Formulação de Nanomateriais à Base de Zinco utilizando o Extrato de Casca de Eucommia ulmoides e seu Potencial de Cicatrização de Feridas

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para sintetizar as nanopartículas de óxido de zinco (ZnO) usando o extrato aquoso rico em poliisopreno obtido da casca da árvore Eucommia ulmoides . O potencial de cicatrização de feridas exibido pelas nanopartículas de ZnO sintetizadas em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foi avaliado usando o ensaio de arranhões, um método simples, econômico e eficiente.

Resumo

O extrato aquoso da casca de Eucommia ulmoides serve como uma rica fonte de compostos bioativos com inúmeros benefícios à saúde. O protocolo aqui visa explorar a preparação de nanopartículas de óxido de zinco (ZnO) usando o extrato aquoso rico em poliisopreno mediado por casca de Eucommia ulmoides . Enquanto isso, o protocolo proposto está associado à preparação de material de cicatrização de feridas, facilitando o processo. Além disso, o potencial de cicatrização das nanopartículas sintetizadas (Eu-ZnO-NPs) foi avaliado usando um ensaio simples de arranhões em uma monocamada de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC). Após 24 h de tratamento com Eu-ZnO-NPs, a proliferação celular e a migração de células HUVEC foram avaliadas. No final do estudo, a proliferação e migração celular foram observadas em monocamada arranhada tratada com diferentes concentrações de Eu-ZnO-NPs, enquanto baixas taxas de migração e proliferação celular foram observadas em células controle. Das concentrações escolhidas, os nanomateriais de 20 μg/mL de Eu-ZnO apresentaram melhor migração celular e maior potencial de cicatrização de feridas.

Introdução

Plantas medicinais e compostos derivados de plantas demonstraram exibir inúmeros benefícios à saúde¹. A Organização Mundial da Saúde (OMS) informou que 80% da população global depende de plantas medicinais tradicionais para cuidados primários de saúde. A China é bem reconhecida e popular por suas práticas de Medicina Tradicional Chinesa (MTC). Foi relatado que as ervas medicinais chinesas tratam várias doenças e são utilizadas por seu potencial biológico. As plantas medicinais servem como reservatórios para compostos bioativos e múltiplos papéis terapêuticos. Plantas medicinais também têm sido utilizadas para tratar as feridas. Existem vários tipos de abordagens aplicadas para tratar feridas crônicas². Uma investigação recente revelou que as plantas medicinais estavam envolvidas no processo de cicatrização de feridas, proporcionando condições favoráveis à cicatrização, livres de infecções e fixação da regeneração tecidual³. Enquanto isso, as propriedades antibacterianas e antifúngicas dos compostos bioativos presentes nas plantas medicinais podem ajudar a curar feridas e acelerar a eficiência da cicatrização^{de feridas 4}.

Os nanomateriais à base de metal estão ganhando atenção devido às suas propriedades biocompatíveis e biodegradáveis. Eucommia ulmoides, comumente chamada de seringueira chinesa, é uma espécie nativa da China. As folhas e a casca da árvore são usadas em práticas medicinais. Mais importante ainda, a espécie de planta foi cultivada nas províncias central e ocidental da China⁵. Peng et ^al.6relataram que folhas, cascas e flores estaminadas eram comestíveis com potencial terapêutico. Além disso, E. ulmoides serve como a melhor fonte de lignanas, fenilpropanóides, iridóides, flavonóides, aminoácidos e oligoelementos. Além disso, a casca tem sido utilizada para várias aplicações biomédicas, como controle da pressão arterial, redução de gordura e promoção de antiosteroporose e atividade hipoglicêmica⁷. Portanto, sem dúvida, foi comprovado que o extrato de casca de E. ulmoides tem uma longa história na medicina tradicional chinesa. Relatórios anteriores sugeriram que o poliisopreno polipolímero natural é rico nas cascas de Eucommia ulmoides⁸. Com base nas informações acima, o presente trabalho tem como objetivo fabricar nanomateriais utilizando extratos de casca de Eucommia ulmoides . A combinação de zinco com extrato de casca é uma escolha atraente para a preparação de nanomateriais. No geral, o objetivo final da presente investigação foi fabricar um novo nanomaterial híbrido para aplicações de cicatrização de feridas.

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Protocolo

NOTA: Antes de preparar o extrato, o material da casca obtido foi lavado duas vezes com água deionizada e seco em local sombreado. As cascas secas à sombra foram armazenadas em um recipiente hermético.

1. Preparação do extrato de casca de Eucommia ulmoides

1. Pique a casca coletada da árvore Eucommia ulmoides em pedaços pequenos usando uma tesoura.
2. Lave os materiais da casca picada duas vezes com água destilada dupla.
3. Seque os pedaços de casca a 37 °C durante 24 h em condições de sombra.
   1. Ajuste a duração do processo de secagem com base na quantidade de casca utilizada para o estudo. Certifique-se de que as cascas estejam completamente secas antes de cortá-las em pedaços pequenos. Evite a luz solar direta.
4. Transferir 20 g de cascas secas à sombra para um balão cónico contendo 220 ml de água bidestilada estéril e aquecer a 130 °C durante 20 min.
   1. A cor da solução de reação muda para amarelo claro. As mudanças na cor da solução ocorrem após 10 min. Deixe a solução aquecer por mais 10 min. Ajuste o volume de água bidestilada com base na quantidade da amostra.
5. Conservar o extracto bruto contendo poliisopreno a 4 °C para posterior utilização. A formação de uma estrutura semelhante a um fio indica a presença de poliisopreno nos extratos.

2. Biossíntese de nanopartículas de ZnO mediadas pela casca de E. ulmoides

1. Adicionar 1 M de nitrato de zinco di-hidratado de Zn (NO₃)₂ a 50 ml de água desionizada num balão cónico de 500 ml. Agitar continuamente com agitação magnética (60 RPM). O Zn (NO₃)₂ leva 30 min para se dissolver completamente.
2. Adicione 15 mL de extrato de casca de E. ulmoides gota a gota a 20 mL de solução de nitrato de zinco 1 M di-hidratado (Zn (NO₃)₂).
3. Coloque a mistura de reação coberta em um agitador magnético, ligue o agitador e gire a (60 RPM) por 3 h.
4. Adicione 1 N de solução de hidróxido de sódio NaOH (3 mL) gota a gota à mistura de reação para ajustar o pH para 9. Adicione NaOH até que a mistura da solução fique branca leitosa e o pH não seja superior a 9. A solução torna-se uma cor branca leitosa quando as nanopartículas de ZnO são formadas.
   1. A preparação de 1 M de nitrato de zinco di-hidratado Zn (NO₃)₂ volume da solução pode variar de acordo com as necessidades experimentais. Certifique-se de usar os extratos de casca recém-preparados. Se o pH exceder 10, resultará na agregação de nanopartículas.
5. Transferir os Eu-ZnO-NPs sintetizados para um tubo de centrifugação de 50 ml e centrifugá-lo a 100 xg durante 5 min a 4 °C.
   NOTA: As impurezas podem ser evitadas por lavagem imediata.
6. Recolher os Eu-ZnO-NPs lavados numa placa de vidro e secá-los a 45-50 °C durante 1 h numa estufa de ar quente.
   NOTA: Se os Eu-ZnO-NPs forem mantidos por mais de 30 min, pode afetar a natureza físico-química das nanopartículas

3. Confirmação de tamanho usando TEM

1. Prepare 1 mg/mL de nanopartículas em DDH₂O e carregue 5 μL de amostra de Eu-ZnO-NP na grade de cobre e espere até que seque completamente. Vortex a amostra antes de carregar na grade de cobre.
2. Carregar a grelha de cobre que contém Eu-ZnO-NP no suporte de amostras MET e adquirir imagens com aumentos de 50x e 100x.
   NOTA: As grades devem ser recolhidas usando uma pinça durante esta etapa.

4. Avaliação da citotoxicidade

1. Semeie 1 × 10⁴ HUVECs em cada poço de uma placa de 96 poços e coloque-a em uma incubadora de 5% de CO₂ 37 ° C.
2. Adicione 10 μL de várias concentrações 0, 10, 20, 30, 40 e 50 μg/mL de Eu-ZnO-NPs nas células confluentes de 90% e incube-as por 24 h.
3. Após a incubação, remova o meio antigo sem perturbar as células, adicione 10 μL de solução de CCK-8 a cada poço contendo 90 μL de meio DMEM fresco e incube em uma incubadora de CO_2,37 ° C a 5%.
4. Medir a absorvância das células tratadas com solução de CCK8 a 450 nm utilizando um espectrofotómetro.
   NOTA: A absorbância foi medida imediatamente em 15 min para evitar alterações na absorbância.

5. Preparação de células HUVEC para ensaio de arranhões

1. Semear uma quantidade apropriada (1 × 10⁵) de HUVECs em 12 placas de cultura de poço contendo o meio Eagle modificado de Dulbecco com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de pen-strep e incubá-lo em uma incubadora de 5% de CO₂ 37 ° C.
   1. Antes de realizar o ensaio de arranhões, verifique a confluência usando o microscópio invertido.
      NOTA: Para realizar o ensaio de arranhões, serão utilizadas placas de 6 poços ou 12 placas com base nos requisitos, e a densidade celular variará para diferentes placas de cultura. O uso de 70% -80% de células confluentes é ideal e recomendado para ensaio de arranhões. O volume do meio DMEM pode variar de acordo com as placas de cultura utilizadas no estudo. Por exemplo, placas de 6 poços requerem 1-1,5 mL de meio de cultura e placas de 12 poços requerem 0,5-1,0 mL de meio de crescimento.
2. Faça um arranhão suavemente usando uma ponta de pipeta estéril de 200 μL na ferida representativa com uma largura de ferida de 200 μm.
3. Certifique-se de que a ponta usada para fazer arranhões na monocamada da célula entre em contato com a superfície das células.
   NOTA: Toda vez que um arranhão for feito, use a ponta estéril.
4. Remova o meio completo e lave a monocamada HUVEC usando 1 mL de 1x PBS para remover as células destacadas.
   NOTA: Certifique-se de que as células monocamada separadas sejam completamente removidas dos respectivos poços. Confirme se nenhum dano ocorreu na área criada pela ferida.
5. Para avaliar o potencial de cicatrização de Eu-ZnO-NPs sintetizados, adicione concentrações de 0 (Controle), 10 e 20 μg/mL de nanopartículas de Eu-ZnO combinadas com um meio completo com 10% de FBS nos poços. Manter as placas experimentais a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5%.
   NOTA: Não perturbe a monocamada celular ao adicionar o meio fresco e completo. Certifique-se de que as células monocamada permaneçam intactas durante a incubação.
6. Adquira microfotografia em 0 h e 24 h usando um microscópio invertido. Use a ferramenta de anotação para medir o fechamento da ferida em diferentes intervalos de tempo.
   1. Calcule a porcentagem de fechamento da ferida usando a seguinte fórmula: Fechamento da ferida (%) = [(migração celular (em μm) em 0 h - migração celular (em μm) em 24 h)/ migração celular (em μm) em 0 h] x 100.

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Resultados

A presente investigação tem como objetivo sintetizar nanopartículas utilizando as cascas da árvore Eucommia ulmoides . O material da casca foi completamente seco em ambiente sombreado (Figura 1). Os materiais da casca foram utilizados para preparar o extrato bruto aquoso de água quente, aquecendo as amostras a 130 °C por 20 min. Uma ligeira alteração na temperatura e na duração pode perturbar os fitocompostos e torná-los inadequados para ...

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Discussão

Acredita-se que a casca, a semente e as folhas de E. ulmoides exibam inúmeros benefícios à saúde. Nossos resultados mostraram que a síntese de nanopartículas de EU-ZnO foi alcançada usando uma abordagem simples e econômica. O extrato aquoso foi utilizado para sintetizar as nanopartículas. O aquecimento do material da casca em altas temperaturas pode causar degradação de alguns fitoconstituintes e diminuir a eficiência da extração. Os fitoconstituintes presentes no ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plate	NEST	703011	Used for cell culture and assay
Centrifuge	SCILOGEX	SC1406	Used to separate the nanoparticles from the colloidal mixture
Centrifuge Tube – 15 mL	BIOFIL	CFT-312150	To centrifuge the synthesized solution
Centrifuge tube – 5 mL	Biosharp	BS-50-CM-S	To store the nanoparticles
CO2 incubator	Thermo scientific	3010	To culture the HUVEC cells
Denoised water	Millipore	Not applicable	For preparation of the extract
DMEM medium	Cytiva	SH30243.01	Used for cell culture work
Funnel	Thermo scientific	42600060	To hold the filter paper during the filtration
Glass beakers	Borosilicate	1102-50	Used to prepare the aqueous extract
Hot air oven	Genetimes	Not Applicable	Used to dry the nanoparticles and collect in the powder form
Magnetic stirrer	KYLIN-BELL	GL-5250-A	Used for nanoparticles synthesis
Microscope	Nikon Eclipse	Ts2	Used to take microphotographs
Petri dish	NEST	753001	Used to collect the nanoparticles
Pipette 1 mL	Lab Science	YEA17AD0055580	To take/add the specific volume of solution/extract
Pipette tips 1 mL	SAINING	3014200-T	To take/add the specific volume of solution/extract
PTFE Magnetic Mixer Stir Bars	LAN RAN	Not applicable	Used for nanomaterial synthesis process
Sodium hydroxide	Sigma Alrich	71690	Used to adjust pH during the synthesis
Stainless Scissor	Deli	6034	Used for chopping the bark materials
T25 tissue culture flask	NEST	707001	Used to maintain the cells
Weighing Balance	Radwag	AS220R2	Used to weigh the chemicals
Whatman filter paper No.1	Newstar	GB/T1914-2017	Used to filter the extract for synthesis
Zinc nitrate	Sigma Alrich	13778-30-8	Used as precursor for the nanoparticle’s synthesis