Рецептура наноматериалов на основе цинка с использованием экстракта коры Eucommia ulmoides и их ранозаживляющий потенциал

Резюме

В данной работе мы представляем протокол синтеза наночастиц оксида цинка (ZnO) с использованием богатого полиизопреном водного экстракта, полученного из коры дерева Eucommia ulmoides . Ранозаживляющий потенциал, проявляемый синтезированными наночастицами ZnO на эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVECs), оценивали с помощью скретч-анализа, простого, экономически эффективного и эффективного метода.

Аннотация

Водный экстракт из коры Eucommia ulmoides служит богатым источником биологически активных соединений с многочисленными преимуществами для здоровья. Протокол направлен на изучение получения наночастиц оксида цинка (ZnO) с использованием опосредованного корой полиизопрена водного экстракта Eucommia ulmoides . Между тем, предложенный протокол связан с подготовкой ранозаживляющего материала путем облегчения процесса. Кроме того, ранозаживляющий потенциал синтезированных наночастиц (Eu-ZnO-NPs) был оценен с помощью простого анализа царапин на монослое эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC). После 24 ч лечения Eu-ZnO-NP оценивали пролиферацию клеток и миграцию клеток HUVEC. В конце исследования пролиферация и миграция клеток наблюдались в поцарапанном монослое, обработанном различными концентрациями Eu-ZnO-NPs, в то время как в контрольных клетках наблюдалась плохая миграция и скорость пролиферации. Из выбранных концентраций наноматериалы Eu-ZnO с концентрацией 20 мкг/мл показали лучшую миграцию клеток и повышенный потенциал заживления ран.

Введение

Было показано, что лекарственные растения и соединения растительного происхождения обладают многочисленными преимуществами для здоровья¹. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) сообщила, что 80% населения мира зависит от традиционных лекарственных растений для оказания первичной медико-санитарной помощи. Китай хорошо известен и популярен благодаря своим практикам традиционной китайской медицины (ТКМ). Сообщалось, что китайские лекарственные травы лечат различные заболевания и используются из-за их биологического потенциала. Лекарственные растения служат резервуарами для биологически активных соединений и выполняют множество терапевтических функций. Для лечения ран также использовались лекарственные растения. Существует несколько типов подходов, применяемых для лечения хронических ран². Недавнее исследование показало, что лекарственные растения участвуют в процессе заживления ран, обеспечивая благоприятные условия для заживления, свободные от инфекций и ускоряя регенерацию тканей³. Между тем, антибактериальные и противогрибковые свойства биоактивных соединений, присутствующих в лекарственных растениях, могут помочь вылечить раны и ускорить эффективность заживления ран⁴.

Наноматериалы на основе металлов привлекают внимание благодаря своим биосовместимым и биоразлагаемым свойствам. Eucommia ulmoides, обычно называемая китайским каучуковым деревом, является местным видом Китая. Листья и кора дерева используются в лечебных практиках. Самое главное, что вид растения культивировался в центральных и западных провинциях Китая⁵. Peng et ^al.6сообщили, что листья, кора и тычиночные цветы являются съедобными с терапевтическим потенциалом. Кроме того, E. ulmoides служит лучшим источником лигнанов, фенилпропаноидов, иридоидов, флавоноидов, аминокислот и микроэлементов. Кроме того, кора использовалась для различных биомедицинских целей, таких как контроль артериального давления, снижение жира и содействие антиостеропорозу и гипогликемической^{активности.} Следовательно, несомненно, доказано, что экстракт коры E. ulmoides имеет давнюю историю в традиционной китайской медицине. Более ранние сообщения предполагали, что природный полимерный полиизопрен богат корой Eucommia ulmoides⁸. Основываясь на приведенной выше информации, настоящая работа направлена на получение наноматериалов с использованием экстрактов коры Eucommia ulmoides . Комбинация цинка с экстрактом коры является привлекательным выбором для получения наноматериалов. В целом, конечной целью настоящего исследования было создание нового гибридного наноматериала для заживления ран.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед приготовлением экстракта полученный материал коры дважды промывали с использованием деионизированной воды и сушили в затененном месте. Высушенная в тени кора хранилась в герметичном контейнере.

1. Приготовление экстракта коры Eucommia ulmoides

1. Измельчите кору, собранную с дерева Eucommia ulmoides, на небольшие кусочки с помощью ножниц.
2. Измельченные материалы коры дважды промыть водой двойной дистилляции.
3. Высушите кусочки коры при температуре 37 °C в течение 24 часов в затененных условиях.
   1. Отрегулируйте продолжительность процесса сушки в зависимости от количества коры, используемой для исследования. Убедитесь, что кора полностью высохла, прежде чем нарезать кору на мелкие кусочки. Избегайте попадания прямых солнечных лучей.
4. Переложите 20 г высушенной в тени коры в коническую колбу, содержащую 220 мл стерильной воды двойной дистилляции, и нагрейте до 130 °C в течение 20 минут.
   1. Цвет реакционного раствора меняется на светло-желтый. Изменение цвета раствора происходит через 10 мин. Дайте раствору нагреться еще 10 минут. Отрегулируйте объем воды двойной дистилляции в зависимости от количества образца.
5. Сырой экстракт, содержащий полиизопрен, хранить при температуре 4 °C для дальнейшего использования. Образование нитевидной структуры свидетельствует о наличии полиизопрена в экстрактах.

2. Биосинтез наночастиц ZnO, опосредованных корой E. ulmoides

1. Добавьте 1 М дигидрата нитрата цинка Zn (NO₃)₂ в 50 мл деионизированной воды в коническую колбу объемом 500 мл. Непрерывно перемешивайте с помощью магнитного перемешивания (60 об/мин). Для полного растворения Zn (NO₃)₂ требуется 30 минут.
2. Добавьте 15 мл экстракта коры E. ulmoides по каплям в 20 мл 1 М раствора дигидрата нитрата цинка (Zn (NO₃)₂).
3. Поместите закрытую реакционную смесь на магнитную мешалку, включите мешалку и вращайте со скоростью (60 об/мин) в течение 3 часов.
4. Добавьте 1 Н раствор гидроксида натрия NaOH (3 мл) по каплям в реакционную смесь, чтобы довести pH до 9. Добавляйте NaOH до тех пор, пока смесь раствора не станет молочно-белой и pH не будет больше 9. Раствор приобретает молочно-белый цвет при образовании наночастиц ZnO.
   1. Объем приготовления 1 М раствора дигидрата нитрата цинка Zn (NO₃)₂ может варьироваться в зависимости от экспериментальных потребностей. Обязательно используйте свежеприготовленные экстракты коры. Если pH превышает 10, это приведет к агрегации наночастиц.
5. Перенесите синтезированные Eu-ZnO-NP в центрифужную пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте ее при 100 x g в течение 5 мин при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Загрязнений можно избежать путем немедленной промывки.
6. Соберите промытые Eu-ZnO-NP в стеклянную тарелку и высушите их при температуре 45-50 °C в течение 1 часа в духовке с горячим воздухом.
   Примечание: Если Eu-ZnO-NP хранятся более 30 минут, это может повлиять на физико-химическую природу наночастиц

3. Подтверждение размера с помощью ПЭМ

1. Приготовьте 1 мг/мл наночастиц в DDH₂O и загрузите 5 мкл образца Eu-ZnO-NP в медную сетку и дождитесь полного высыхания. Проведите вихревую обработку образца перед загрузкой на медную сетку.
2. Загрузите медную сетку, содержащую Eu-ZnO-NP, в держатель образца TEM и получите изображения с 50-кратным и 100-кратным увеличением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе сетки необходимо подбирать с помощью пинцета.

4. Оценка цитотоксичности

1. Высадите 1 ×^{10 4} HUVEC в каждую лунку 96-луночного планшета и поместите его в инкубатор с 5% CO₂ 37 °C.
2. Добавьте 10 мкл различных концентраций 0, 10, 20, 30, 40 и 50 мкг/мл Eu-ZnO-NP в 90% сливающихся клеток и инкубируйте в течение 24 ч.
3. После инкубации удалите старую среду, не потревожив клетки, добавьте по 10 мкл раствора CCK-8 в каждую лунку, содержащую 90 мкл свежей среды DMEM, и инкубируйте в инкубаторе с 5% CO₂, 37 °C.
4. Измерьте поглощение клеток, обработанных раствором CCK8, на длине волны 450 нм с помощью спектрофотометра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Абсорбция была измерена немедленно в течение 15 минут, чтобы избежать изменений абсорбции.

5. Подготовка клеток HUVEC к скретч-анализу

1. Засейте соответствующее (1 ×^{10 5}) количество HUVEC в 12 луночных культуральных планшетах, содержащих модифицированную среду Dulbecco Eagle с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% перьевым стрептококком, и инкубируйте его в инкубаторе с 5% CO₂ 37 °C.
   1. Перед проведением анализа царапин проверьте слияние с помощью инвертированного микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения анализа царапин будут использоваться 6 луночных планшетов или 12 планшетов в зависимости от требований, а плотность клеток будет варьироваться для разных культуральных планшетов. Использование 70%-80% сливающихся клеток является идеальным и рекомендуется для анализа царапин. Объем среды DMEM может варьироваться в зависимости от используемых в исследовании культуральных планшетов. Например, для 6-луночных планшетов требуется 1-1,5 мл питательной среды, а для 12-луночных планшетов требуется 0,5-1,0 мл питательной среды.
2. Аккуратно сделайте царапину стерильным наконечником пипетки объемом 200 мкл в репрезентативной ране с шириной раны 200 мкм.
3. Следите за тем, чтобы наконечник, используемый для нанесения царапин на монослое ячеек, соприкасался с поверхностью ячеек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз при нанесении царапины используйте стерильный наконечник.
4. Удалите всю среду и промойте монослой HUVEC, используя 1 мл 1x PBS для удаления отделенных клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что отделенные монослойные ячейки полностью удалены из соответствующих лунок. Убедитесь, что в области образовавшейся раны не произошло никаких повреждений.
5. Для оценки ранозаживляющего потенциала синтезированных Eu-ZnO-НЧ добавьте в лунки 0 (контроль), 10 и 20 мкг/мл наночастиц Eu-ZnO в сочетании с полной средой с 10% FBS. Поддерживайте экспериментальные планшеты при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не нарушайте монослой клеток во время добавления свежей, полноценной среды. Следите за тем, чтобы монослойные клетки оставались нетронутыми во время инкубации.
6. Получите микрофотографию через 0 ч и 24 ч с помощью инвертированного микроскопа. Используйте инструмент аннотации для измерения закрытия раны в разные временные интервалы.
   1. Рассчитайте процент закрытия раны по следующей формуле: Закрытие раны (%) = [(миграция клеток (в мкм) в 0 ч - миграция клеток (в мкм) в 24 ч) / миграция клеток (в мкм) в 0 ч] x 100.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Настоящее исследование направлено на синтез наночастиц с использованием коры дерева Eucommia ulmoides . Материал коры полностью высушивали в затененной среде (рис. 1). Материалы коры использовали для приготовления водного экстракта сырой нефти в горячей ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Считается, что кора, семена и листья E. ulmoides обладают многочисленными преимуществами для здоровья. Наши результаты показали, что синтез наночастиц EU-ZnO был достигнут с использованием простого и экономически эффективного подхода. Водный экстракт был использован д?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plate	NEST	703011	Used for cell culture and assay
Centrifuge	SCILOGEX	SC1406	Used to separate the nanoparticles from the colloidal mixture
Centrifuge Tube – 15 mL	BIOFIL	CFT-312150	To centrifuge the synthesized solution
Centrifuge tube – 5 mL	Biosharp	BS-50-CM-S	To store the nanoparticles
CO2 incubator	Thermo scientific	3010	To culture the HUVEC cells
Denoised water	Millipore	Not applicable	For preparation of the extract
DMEM medium	Cytiva	SH30243.01	Used for cell culture work
Funnel	Thermo scientific	42600060	To hold the filter paper during the filtration
Glass beakers	Borosilicate	1102-50	Used to prepare the aqueous extract
Hot air oven	Genetimes	Not Applicable	Used to dry the nanoparticles and collect in the powder form
Magnetic stirrer	KYLIN-BELL	GL-5250-A	Used for nanoparticles synthesis
Microscope	Nikon Eclipse	Ts2	Used to take microphotographs
Petri dish	NEST	753001	Used to collect the nanoparticles
Pipette 1 mL	Lab Science	YEA17AD0055580	To take/add the specific volume of solution/extract
Pipette tips 1 mL	SAINING	3014200-T	To take/add the specific volume of solution/extract
PTFE Magnetic Mixer Stir Bars	LAN RAN	Not applicable	Used for nanomaterial synthesis process
Sodium hydroxide	Sigma Alrich	71690	Used to adjust pH during the synthesis
Stainless Scissor	Deli	6034	Used for chopping the bark materials
T25 tissue culture flask	NEST	707001	Used to maintain the cells
Weighing Balance	Radwag	AS220R2	Used to weigh the chemicals
Whatman filter paper No.1	Newstar	GB/T1914-2017	Used to filter the extract for synthesis
Zinc nitrate	Sigma Alrich	13778-30-8	Used as precursor for the nanoparticle’s synthesis