 מיקרוליטר בפצע הייצוגי ברוחב פצע של 200 מיקרומטר.
3. ודא שהקצה המשמש ליצירת שריטות בשכבת התא יוצר מגע עם פני התאים.
   הערה: בכל פעם שנוצרת שריטה, השתמש בקצה הסטרילי.
4. הסר את המדיום השלם ושטוף את שכבת ה-HUVEC באמצעות 1 מ"ל של 1x PBS כדי להסיר את התאים המנותקים.
   הערה: ודא שהתאים החד-שכבתיים המנותקים מוסרים לחלוטין מהבארות המתאימות. ודא שלא נגרם נזק באזור שנוצר כתוצאה מהפצע.
5. כדי להעריך את פוטנציאל ריפוי הפצעים של Eu-ZnO-NPs מסונתזים, הוסף ריכוזים של 0 (בקרה), 10 ו-20 מיקרוגרם/מ"ל של ננו-חלקיקי Eu-ZnO בשילוב עם מדיום שלם עם 10% FBS לבארות. שמור על לוחות הניסוי ב-37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO₂ .
   הערה: אל תפריע לשכבת התא החד-שכבתית תוך הוספת המדיום הטרי והשלם. ודא שהתאים החד-שכבתיים יישארו ללא הפרעה במהלך הדגירה.
6. רכוש מיקרופוטו ב-0 שעות ו-24 שעות באמצעות מיקרוסקופ הפוך. השתמש בכלי ההערות כדי למדוד את סגירת הפצע במרווחי זמן שונים.
   1. חשב את אחוז סגירת הפצע באמצעות הנוסחה הבאה: סגירת פצע (%) = [(נדידת תאים (במיקרומטר) ב-0 שעות - נדידת תאים (במיקרומטר) ב-24 שעות)/ נדידת תאים (במיקרומטר) ב-0 שעות] x 100.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

המחקר הנוכחי נועד לסנתז ננו-חלקיקים באמצעות קליפות עץ Eucommia ulmoides . חומר הקליפה יובש לחלוטין בסביבה מוצלת (איור 1). חומרי הקליפה שימשו להכנת התמצית הגולמית המימית של המים החמים על ידי חימום הדגימות ב-130 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. שינוי קל בטמפרטורה ובמשך ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מאמינים כי יש לקליפת ה-E. ulmoides, לזרעים ולעלים יתרונות בריאותיים רבים. התוצאות שלנו הראו כי הסינתזה של ננו-חלקיקי EU-ZnO הושגה באמצעות גישה פשוטה וחסכונית. התמצית המימית שימשה לסינתזה של הננו-חלקיקים. חימום חומר הקליפה בטמפרטורות גבוהות עלול לגרום לפירוק של חלק מהפיטו-מ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plate	NEST	703011	Used for cell culture and assay
Centrifuge	SCILOGEX	SC1406	Used to separate the nanoparticles from the colloidal mixture
Centrifuge Tube – 15 mL	BIOFIL	CFT-312150	To centrifuge the synthesized solution
Centrifuge tube – 5 mL	Biosharp	BS-50-CM-S	To store the nanoparticles
CO2 incubator	Thermo scientific	3010	To culture the HUVEC cells
Denoised water	Millipore	Not applicable	For preparation of the extract
DMEM medium	Cytiva	SH30243.01	Used for cell culture work
Funnel	Thermo scientific	42600060	To hold the filter paper during the filtration
Glass beakers	Borosilicate	1102-50	Used to prepare the aqueous extract
Hot air oven	Genetimes	Not Applicable	Used to dry the nanoparticles and collect in the powder form
Magnetic stirrer	KYLIN-BELL	GL-5250-A	Used for nanoparticles synthesis
Microscope	Nikon Eclipse	Ts2	Used to take microphotographs
Petri dish	NEST	753001	Used to collect the nanoparticles
Pipette 1 mL	Lab Science	YEA17AD0055580	To take/add the specific volume of solution/extract
Pipette tips 1 mL	SAINING	3014200-T	To take/add the specific volume of solution/extract
PTFE Magnetic Mixer Stir Bars	LAN RAN	Not applicable	Used for nanomaterial synthesis process
Sodium hydroxide	Sigma Alrich	71690	Used to adjust pH during the synthesis
Stainless Scissor	Deli	6034	Used for chopping the bark materials
T25 tissue culture flask	NEST	707001	Used to maintain the cells
Weighing Balance	Radwag	AS220R2	Used to weigh the chemicals
Whatman filter paper No.1	Newstar	GB/T1914-2017	Used to filter the extract for synthesis
Zinc nitrate	Sigma Alrich	13778-30-8	Used as precursor for the nanoparticle’s synthesis