Formulazione di nanomateriali a base di zinco utilizzando l'estratto di corteccia di Eucommia ulmoides e il loro potenziale di guarigione delle ferite

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per sintetizzare le nanoparticelle di ossido di zinco (ZnO) utilizzando l'estratto acquoso ricco di poliisoprene ottenuto dalla corteccia dell'albero Eucommia ulmoides . Il potenziale di guarigione delle ferite esibito dalle nanoparticelle di ZnO sintetizzate sulle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVECs) è stato valutato utilizzando il test scratch, un metodo semplice, economico ed efficiente.

Abstract

L'estratto acquoso della corteccia di Eucommia ulmoides funge da ricca fonte di composti bioattivi con numerosi benefici per la salute. Il protocollo qui mira a esplorare la preparazione di nanoparticelle di ossido di zinco (ZnO) utilizzando l'estratto acquoso ricco di poliisoprene mediato dalla corteccia di Eucommia ulmoides . Nel frattempo, il protocollo proposto è associato alla preparazione di materiale per la guarigione delle ferite facilitando il processo. Inoltre, il potenziale di guarigione delle ferite delle nanoparticelle sintetizzate (Eu-ZnO-NP) è stato valutato utilizzando un semplice test di graffio su un monostrato di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). Dopo 24 ore di trattamento con Eu-ZnO-NPs, sono state valutate la proliferazione cellulare e la migrazione delle cellule HUVEC. Al termine dello studio, la proliferazione e la migrazione cellulare sono state osservate in monostrato graffiato trattato con diverse concentrazioni di Eu-ZnO-NPs, mentre sono stati osservati bassi tassi di migrazione e proliferazione cellulare nelle cellule di controllo. Delle concentrazioni scelte, 20 μg/mL di nanomateriali Eu-ZnO hanno mostrato una migliore migrazione cellulare e un maggiore potenziale di guarigione delle ferite.

Introduzione

È stato dimostrato che le piante medicinali e i composti di origine vegetale presentano numerosi benefici per la salute¹. L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha riferito che l'80% della popolazione mondiale dipende dalle piante medicinali tradizionali per l'assistenza sanitaria di base. La Cina è ben nota e popolare per le sue pratiche di Medicina Tradizionale Cinese (MTC). Le erbe medicinali cinesi sono state segnalate per trattare varie malattie e utilizzate per il loro potenziale biologico. Le piante medicinali fungono da serbatoi per composti bioattivi e molteplici ruoli terapeutici. Le piante medicinali sono state utilizzate anche per curare le ferite. Esistono diversi tipi di approcci applicati per trattare le ferite croniche². Una recente indagine ha rivelato che le piante medicinali sono coinvolte nel processo di guarigione delle ferite fornendo condizioni favorevoli per la guarigione, prive di infezioni, e accelerando la rigenerazione dei tessuti³. Nel frattempo, le proprietà antibatteriche e antimicotiche dei composti bioattivi presenti nelle piante medicinali possono aiutare a curare le ferite e accelerare l'efficienza di guarigione delle ferite⁴.

I nanomateriali a base di metalli stanno attirando l'attenzione grazie alle loro proprietà biocompatibili e biodegradabili. L'Eucommia ulmoides, comunemente chiamata albero della gomma cinese, è una specie originaria della Cina. Le foglie e la corteccia dell'albero sono utilizzate nelle pratiche medicinali. Ancora più importante, la specie vegetale è stata coltivata nelle province centrali e occidentali della Cina⁵. Peng et ^al.6hanno riportato che foglie, cortecce e fiori staminati erano commestibili con potenziale terapeutico. Inoltre, E. ulmoides è la migliore fonte di lignani, fenilpropanoidi, iridoidi, flavonoidi, aminoacidi e oligoelementi. Inoltre, la corteccia è stata utilizzata per varie applicazioni biomediche come il controllo della pressione sanguigna, l'abbassamento del grasso e la promozione dell'attività antiosteroporotica e ipoglicemizzante⁷. Quindi, senza dubbio, è stato dimostrato che l'estratto di corteccia di E. ulmoides ha una lunga storia nella medicina tradizionale cinese. Rapporti precedenti suggerivano che il polimero naturale poliisoprene è ricco di cortecce di Eucommia ulmoides⁸. Sulla base delle informazioni di cui sopra, il presente lavoro mira a fabbricare nanomateriali utilizzando estratti di corteccia di Eucommia ulmoides . La combinazione di zinco ed estratto di corteccia è una scelta interessante per la preparazione di nanomateriali. Nel complesso, l'obiettivo finale della presente ricerca è stato quello di fabbricare un nuovo nanomateriale ibrido per applicazioni di guarigione delle ferite.

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Protocollo

NOTA: Prima di preparare l'estratto, il materiale di corteccia ottenuto è stato lavato due volte con acqua deionizzata ed essiccato in un luogo ombreggiato. Le cortecce essiccate all'ombra sono state conservate in un contenitore ermetico.

1. Preparazione dell'estratto di corteccia di Eucommia ulmoides

1. Taglia la corteccia raccolta dall'albero di Eucommia ulmoides in piccoli pezzi usando le forbici.
2. Lavare due volte i materiali della corteccia tritata con acqua distillata doppia.
3. Asciugare i pezzi di corteccia a una temperatura inferiore a 37 °C per 24 ore in condizioni di ombreggiatura.
   1. Regolare la durata del processo di essiccazione in base alla quantità di corteccia utilizzata per lo studio. Assicurati che le cortecce siano completamente asciutte prima di tagliarle a pezzetti. Evitare la luce solare diretta.
4. Trasferire 20 g di cortecce essiccate all'ombra in un pallone conico contenente 220 ml di acqua sterile a doppia distillazione e scaldare a 130 °C per 20 minuti.
   1. Il colore della soluzione di reazione cambia in giallo chiaro. I cambiamenti di colore della soluzione si verificano dopo 10 minuti. Lasciare scaldare la soluzione per altri 10 minuti. Regolare il volume dell'acqua distillata doppia in base alla quantità di campione.
5. Conservare l'estratto grezzo contenente poliisoprene a 4 °C per un ulteriore utilizzo. La formazione di una struttura filiforme indica la presenza di poliisoprene negli estratti.

2. Biosintesi di nanoparticelle di ZnO mediate dalla corteccia di E. ulmoides

1. Aggiungere 1 M di nitrato di zinco diidrato Zn (NO₃)₂ a 50 ml di acqua deionizzata in un matraccio conico da 500 ml. Mescolare continuamente utilizzando l'agitazione magnetica (60 giri/min). Lo Zn (NO₃)₂ impiega 30 minuti per dissolversi completamente.
2. Aggiungere 15 mL di estratto di corteccia di E. ulmoides goccia per goccia a 20 mL di soluzione di nitrato di zinco diidrato (Zn (NO₃)₂) 1 M.
3. Posizionare la miscela di reazione coperta su un agitatore magnetico, accendere l'agitatore e centrifugare a (60 giri/min) per 3 ore.
4. Aggiungere 1 N soluzione di idrossido di sodio NaOH (3 mL) alla miscela di reazione per regolare il pH a 9. Aggiungere NaOH fino a quando la miscela di soluzione diventa bianco latte e il pH non è superiore a 9. La soluzione diventa di un colore bianco latte quando si formano le nanoparticelle di ZnO.
   1. La preparazione di 1 M di nitrato di zinco diidrato Zn (NO₃)₂ volume di soluzione può variare in base alle esigenze sperimentali. Assicurati di utilizzare gli estratti di corteccia appena preparati. Se il pH supera 10, si verificherà l'aggregazione di nanoparticelle.
5. Trasferire gli Eu-ZnO-NP sintetizzati in una provetta da centrifuga da 50 mL e centrifugarla a 100 x g per 5 minuti a 4 °C.
   NOTA: Le impurità possono essere evitate con un lavaggio immediato.
6. Raccogliere gli Eu-ZnO-NP lavati in una lastra di vetro e asciugarli a 45-50 °C per 1 ora in forno ad aria calda.
   NOTA: Se le Eu-ZnO-NP vengono conservate per più di 30 minuti possono influenzare la natura fisico-chimica delle nanoparticelle

3. Conferma della taglia tramite TEM

1. Preparare 1 mg/mL di nanoparticelle in DDH₂O e caricare 5 μL di campione di Eu-ZnO-NP nella griglia di rame e attendere che si asciughi completamente. Agitare il campione prima di caricarlo sulla griglia di rame.
2. Caricare la griglia di rame contenente Eu-ZnO-NP sul portacampioni TEM e acquisire immagini con ingrandimenti 50x e 100x.
   NOTA: Le griglie devono essere raccolte utilizzando una pinzetta durante questo passaggio.

4. Valutazione della citotossicità

1. Seminare 1 × 10⁴ HUVEC in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e metterlo in un'incubatrice al 5% di CO₂ a 37 °C.
2. Aggiungere 10 μL di varie concentrazioni 0, 10, 20, 30, 40 e 50 μg/mL di Eu-ZnO-NP nelle cellule confluenti al 90% e incubarle per 24 ore.
3. Dopo l'incubazione, rimuovere il vecchio terreno senza disturbare le cellule, aggiungere 10 μL di soluzione CCK-8 a ciascun pozzetto contenente 90 μL di terreno DMEM fresco e incubare in un incubatore al 5% di CO₂, 37 °C.
4. Misurare l'assorbanza delle cellule trattate con soluzione di CCK8 a 450 nm utilizzando uno spettrofotometro.
   NOTA: L'assorbanza è stata misurata immediatamente entro 15 minuti per evitare le variazioni dell'assorbanza.

5. Preparazione delle cellule HUVEC per il saggio scratch

1. Seminare una quantità appropriata (1 × 10⁵) di HUVEC in piastre di coltura a 12 pozzetti contenenti il terreno Eagle modificato di Dulbecco con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di pen-strep e incubarlo in un'incubatrice al 5% di CO₂ a 37 °C.
   1. Prima di eseguire il test del graffio, controllare la confluenza utilizzando il microscopio invertito.
      NOTA: Per eseguire il test scratch verranno utilizzate piastre a 6 pozzetti o 12 piastre in base ai requisiti e la densità cellulare varierà per le diverse piastre di coltura. L'uso di cellule confluenti al 70%-80% è ideale e consigliato per il test scratch. Il volume del terreno DMEM può variare in base alle piastre di coltura utilizzate nello studio. Ad esempio, le piastre a 6 pozzetti richiedono 1-1,5 mL di terreno di coltura e le piastre a 12 pozzetti richiedono 0,5-1,0 mL di terreno di crescita.
2. Graffiare delicatamente utilizzando un puntale per pipetta sterile da 200 μl nella ferita rappresentativa con una larghezza della ferita di 200 μm.
3. Assicurarsi che la punta utilizzata per graffiare il monostrato di celle sia a contatto con la superficie delle celle.
   NOTA: Ogni volta che viene fatto un graffio, utilizzare la punta sterile.
4. Rimuovere l'intero terreno e lavare il monostrato HUVEC utilizzando 1 mL di 1x PBS per rimuovere le cellule staccate.
   NOTA: Assicurarsi che le celle monostrato staccate siano completamente rimosse dai rispettivi pozzetti. Verificare che non si siano verificati danni nell'area creata dalla ferita.
5. Per valutare il potenziale di guarigione delle ferite delle Eu-ZnO-NP sintetizzate, aggiungere nei pozzetti concentrazioni di 0 (Controllo), 10 e 20 μg/mL di nanoparticelle di Eu-ZnO combinate con un terreno completo con il 10% di FBS. Mantenere le piastre sperimentali a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ .
   NOTA: Non disturbare il monostrato di celle durante l'aggiunta del terreno fresco e completo. Assicurarsi che le celle monostrato rimangano indisturbate durante l'incubazione.
6. Acquisisci microfotografie a 0 h e 24 h utilizzando un microscopio invertito. Utilizzare lo strumento di annotazione per misurare la chiusura della ferita in diversi intervalli di tempo.
   1. Calcolare la percentuale di chiusura della ferita utilizzando la seguente formula: Chiusura della ferita (%) = [(migrazione cellulare (in μm) a 0 h - migrazione cellulare (in μm) a 24 h)/ migrazione cellulare (in μm) a 0 h] x 100.

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Risultati

La presente ricerca mira a sintetizzare nanoparticelle utilizzando le cortecce dell'albero Eucommia ulmoides . Il materiale della corteccia è stato completamente essiccato in un ambiente ombreggiato (Figura 1). I materiali della corteccia sono stati utilizzati per preparare l'estratto grezzo acquoso di acqua calda riscaldando i campioni a 130 °C per 20 minuti. Una leggera alterazione della temperatura e della durata può alterare i fitocomposti e ...

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Discussione

Si ritiene che la corteccia, il seme e le foglie di E. ulmoides mostrino numerosi benefici per la salute. I nostri risultati hanno dimostrato che la sintesi di nanoparticelle di EU-ZnO è stata ottenuta utilizzando un approccio semplice ed economico. L'estratto acquoso è stato utilizzato per sintetizzare le nanoparticelle. Il riscaldamento del materiale della corteccia ad alte temperature può causare la degradazione di alcuni fitocostituenti e ridurre l'efficienza di estrazion...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plate	NEST	703011	Used for cell culture and assay
Centrifuge	SCILOGEX	SC1406	Used to separate the nanoparticles from the colloidal mixture
Centrifuge Tube – 15 mL	BIOFIL	CFT-312150	To centrifuge the synthesized solution
Centrifuge tube – 5 mL	Biosharp	BS-50-CM-S	To store the nanoparticles
CO2 incubator	Thermo scientific	3010	To culture the HUVEC cells
Denoised water	Millipore	Not applicable	For preparation of the extract
DMEM medium	Cytiva	SH30243.01	Used for cell culture work
Funnel	Thermo scientific	42600060	To hold the filter paper during the filtration
Glass beakers	Borosilicate	1102-50	Used to prepare the aqueous extract
Hot air oven	Genetimes	Not Applicable	Used to dry the nanoparticles and collect in the powder form
Magnetic stirrer	KYLIN-BELL	GL-5250-A	Used for nanoparticles synthesis
Microscope	Nikon Eclipse	Ts2	Used to take microphotographs
Petri dish	NEST	753001	Used to collect the nanoparticles
Pipette 1 mL	Lab Science	YEA17AD0055580	To take/add the specific volume of solution/extract
Pipette tips 1 mL	SAINING	3014200-T	To take/add the specific volume of solution/extract
PTFE Magnetic Mixer Stir Bars	LAN RAN	Not applicable	Used for nanomaterial synthesis process
Sodium hydroxide	Sigma Alrich	71690	Used to adjust pH during the synthesis
Stainless Scissor	Deli	6034	Used for chopping the bark materials
T25 tissue culture flask	NEST	707001	Used to maintain the cells
Weighing Balance	Radwag	AS220R2	Used to weigh the chemicals
Whatman filter paper No.1	Newstar	GB/T1914-2017	Used to filter the extract for synthesis
Zinc nitrate	Sigma Alrich	13778-30-8	Used as precursor for the nanoparticle’s synthesis