Formulación de Nanomateriales a Base de Zinc utilizando el Extracto de Corteza de Eucommia ulmoides y su Potencial Cicatrizante de Heridas

Resumen

En este trabajo se presenta un protocolo para sintetizar las nanopartículas de óxido de zinc (ZnO) utilizando el extracto acuoso rico en poliisopreno obtenido de la corteza del árbol Eucommia ulmoides . El potencial de cicatrización de heridas exhibido por las nanopartículas de ZnO sintetizadas en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se evaluó mediante un ensayo de rasguño, un método simple, rentable y eficiente.

Resumen

El extracto acuoso de la corteza de Eucommia ulmoides es una rica fuente de compuestos bioactivos con numerosos beneficios para la salud. El protocolo aquí tiene como objetivo explorar la preparación de nanopartículas de óxido de zinc (ZnO) utilizando el extracto acuoso rico en poliisopreno mediado por corteza de Eucommia ulmoides . Por su parte, el protocolo propuesto se asocia a la preparación de material cicatrizante de heridas facilitando el proceso. Además, se evaluó el potencial de cicatrización de las nanopartículas sintetizadas (Eu-ZnO-NPs) mediante un simple ensayo de rasguño en una monocapa de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). Después de 24 h de tratamiento con Eu-ZnO-NPs, se evaluó la proliferación celular y la migración de las células HUVEC. Al final del estudio, se observó proliferación y migración celular en monocapa rayada tratada con diferentes concentraciones de Eu-ZnO-NPs, mientras que en las células de control se observaron tasas pobres de migración y proliferación celular. De las concentraciones elegidas, 20 μg/mL de nanomateriales de Eu-ZnO mostraron una mejor migración celular y un mayor potencial de cicatrización de heridas.

Introducción

Se ha demostrado que las plantas medicinales y los compuestos derivados de plantas presentan numerosos beneficios para la salud¹. La Organización Mundial de la Salud (OMS) informó que el 80% de la población mundial depende de las plantas medicinales tradicionales para la atención primaria de la salud. China es muy reconocida y popular por sus prácticas de Medicina Tradicional China (MTC). Se ha informado que las hierbas medicinales chinas tratan diversas enfermedades y se utilizan por su potencial biológico. Las plantas medicinales sirven como reservorios de compuestos bioactivos y múltiples funciones terapéuticas. También se han utilizado plantas medicinales para tratar las heridas. Existen varios tipos de abordajes aplicados para tratar las heridas crónicas². Una investigación reciente reveló que las plantas medicinales estaban involucradas en el proceso de cicatrización de heridas, proporcionando condiciones favorables para la cicatrización, libres de infecciones, y fijando la regeneración de los tejidos³. Mientras tanto, las propiedades antibacterianas y antifúngicas de los compuestos bioactivos presentes en las plantas medicinales pueden ayudar a curar heridas y acelerar la eficiencia de la cicatrización^de heridas.

Los nanomateriales basados en metales están ganando atención debido a sus propiedades biocompatibles y biodegradables. Eucommia ulmoides, comúnmente llamado árbol de caucho chino, es una especie nativa de China. Las hojas y la corteza del árbol se utilizan en prácticas medicinales. Lo más importante es que la especie de planta se cultivó en las provincias centrales y occidentales de China⁵. Peng et ^al.6informaron que las hojas, cortezas y flores estaminadas eran comestibles con potencial terapéutico. Además, E. ulmoides es la mejor fuente de lignanos, fenilpropanoides, iridoides, flavonoides, aminoácidos y oligoelementos. Además, la corteza se ha utilizado para diversas aplicaciones biomédicas, como el control de la presión arterial, la reducción de la grasa y la promoción de la antiosteroporosis y la actividad hipoglucémica⁷. De ahí que, sin duda, se haya comprobado que el extracto de corteza de E. ulmoides tiene una larga historia en la medicina tradicional china. Informes anteriores sugirieron que el poliisopreno polimérico natural es rico en las cortezas de Eucommia ulmoides⁸. Con base en la información anterior, el presente trabajo tiene como objetivo fabricar nanomateriales utilizando extractos de corteza de Eucommia ulmoides . La combinación de zinc con extracto de corteza es una opción atractiva para la preparación de nanomateriales. En general, el objetivo final de la presente investigación fue fabricar un nuevo nanomaterial híbrido para aplicaciones de cicatrización de heridas.

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Protocolo

NOTA: Antes de preparar el extracto, el material de corteza obtenido se lavó dos veces con agua desionizada y se secó en un lugar sombreado. Las cortezas secadas a la sombra se almacenaron en un recipiente hermético.

1. Preparación del extracto de corteza de Eucommia ulmoides.

1. Picar la corteza recogida del árbol Eucommia ulmoides en trozos pequeños con unas tijeras.
2. Lave los materiales de corteza picados dos veces con agua destilada doble.
3. Secar los trozos de corteza a menos de 37 °C durante 24 h en condiciones de sombra.
   1. Ajuste la duración del proceso de secado en función de la cantidad de corteza utilizada para el estudio. Asegúrese de que las cortezas estén completamente secas antes de cortarlas en trozos pequeños. Evite la luz solar directa.
4. Transferir 20 g de cortezas secadas a la sombra a un matraz cónico que contenga 220 ml de agua bidestilada estéril y calentar a 130 °C durante 20 min.
   1. El color de la solución de reacción cambia a amarillo claro. Los cambios en el color de la solución ocurren después de 10 min. Deje que la solución se caliente durante otros 10 minutos. Ajuste el volumen de agua destilada doble en función de la cantidad de muestra.
5. Almacene el extracto crudo que contiene poliisopreno a 4 °C para su uso posterior. La formación de una estructura filiforme indica la presencia de poliisopreno en los extractos.

2. Biosíntesis de nanopartículas de ZnO mediadas por la corteza de E. ulmoides

1. Añadir 1 M de nitrato de zinc dihidratado Zn (NO₃)₂ a 50 mL de agua desionizada en un matraz cónico de 500 mL. Revuelva continuamente con agitación magnética (60 RPM). El Zn (NO₃)₂ tarda 30 minutos en disolverse por completo.
2. Añadir 15 mL de extracto de corteza de E. ulmoides gota a gota a 20 mL de solución 1 M de nitrato de zinc dihidratado (Zn (NO₃)₂).
3. Coloque la mezcla de reacción cubierta en un agitador magnético, encienda el agitador y gire a (60 RPM) durante 3 h.
4. Agregue 1 solución de hidróxido de sodio NaOH (3 mL) gota a gota a la mezcla de reacción para ajustar el pH a 9. Agregue NaOH hasta que la mezcla de la solución se vuelva de color blanco lechoso y el pH no sea superior a 9. La solución adquiere un color blanco lechoso cuando se forman nanopartículas de ZnO.
   1. La preparación de 1 M de volumen de solución de nitrato de zinc dihidratado Zn (NO₃)₂ puede variar en función de las necesidades experimentales. Asegúrate de usar los extractos de corteza recién preparados. Si el pH supera 10, se producirá la agregación de nanopartículas.
5. Transfiera las Eu-ZnO-NP sintetizadas a un tubo de centrífuga de 50 ml y centrifuérelo a 100 x g durante 5 min a 4 °C.
   NOTA: Las impurezas se pueden evitar mediante un lavado inmediato.
6. Recoja los Eu-ZnO-NPs lavados en una placa de vidrio y séquelos a 45-50 °C durante 1 h en un horno de aire caliente.
   NOTA: Si las Eu-ZnO-NPs se mantienen durante más de 30 min pueden afectar a la naturaleza fisicoquímica de las nanopartículas

3. Confirmación de tamaño mediante TEM

1. Prepare 1 mg/mL de nanopartículas en DDH₂O y cargue 5 μL de muestra de Eu-ZnO-NP en la rejilla de cobre y espere hasta que se seque por completo. Agite la muestra antes de cargarla en la rejilla de cobre.
2. Cargue la rejilla de cobre que contiene Eu-ZnO-NPs en el portamuestras TEM y adquiera imágenes con aumentos de 50x y 100x.
   NOTA: Las rejillas deben recogerse con pinzas durante este paso.

4. Evaluación de la citotoxicidad

1. Siembre 1 × 10⁴ HUVECs en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y colóquelo en una incubadora de 5% de CO₂ a 37 °C.
2. Añadir 10 μL de varias concentraciones 0, 10, 20, 30, 40 y 50 μg/mL de Eu-ZnO-NPs en las células confluentes al 90% e incubar durante 24 h.
3. Después de la incubación, retire el medio viejo sin alterar las células, agregue 10 μL de solución CCK-8 a cada pocillo que contenga 90 μL de medio DMEM fresco e incube en una incubadora de 5% de CO₂, 37 °C.
4. Mida la absorbancia de las células tratadas con solución de CCK8 a 450 nm utilizando un espectrofotómetro.
   NOTA: La absorbancia se midió inmediatamente dentro de los 15 minutos para evitar los cambios en la absorbancia.

5. Preparación de células HUVEC para el ensayo de arañazos

1. Siembre una cantidad adecuada (1 × 10⁵) de HUVECs en placas de cultivo de 12 pocillos que contengan medio Eagle modificado de Dulbecco con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de estreptococo en pluma e incube en una incubadora con 5% de CO₂ a 37 °C.
   1. Antes de realizar el ensayo de arañazo, compruebe la confluencia con el microscopio invertido.
      NOTA: Para realizar el ensayo de rayado, se utilizarán placas de 6 pocillos o 12 placas según los requisitos, y la densidad celular variará para diferentes placas de cultivo. El uso de 70%-80% de células confluentes es ideal y se recomienda para el ensayo de rasguño. El volumen del medio DMEM puede variar en función de las placas de cultivo utilizadas en el estudio. Por ejemplo, las placas de 6 pocillos requieren 1-1,5 mL de medio de cultivo, y las placas de 12 pocillos requieren 0,5-1,0 mL de medio de crecimiento.
2. Rasque suavemente con una punta de pipeta estéril de 200 μL en la herida representativa con una anchura de herida de 200 μm.
3. Asegúrese de que la punta utilizada para hacer arañazos en la monocapa de la célula entre en contacto con la superficie de las células.
   NOTA: Cada vez que se haga un rasguño, use la punta estéril.
4. Retire el medio completo y lave la monocapa HUVEC con 1 mL de 1x PBS para eliminar las células desprendidas.
   NOTA: Asegúrese de que las celdas monocapa separadas se eliminen por completo de los pocillos respectivos. Confirme que no se haya producido ningún daño en el área creada por la herida.
5. Para evaluar el potencial de cicatrización de heridas de Eu-ZnO-NPs sintetizadas, agregue concentraciones de 0 (Control), 10 y 20 μg/mL de nanopartículas de Eu-ZnO combinadas con un medio completo con 10% de FBS en los pocillos. Mantener las placas experimentales a 37 °C en una incubadora con 5% de CO₂ .
   NOTA: No moleste la monocapa de celda mientras agrega el medio fresco y completo. Asegúrese de que las células monocapa permanezcan inalteradas durante la incubación.
6. Adquisición de microfotografía a las 0 h y a las 24 h con un microscopio invertido. Utilice la herramienta de anotación para medir el cierre de la herida en diferentes intervalos de tiempo.
   1. Calcule el porcentaje de cierre de la herida utilizando la siguiente fórmula: Cierre de la herida (%) = [(migración celular (en μm) a 0 h - migración celular (en μm) a 24 h)/ migración celular (en μm) a 0 h] x 100.

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Resultados

La presente investigación tiene como objetivo sintetizar nanopartículas utilizando las cortezas del árbol Eucommia ulmoides . El material de la corteza se secó completamente en un ambiente sombreado (Figura 1). Los materiales de corteza se utilizaron para preparar el extracto crudo acuoso de agua caliente calentando las muestras a 130 °C durante 20 min. Una ligera alteración en la temperatura y la duración puede alterar los fitocompuestos y h...

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Discusión

Se cree que la corteza, la semilla y las hojas de E. ulmoides exhiben numerosos beneficios para la salud. Nuestros resultados han demostrado que la síntesis de nanopartículas de ZnO de EU-se logró utilizando un enfoque sencillo y rentable. El extracto acuoso se utilizó para sintetizar las nanopartículas. El calentamiento del material de la corteza a altas temperaturas puede causar la degradación de algunos fitoconstituyentes y disminuir la eficiencia de extracción. Los fi...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plate	NEST	703011	Used for cell culture and assay
Centrifuge	SCILOGEX	SC1406	Used to separate the nanoparticles from the colloidal mixture
Centrifuge Tube – 15 mL	BIOFIL	CFT-312150	To centrifuge the synthesized solution
Centrifuge tube – 5 mL	Biosharp	BS-50-CM-S	To store the nanoparticles
CO2 incubator	Thermo scientific	3010	To culture the HUVEC cells
Denoised water	Millipore	Not applicable	For preparation of the extract
DMEM medium	Cytiva	SH30243.01	Used for cell culture work
Funnel	Thermo scientific	42600060	To hold the filter paper during the filtration
Glass beakers	Borosilicate	1102-50	Used to prepare the aqueous extract
Hot air oven	Genetimes	Not Applicable	Used to dry the nanoparticles and collect in the powder form
Magnetic stirrer	KYLIN-BELL	GL-5250-A	Used for nanoparticles synthesis
Microscope	Nikon Eclipse	Ts2	Used to take microphotographs
Petri dish	NEST	753001	Used to collect the nanoparticles
Pipette 1 mL	Lab Science	YEA17AD0055580	To take/add the specific volume of solution/extract
Pipette tips 1 mL	SAINING	3014200-T	To take/add the specific volume of solution/extract
PTFE Magnetic Mixer Stir Bars	LAN RAN	Not applicable	Used for nanomaterial synthesis process
Sodium hydroxide	Sigma Alrich	71690	Used to adjust pH during the synthesis
Stainless Scissor	Deli	6034	Used for chopping the bark materials
T25 tissue culture flask	NEST	707001	Used to maintain the cells
Weighing Balance	Radwag	AS220R2	Used to weigh the chemicals
Whatman filter paper No.1	Newstar	GB/T1914-2017	Used to filter the extract for synthesis
Zinc nitrate	Sigma Alrich	13778-30-8	Used as precursor for the nanoparticle’s synthesis