Eucommia ulmoides Bark Extractを用いた亜鉛系ナノ材料の製剤化とその創傷治癒能

要約

ここでは、 Eucommia ulmoides 樹皮から得られるポリイソプレンに富む水性抽出物を用いて酸化亜鉛(ZnO)ナノ粒子を合成するプロトコールを提示する。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)上に合成されたZnOナノ粒子が示す創傷治癒能を、シンプルで費用対効果が高く、効率的な方法であるスクラッチアッセイを用いて評価しました。

要約

Eucommia ulmoidesの樹皮からの水性抽出物は、多くの健康上の利点を持つ生理活性化合物の豊富な供給源として機能します。ここでのプロトコルは、Eucommia ulmoides樹皮媒介ポリイソプレンリッチ水性抽出物を使用して酸化亜鉛(ZnO)ナノ粒子の調製を検討することを目的としています。一方、提案されたプロトコルは、プロセスを容易にすることにより、創傷治癒材料の調製に関連しています。さらに、合成されたナノ粒子(Eu-ZnO-NP)の創傷治癒能を、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)単層上の単純なスクラッチアッセイを使用して評価しました。Eu-ZnO-NPによる24時間の処理後、HUVEC細胞の細胞増殖および遊走を評価した。研究の最後に、異なる濃度のEu-ZnO-NPで処理した傷のある単層では細胞の増殖と遊走が観察されましたが、対照細胞では細胞の遊走と増殖速度の低下が観察されました。選択された濃度のうち、20 μg/mL Eu-ZnOナノマテリアルは、より優れた細胞遊走と増強された創傷治癒能を示しました。

概要

薬用植物や植物由来の化合物は、多くの健康上の利点を示すことが示されています¹。世界保健機関(WHO)は、世界人口の80%がプライマリヘルスケアのために伝統的な薬用植物に依存していると報告しました。中国は、伝統的な中国医学(TCM)の実践でよく知られており、人気があります。漢方薬は、さまざまな病気を治療し、その生物学的可能性に利用されることが報告されています。薬用植物は、生理活性化合物の貯蔵庫として機能し、複数の治療的役割を果たします。薬用植物も傷の治療に利用されています。慢性創傷の治療に適用されるアプローチにはいくつかの種類があります².最近の調査では、薬用植物は、治癒のための好ましい条件を提供し、感染がなく、組織の再生を固定することにより、創傷治癒プロセスに関与していることが明らかになりました³。一方、薬用植物に含まれる生理活性化合物の抗菌性および抗真菌性は、創傷を治癒し、創傷治癒効率を高めるのに役立ちます⁴。

金属系ナノ材料は、その生体適合性と生分解性により注目されています。一般に中国のゴムの木と呼ばれる Eucommia ulmoides は、中国の在来種です。木の葉と樹皮は薬事に使用されます。最も重要なことは、植物種が中国の中央部と西部の省で栽培された^{ことです5}。Pengら⁶は、葉、樹皮、およびスタミネート花が治療の可能性を秘めた食用であることを報告しました。さらに、 E. ulmoidesは 、リグナン、フェニルプロパノイド、イリドイド、フラボノイド、アミノ酸、および微量元素の最良の供給源として機能します。さらに、樹皮は、血圧の制御、脂肪の低下、抗骨剤症や低血糖活動の促進など、さまざまな生物医学的用途に利用されています⁷。したがって、間違いなく、 E.ulmoides 樹皮抽出物は伝統的な中国医学で長い歴史を持っていることが証明されています。以前の報告では、天然ポリマーポリイソプレンが Eucommia ulmoides⁸の樹皮に豊富に含まれていることが示唆されていました。以上の情報に基づき、本研究では、 Eucommia ulmoides 樹皮抽出物を用いたナノマテリアルの作製を目指している。亜鉛と樹皮抽出物の組み合わせは、ナノ材料を調製するための魅力的な選択肢です。全体として、本研究の最終的な目的は、創傷治癒アプリケーションのための新しいハイブリッドナノ材料を作製することでした。

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プロトコル

注:抽出物を調製する前に、得られた樹皮材料を脱イオン水を使用して2回洗浄し、日陰の場所で乾燥させました。日陰で乾燥させた樹皮は、密閉容器に保管されました。

1. Eucommia ulmoides樹皮抽出物の調製

1. Eucommia ulmoidesの木から採取した樹皮をハサミで細かく刻みます。
2. 刻んだ樹皮材料を二重蒸留水で2回洗います。
3. 樹皮片を37°C以下で24時間、日陰の状態で乾燥させます。
   1. 研究に使用した樹皮の量に基づいて、乾燥プロセスの時間を調整します。樹皮を完全に乾かしてから、樹皮を細かく刻んでください。直射日光を避けてください。
4. 20 gの陰干し樹皮を220 mLの滅菌二重蒸留水が入った円錐形のフラスコに移し、130°Cで20分間加熱します。
   1. 反応液の色が淡黄色に変わります。溶液の色の変化は10分後に起こります。溶液をさらに10分間加熱します。サンプル量に基づいて二重蒸留水の量を調整します。
5. ポリイソプレンを含む粗抽出物は、さらに使用するために4°Cで保存してください。糸状構造の形成は、抽出物中のポリイソプレンの存在を示しています。

2. E. ulmoides樹皮を介したZnOナノ粒子の生合成

1. 1 Mの硝酸亜鉛二水和物Zn(NO₃)₂ 〜50 mLの脱イオン水を500 mLの円錐形フラスコに加えます。磁気攪拌(60 RPM)を使用して連続的に攪拌します。Zn(NO₃)₂ が完全に溶解するまでに30分かかります。
2. 15 mLのE. ulmoides樹皮抽出物を1 M硝酸亜鉛二水和物(Zn(NO₃)₂)溶液20 mLに滴下します。
3. 蓋をした反応混合物をマグネチックスターラーに置き、スターラーのスイッチを入れ、(60 RPM)で3時間回転させます。
4. 1Nの水酸化ナトリウムNaOH(3 mL)溶液を反応混合物に滴下して、pHを9に調整します。溶液混合物が乳白色に変わり、pHが9以下になるまでNaOHを添加します。溶液は、ZnOナノ粒子が形成されると乳白色になります。
   1. 1 Mの硝酸亜鉛二水和物Zn(NO₃)₂ 溶液の調製量は、実験のニーズによって異なる場合があります。作りたての樹皮エキスを必ず使用してください。pHが10を超えると、ナノ粒子が凝集します。
5. 合成したEu-ZnO-NPを50 mLの遠心チューブに移し、100 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
   注:不純物は、すぐに洗うことで避けることができます。
6. 洗浄したEu-ZnO-NPをガラスプレートに集め、熱風オーブンで45〜50°Cで1時間乾燥させます。
   注:Eu-ZnO-NPが30分以上保持されると、ナノ粒子の物理化学的性質に影響を与える可能性があります

3. TEMによるサイズ確認

1. DDH₂O中に1 mg/mLのナノ粒子を調製し、5 μLのEu-ZnO-NPサンプルを銅グリッドにロードし、完全に乾くまで待ちます。銅グリッドにロードする前にサンプルをボルテックスします。
2. Eu-ZnO-NPsを含む銅グリッドをTEMサンプルホルダーにロードし、50倍および100倍の倍率で画像を取得します。
   注意: この手順では、ピンセットを使用してグリッドをピックアップする必要があります。

4. 細胞毒性評価

1. 96ウェルプレートの各ウェルに1×10⁴ HUVECを播種し、5% CO₂ 37°Cインキュベーターに入れます。
2. さまざまな濃度の0、10、20、30、40、および50μg/mLのEu-ZnO-NPを10μLを90%コンフルエントセルに添加し、24時間インキュベートします。
3. インキュベーション後、細胞を乱さずに古い培地を取り出し、90 μLの新鮮なDMEM培地を含む各ウェルに10 μLのCCK-8溶液を加え、5% CO₂、37°Cのインキュベーターでインキュベートします。
4. 分光光度計を使用して、CCK8溶液で処理した細胞の450nmの吸光度を測定します。
   注:吸光度は、吸光度の変化を避けるために、15分以内にすぐに測定されました。

5. スクラッチアッセイ用HUVEC細胞の作製

1. Dulbeccoの改変イーグル培地を含む12ウェル培養プレートに、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペン連鎖球菌を含む12ウェル培養プレートに適切な量(1×10.5)のHUVECを播種し、5%CO₂ 37°Cインキュベーターでインキュベートします。
   1. スクラッチアッセイを行う前に、倒立顕微鏡を使用してコンフルエンシーを確認してください。
      注:スクラッチアッセイを実施するために、要件に基づいて6ウェルプレートまたは12プレートが使用され、細胞密度は培養プレートによって異なります。70%-80%のコンフルエント細胞の使用は理想的であり、スクラッチアッセイに推奨されます。DMEM培地の量は、研究で使用した培養プレートによって異なる場合があります。例えば、6ウェルプレートには1〜1.5mLの培地が必要であり、12ウェルプレートには0.5〜1.0mLの増殖培地が必要です。
2. 傷幅200μmの代表的な創傷に滅菌済みの200μLピペットチップを使用して、優しく引っかき傷をつけます。
3. 細胞単層に傷を付けるために使用した先端が細胞の表面に接触していることを確認してください。
   注意: 傷がつくたびに、滅菌チップを使用してください。
4. 培地全体を取り出し、1x PBSの1 mLを使用してHUVEC単層を洗浄し、剥離した細胞を除去します。
   注:剥離した単層細胞がそれぞれのウェルから完全に除去されていることを確認してください。傷ができた部分に損傷が発生していないことを確認します。
5. 合成されたEu-ZnO-NPの創傷治癒能を評価するには、0(コントロール)、10、および20μg/mLの濃度のEu-ZnOナノ粒子を10%FBSを含む完全な培地と組み合わせてウェルに加えます。実験プレートを5% CO₂ インキュベーターで37°Cに維持します。
   注:新鮮で完全な培地を追加している間、セル単層を乱さないでください。インキュベーション中に単層細胞が邪魔されないことを確認してください。
6. 倒立顕微鏡を使用して、0時間および24時間で顕微鏡写真を取得します。注釈ツールを使用して、さまざまな時間間隔で創傷の閉鎖を測定します。
   1. 創傷閉鎖率を次の式で計算します:創傷閉鎖 (%) = [ (0 時間での細胞遊走 (μm 単位) - 24 時間での細胞遊走 (μm 単位))/0 時間での細胞遊走 (μm 単位)] x 100 。

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結果

本研究では、 Eucommia ulmoides の樹皮を用いてナノ粒子を合成することを目指しています。樹皮材は、日陰の環境で完全に乾燥させました(図1)。樹皮材料は、サンプルを130°Cで20分間加熱することにより、熱水水性粗抽出物を調製するために利用されました。温度と期間のわずかな変化は、植物化合物を混乱させ、水性抽出物の調製に適さな...

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ディスカッション

E. ulmoidesの樹皮、種子、葉は、多くの健康上の利点を示すと考えられています。私たちの結果は、EU-ZnOナノ粒子の合成がシンプルで費用対効果の高いアプローチを使用して達成されたことを示しています。水性抽出物を使用してナノ粒子を合成しました。樹皮材を高温で加熱すると、一部の植物成分が劣化し、抽出効率が低下する可能性があります。水性ハー?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plate	NEST	703011	Used for cell culture and assay
Centrifuge	SCILOGEX	SC1406	Used to separate the nanoparticles from the colloidal mixture
Centrifuge Tube – 15 mL	BIOFIL	CFT-312150	To centrifuge the synthesized solution
Centrifuge tube – 5 mL	Biosharp	BS-50-CM-S	To store the nanoparticles
CO2 incubator	Thermo scientific	3010	To culture the HUVEC cells
Denoised water	Millipore	Not applicable	For preparation of the extract
DMEM medium	Cytiva	SH30243.01	Used for cell culture work
Funnel	Thermo scientific	42600060	To hold the filter paper during the filtration
Glass beakers	Borosilicate	1102-50	Used to prepare the aqueous extract
Hot air oven	Genetimes	Not Applicable	Used to dry the nanoparticles and collect in the powder form
Magnetic stirrer	KYLIN-BELL	GL-5250-A	Used for nanoparticles synthesis
Microscope	Nikon Eclipse	Ts2	Used to take microphotographs
Petri dish	NEST	753001	Used to collect the nanoparticles
Pipette 1 mL	Lab Science	YEA17AD0055580	To take/add the specific volume of solution/extract
Pipette tips 1 mL	SAINING	3014200-T	To take/add the specific volume of solution/extract
PTFE Magnetic Mixer Stir Bars	LAN RAN	Not applicable	Used for nanomaterial synthesis process
Sodium hydroxide	Sigma Alrich	71690	Used to adjust pH during the synthesis
Stainless Scissor	Deli	6034	Used for chopping the bark materials
T25 tissue culture flask	NEST	707001	Used to maintain the cells
Weighing Balance	Radwag	AS220R2	Used to weigh the chemicals
Whatman filter paper No.1	Newstar	GB/T1914-2017	Used to filter the extract for synthesis
Zinc nitrate	Sigma Alrich	13778-30-8	Used as precursor for the nanoparticle’s synthesis