Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نماذج الفئران في الجسم الحي هي أدوات لا غنى عنها للتحقيق في الآليات المرضية والأهداف العلاجية للسكتة الدماغية الإقفارية. سيصف هذا العمل أداء تلطيخ التألق المناعي في شرائح الدماغ المصابة بالاحتشاء بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) في الفئران.

Abstract

السكتة الدماغية هي سبب رئيسي للوفاة والعجز في جميع أنحاء العالم. معظم حالات السكتة الدماغية هي إقفارية وتنتج عن انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCA). الأساليب الدوائية الحالية لعلاج السكتة الدماغية الإقفارية محدودة. لذلك ، هناك حاجة ماسة إلى علاجات جديدة توفر حماية عصبية فعالة ضد الإصابة الإقفارية بعد السكتة الدماغية. في أنسجة المخ بعد السكتة الدماغية الإقفارية ، يمكن إنقاذ منطقة شبه الظلال الإقفارية ولكنها معرضة لخطر التقدم إلى ضرر لا رجعة فيه. المنطقة شبه الظلية المحيطة باللب الاحتشاء هي هدف مفاهيمي للحماية العصبية. نظرا لأن تدفق الدم يتم الحفاظ عليه جزئيا في المنطقة شبه الظلية ، فإن الخلايا العصبية وغير العصبية في هذه المنطقة تعيش بشكل عابر بعد السكتة الدماغية ، ويمكن إنقاذ هذه الخلايا التي لا تزال قابلة للحياة من خلال التدخلات الطبية المناسبة. يعد فهم الفيزيولوجيا المرضية للظلال أمرا مهما في تطوير العلاجات الوقائية العصبية لأن مسارات موت الخلايا التي يتم تنشيطها في شبه الظل الإقفاري قد تشير إلى أهداف علاجية ، مثل RUNX1 والقسطربسين. يمكن استغلال أهداف البروتين هذه التي تعمل كوسطاء لموت الخلايا المبرمج بشكل أكبر في الأبحاث الانتقالية. مع الحجم المعتدل والتشابه مع الدماغ البشري ، يحاكي نموذج الفئران في الجسم الحي لانسداد MCA (MCAO) السكتة الدماغية الإقفارية البشرية ويوفر أداة قابلة للتطبيق للتحقيق في أمراض شبه الظلي ، وفحص إشارات موت الخلية ، وتقييم تأثيرات الأهداف المحتملة في سياق MCAO. هنا ، نصف كيفية تحفيز MCAO في الفئران وكيفية إجراء تلطيخ التألق المناعي للكشف عن إشارات موت الخلايا في دماغ الفئران بعد MCAO.

Introduction

السكتة الدماغية هي سبب رئيسي للوفاة والعجز في جميع أنحاءالعالم 1. يؤدي ارتفاع معدل الوفيات والمراضة الناجمة عن السكتة الدماغية إلى عبء هائل على الرعاية الصحية العامة وعواقب اجتماعية واقتصادية وخيمة. على الرغم من أن معدل حدوث السكتة الدماغية والوفيات لا يزال مستقرا ، إلا أن عدد مرضى السكتة الدماغية والوفيات المرتبطة بالسكتة الدماغية يتزايد على مدى عقود2،3. يمكن تصنيف السكتات الدماغية على أنها إقفارية أو نزفية. غالبية حالات السكتة الدماغية هي سكتات دماغية إقفارية ناتجة عن انسداد الشريان الدماغيالرئيسي 4. حتى الآن ، منشط البلازمينوجين للأنسجة (tPA) هو الدواء الوحيد المعتمد من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية للسكتة الدماغية الإقفارية ، لكن تطبيقه محدود للغاية بسبب النافذة العلاجية الضيقة والمضاعفات وموانعالاستعمال 5،6،7. وبالتالي ، من الضروري تطوير خيارات علاجية جديدة مع نافذة علاجية أوسع للتخفيف من آثار السكتة الدماغية.

النماذج الحيوانية التجريبية هي أدوات مفيدة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للسكتة الدماغية الإقفارية. في معظم المرضى من البشر ، تحدث السكتة الدماغية الإقفارية بسبب انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCA)8. لذلك ، تم تطوير نماذج القوارض لانسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) لتشبه احتشاء الدماغ البشري. في حين أن هناك العديد من مناهج MCAO المستخدمة في الدراسات التي أجريت على الصغيرة ، فإن الطريقة الأكثر استخداما هي نموذج الخياطة داخل اللمعة ، والذي يتضمن إدخال خيوط نايلون في الشريان الدماغي الأوسط من الشرايين السباتية الخارجية أو الداخلية ، مما يؤدي إلى انسداد عابر أو دائم لتدفق الدم4،9. يؤدي هذا النموذج إلى حجم كبير من الاحتشاء الدماغي ويسمح بفحص إشارات موت الخلايا في أنسجة المخ المحتضنة باستخدام تقنيات الفلورسنت المناعي.

المنطقة المحيطة باللب الاحتشاني ، والتي يشار إليها باسم شبه الظل ، هي الهدف لعلاجات السكتة الدماغية المحتملة10،11. نظرا لأن تدفق الدم في شبه الظلال يتم الحفاظ عليه جزئيا ، يمكن إنقاذ الخلايا العصبية المصابة والخلايا غير العصبية في هذه المنطقة عن طريق تثبيط تنشيط إشارات موت الخلية. قد يكون استهداف مسارات موت الخلايا استراتيجية واعدة للحماية العصبية بعد السكتة الدماغية12. لذلك ، يعد تقييم إشارات موت الخلايا أمرا بالغ الأهمية لأبحاث السكتة الدماغية التجريبية. في الآونة الأخيرة ، ثبت أن الكاثيبسين ب ، وهو بروتياز ليزوزومي ، يلعب دورا في التوسط في موت الخلايا المبرمج بعد السكتة الدماغية ، وقد اكتسب اهتماما كبيرا في المجال العصبي13. يمثل Cathepsin-B هدفا محتملا للحماية العصبية التي تستحق مزيدا من التحقيق.

توضح هذه المقالة كيفية تحفيز MCAO باستخدام نهج الخياطة داخل اللمعة في الفئران. نوضح أيضا كيفية إجراء تلطيخ 2،3،5-ثلاثي فينيل تترازاليوم كلوريد (TTC) لتحديد حجم الاحتشاء واكتشاف الخلايا المبرمج باستخدام تلطيخ ديوكسي نيوكليوتيديل ترانسفيراز dUTP (TUNEL).

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول والتجارب المبلغ عنها هنا من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية بجامعة سيتشوان. كانت رعاية واستخدامها متوافقة مع المعايير الأخلاقية المحلية والدولية.

ملاحظة: تم استخدام ذكور فئران Sprague-Dawley البالغة التي تزن 250-280 جم في هذه الدراسة. تم إيواء الفئران في حالة بيئية قياسية (درجة حرارة 20-22 درجة مئوية ، 12 ساعة دورة ضوء / مظلمة) ، تتغذى على نظام غذائي قياسي لتركيبة الفئران ومياه عالية النقاء. تم إجراء العملية الجراحية في ظل ظروف معقمة.

1. نموذج الفئران من MCAO

  1. تحفيز التخدير الأولي باستخدام 4٪ إيزوفلوران مع الأكسجين بمعدل 1 لتر / دقيقة. مراقبة عمق التخدير عن طريق قرصة القدم. أثناء تحقيق التخدير ، قم بإعطاء مرهم العين لمنع الجفاف. حقن الفئران ب 1 مل من المحلول الملحي تحت الجلد كتجديد للحجم ومع 5 ملغم / كجم كاربروفين و 0.1 مجم / كجم بوبرينورفين لعلاج تسكين الألم قبل الجراحة. قلل الأيزوفلوران إلى 3.5٪ في البداية ثم إلى 2٪ تدريجيا طوال الجراحة.
  2. ضع الجرذ في وضع ضعيف وحافظ على درجة حرارة الجسم عند 36.5 ± 0.1 درجة مئوية على حصيرة حرارية منظمة مع مسبار لمراقبة درجة حرارة المستقيم. حلق وتطهير الجلد في الرقبة بمحلول مطهر باليودوفور.
  3. قم بعمل شق خط الوسط بطول 2 سم في الرقبة وسحب الأنسجة الرخوة لفضح الأوعية السباتية. استخدم الملقط لعزل الشريان السباتي المشترك الأيمن (CCA) والشريان السباتي الخارجي (ECA) والشريان السباتي الداخلي (ICA).
  4. استخدم الغرز لربط CCA الأيمن القريب وتثبيت ICA و ECA الأيمن بمشبك دقيق في أصلهما.
  5. أدخل خيوطا أحادية من النايلون مطلية بطرف سيليكون دائري في تجويف CCA من خلال شق صغير واربط عقدة في CCA لمنع النزيف وإزاحة خيوط النايلون الأحادي.
  6. افتح مشبك ICA الصغير الأيمن وأدخل الشعيرات الأحادية المصنوعة من النايلون في الشريان الدماغي الأوسط الأيمن (MCA) من خلال جذع ICA حتى يحجب طرف السيليكون أصل MCA (~ 18-20 مم).
  7. اقطع الجزء المكشوف من الشعيرات الأحادية المصنوعة من النايلون وأغلق شق خط الوسط الرقبة.
  8. بعد 2 ساعة انسداد MCA ، افتح شق الرقبة وفك العقدة في CCA. ثم اسحب الشعيرات الأحادية من النايلون لإعادة إنفاذ MCA. اربط CCA الأيمن البعيد ، وأغلق شق الرقبة إما بخيوط مستمرة أو متقطعة.
  9. بعد الجراحة، يعطى البوبرينورفين عن طريق الحقن تحت الجلد كل 8 ساعات، بجرعة 0.03 ملغم/كغ. راقب الفئران طوال فترة التعافي من التخدير في قفص ساخن مع حصيرة تسخين منظمة لدرجة الحرارة. لتشجيع الأكل ، ضع طبق بتري مع طعام مهروس في القفص. ضع فأرا واحدا لكل قفص بعد الجراحة.
  10. إخضاع الفئران الزائفة لنفس الإجراء دون إدخال الشعيرات الأحادية.
    ملاحظة: يتم استخدام ما مجموعه 9 في كل مجموعة لقياس حجم الاحتشاء (ن = 3) ، وتحليل التألق المناعي (ن = 3) ، والكشف عن موت الخلايا المبرمج (ن = 3).
  11. قم بتقييم الوظيفة العصبية بعد ساعتين من MCAO و 22 ساعة بعد إعادة التروية باستخدام مقياس التصنيف السلوكي Zea-Longa بمقياس 0-5 نقاط14. استبعاد المعدلات بدرجة 0 أو 4.

2. قياس حجم الاحتشاء (الشكل 1)

  1. التضحية بالفئران تحت التخدير العميق (4 ٪ إيزوفلوران) عن طريق المقصلة وعزل الدماغ كله بعناية عن الجمجمة.
  2. قم بتجميد الدماغ عند -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وقطع الدماغ المجمد إلى ست شرائح إكليلية بمسافة 2 مم بين الشرائح. قم بتلطيخ شرائح الدماغ بنسبة 2٪ TTC لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام.
  3. قم بإصلاح شرائح الدماغ بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بتصوير الشرائح الملطخة بكاميرا رقمية ، مع إعداد الوضع التلقائي للأشياء المقربة.
  4. انقل الصور إلى جهاز كمبيوتر وقم بقياس حجم الاحتشاء باستخدام ImageJ. قدم حجم الاحتشاء كنسبة مجموع منطقة الاحتشاء في 6 شرائح إلى مجموع منطقة الدماغ بأكملها في نفس الشرائح. التعبير عن البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM).

3. تحليل التألق المناعي على الدماغ بالتبريد (الشكل 2)

  1. تحفيز التخدير بنسبة 4٪ أيزوفلوران و 1 لتر / دقيقة من الأكسجين. شق الجلد والأنسجة تحت الجلد لكشف القلب.
  2. قم بإزالة التامور وقم بعمل قطع صغير في الأذين الأيمن. قم بنشر 200 مل من المحلول الملحي عبر البطين الأيسر ، متبوعا ب 200 مل من 4٪ بارافورمالدهايد.
  3. افتح الجمجمة وأزل الدماغ السليم.
  4. إصلاح الدماغ في 4٪ بارافورمالدهيد في RT لأكثر من 24 ساعة. ثم قم بتجفيفه في سلسلة من تدرجات محلول السكروز بتركيزات 10٪ و 15٪ و 30٪ حتى تغرق الأنسجة ، حوالي 6-8 ساعات لكل تركيز.
  5. قم بتضمين الدماغ في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) وإزالة فقاعات الهواء إن وجدت. بعد ذلك ، قم بتجميد الدماغ في النيتروجين السائل وتخزينه في الفريزر -80 درجة مئوية.
  6. قسم الدماغ باستخدام ناظم البرد بسمك 5 ميكرومتر. طوال فترة التقسيم ، تأكد من بقاء درجة حرارة الخزانة بين -18 درجة مئوية و -20 درجة مئوية. قم بتسمية موقع التقسيم بناء على موقع النموذج والظروف التجريبية. قم بتخزين الأقسام في الفريزر.
  7. اسمح للأقسام المجمدة بالتوازن عند RT لمدة ~ 30 دقيقة لإجراء تلطيخ التألق المناعي. ثم انقع الأقسام ب PBS 3x المعقم لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  8. حدد الخطوط العريضة للأنسجة بقلم الكيمياء المناعية. احتضان مع 20 ميكروغرام / مل بروتيناز K (خال من RNase) و 0.3٪ Triton X-100 في RT لمدة 10 دقائق.
  9. انقع الأقسام ب PBS 3x المعقم لمدة 5 دقائق لكل منهما. ضع 3٪ BSA على الأنسجة المحددة واحتضنه في RT لمدة 1 ساعة للانسداد.
  10. بعد الحظر ، قم بإزالة المحلول ، وأضف الجسم المضاد الأساسي المناسب (الجسم المضاد أحادي النسيلة أحادي النسيلة للأرانب ، 1: 200) ، واحتضان الأقسام طوال الليل في الظلام عند 4 درجات مئوية.
  11. قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي وغسل الأقسام باستخدام PBS معقم يحتوي على 0.1٪ Tween-20 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  12. أضف الجسم المضاد الثانوي المناسب (Goat Anti-Rat IgG [H + L] [FITC Conrupated] ، 1: 200) مع الفلوروفور المطلوب ، واحتضان الأقسام في غرفة مرطبة في RT لمدة 1 ساعة ، مما يحميها من الضوء.
  13. بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية ، اغسل الأقسام ب PBS معقم يحتوي على 0.1٪ Tween-20 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما. قم بتلطيخ الأقسام بوسيط تثبيت يحتوي على DAPI وقم بتغطيتها بغطاء غطاء.
  14. التقط الصور باستخدام مجهر مضان بالإعدادات التالية: الطول الموجي للإثارة 488 نانومتر ، والطول الموجي للانبعاث 520 نانومتر ، ووقت التعرض 500 مللي ثانية. قم بتخزين الأقسام في الظلام عند 4 درجات مئوية لحفظها على المدى الطويل.

4. الكشف عن موت الخلايا المبرمج عن طريق تلطيخ TUNEL (الشكل 3)

ملاحظة: يتم استخدام مجموعة فحص TUNEL التجارية لتلوين TUNEL. تشتمل مجموعة TUNEL هذه على حل عمل DNase I Buffer ، ومخزن مؤقت لتوازن deoxynucleotidyl transferase (TdT) ، وحل عمل وضع العلامات ، وحل عمل DAPI.

  1. قم بنشر وعزل الدماغ باستخدام نفس الإجراء المذكور أعلاه (الخطوات 3.2-3.3). اغمر الدماغ في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 3-4 ساعات للتثبيت.
  2. قطع الدماغ إلى شرائح إكليلية بسمك 2 مم تقريبا ، بدءا من النهاية المنقارية إلى النهاية الذيلية ، واغمر في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 12 ساعة إضافية. بعد التثبيت ، اغسل شرائح الدماغ في الماء الجاري لمدة 1 ساعة.
  3. اغمر شرائح الدماغ في محاليل الإيثانول بتركيزات 50٪ و 70٪ و 80٪ و 90٪ و 95٪ و 100٪ بالتتابع لمدة 35-50 دقيقة لكل منها للجفاف.
  4. عالج شرائح الدماغ بعامل بيولوجي شفاف من النوع TO-Type I لمدة 35-50 دقيقة ، متبوعا بعامل المقاصة الثاني لمدة 35-50 دقيقة ، حتى تصبح الأنسجة شفافة تماما.
  5. اغمر شرائح الدماغ بالتتابع في وسط التضمين I لمدة 60 دقيقة ، وتضمين الوسط II لمدة 60 دقيقة ، وتضمين الوسط III لمدة 60 دقيقة ، وتضمين الوسط IV لمدة 60 دقيقة.
  6. ضع شرائح الدماغ في شريط التضمين. أغلق الكاسيت ، وقم بتسميه بوضوح ، وضعه في غرفة تخزين باردة للتصلب.
  7. اضبط الميكروتوم على سمك أولي يبلغ 10 ميكرومتر لتقليم كتلة الأنسجة. ثم اضبط السماكة على 5 ميكرومتر للتقطيع.
  8. قم بتسخين الحمام المائي إلى 45 درجة مئوية ، وقم بتعويم أقسام الأنسجة على سطح الماء ، والتقطها على الشرائح. بعد حوالي 30 ثانية ، قم بإزالة الشرائح وجففها في RT وتخزينها في صندوق تجفيف.
  9. قم بإزالة البارافينات من أقسام الدماغ المخزنة عن طريق غمرها في عامل مقاصة لمدة دورتين ، 10 دقائق لكل منهما.
  10. لإعادة ترطيب الأقسام ، انقعها في الإيثانول اللامائي لمدة 5 دقائق ، وكرر ذلك 3 مرات. انقل الأقسام إلى 90٪ إيثانول لمدة 3 دقائق. علاوة على ذلك ، انقع الأقسام في 80٪ من الإيثانول لمدة 3 دقائق. أخيرا ، اغمر الأقسام في 70٪ من الإيثانول لمدة 3 دقائق.
  11. اشطف العينات في PBS 3x لمدة 5 دقائق لكل منها. قم بإزالة الرطوبة الزائدة برفق باستخدام ورق الترشيح.
  12. قم بإدارة 100 ميكرولتر من محلول عمل 1x بروتيناز K لكل عينة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد النفاذية ، اشطف العينات في PBS 3x لمدة 5 دقائق لكل منها.
  13. تحضير العينات للتحكم الإيجابي.
    1. أضف 100 ميكرولتر من محلول عمل 1x DNase I Buffer (مجموعة مقايسة TUNEL) إلى العينة المنفذة واسمح لها بالتوازن عند RT لمدة 5 دقائق. قم بإزالة أي سائل زائد من العينة بعناية باستخدام ورق ماص.
    2. أضف 100 ميكرولتر من محلول العمل المخفف DNase I (200 وحدة / مل) إلى العينة واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 10-30 دقيقة. اشطف العينات في PBS 3x لمدة 5 دقائق لكل منها.
  14. تحضير عينات للتحكم السلبي.
    1. قم بتطبيق 100 ميكرولتر من محلول عمل 1x DNase I Buffer على العينة المنفذة وقم بالتوازن عند RT لمدة 5 دقائق. احتضان عينة التحكم السلبية باستخدام DNase I Buffer عند 37 درجة مئوية لمدة 10-30 دقيقة ، مع ضمان عدم إضافة إنزيم DNase I. اشطف العينات في PBS 3x لمدة 5 دقائق لكل منها.
  15. ضع 100 ميكرولتر من محلول التوازن ديوكسي نيوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي (TdT) على كل عينة واحتضانه في غرفة مرطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 10-30 دقيقة. ثم قم بإزالة المخزن المؤقت لتوازن TdT بورق ماص.
  16. أضف 50 ميكرولتر من محلول عمل الملصقات (مجموعة فحص TUNEL) إلى كل عينة ، ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة ومظلمة لمدة 60 دقيقة. إذا كانت شدة الإشارة منخفضة ، ففكر في تمديد وقت تفاعل وضع العلامات على الحمض النووي. ثم اشطف العينات في PBS 3x لمدة 5 دقائق لكل منها.
  17. بعد نشاف الرطوبة الزائدة ، ضع محلول عمل DAPI (مجموعة فحص TUNEL) واحتضنه في RT في الظلام لمدة 5 دقائق لمواجهة النوى. ثم اشطف العينات في PBS 4x لمدة 5 دقائق لكل منها. قم بإزالة السائل الزائد بورق ماص ، وأغلق الشرائح باستخدام وسيط تثبيت مضاد للبهتان.
  18. امسح الشرائح الملطخة ضوئيا باستخدام نظام التصوير متعدد الأطياف Vectra Polaris وقم بتحليل البيانات باستخدام برنامج النظام.

5. التحليل الإحصائي

  1. اعرض النتائج التجريبية كوسيلة ± SEM وقم بتحليل البيانات باستخدام اختبار Student's t لمقارنتين جماعيتين باستخدام برنامج GraphPad Prism 10 (برنامج GraphPad ، سان دييغو ، كاليفورنيا).
  2. قم بتعيين قيمة p أقل من 0.05 كفرق إحصائي.

النتائج

تتعرض الفئران لنقص تروية لمدة 120 دقيقة أثناء MCAO متبوعا بإعادة التروية لمدة 22 ساعة. كان معدل الوفيات ضئيلا أثناء جراحة MCAO وكان حوالي 25٪ خلال فترة إعادة التروية. لوحظ تلف كبير في الدماغ في مجموعة MCAO ، في حين لم يلاحظ أي احتشاء في مخ مجموعة الشام (24.87 ± 1.21٪ مقابل 0٪ من مجموع منط?...

Discussion

يؤدي انسداد الشريان الدماغي إلى الحرمان من الأكسجين والتغذية ، يليه تنشيط أنواع الأكسجين التفاعلية ، والحمل الزائد للكالسيوم داخل الخلايا ، وإفراز الغلوتامات ، وتحريض الاستجابات الالتهابية15. تؤدي هذه السلسلة من الأحداث إلى موت الخلايا وتلف الأنسجة الذي ل...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم Simiao Wu من قبل قسم العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان (2024YFHZ0330) ومستشفى غرب الصين بجامعة سيتشوان. Weihong He تم دعمه من قبل قسم العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان (2023YFS0297) وجامعة سيتشوان. نشكر Yi Zhang و Yue Li في منشأة الأبحاث الأساسية ، مستشفى غرب الصين بجامعة سيتشوان ، على دعمهم الفني في تصوير وتحليل TUNEL.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Akoya Vectra PolarisAkoya BiosciencesN/AVectra Polaris multispectral imaging system 
Anhydrous ethanolChengdu Jinshan Chemical Reagent Co.N/A
BuprenorphineWest China HospitalN/A
CarprofenWest China HospitalN/A
Cathepsin-B antibodyAbcamAb214428
CryostatLEICA LEICA CM 1950
Digital cameraOLYMPUSTG-7
Goat Anti-Rat IgG (H+L) (FITC conjugated)Elabscience E-AB-1021
Goat serumSolarbioSL038
GraphPad Prism 10 softwareN/Ahttps://www.graphpad-prism.cn/?c=i&a=prismdownload_cn
ImageJN/Ahttps://imagej.net/ij/
Immunohistochemistry penBiosharphttp://www.biosharp.cn/index/product/details/language/en/product_id/2828.html
InForm softwareAkoya BiosciencesVersion 2.6.0system software for the multispectral imaging system 
Iodophor disinfecting solutionHuatian Technology Industry Co.N/A
IsofluraneRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/
Mounting medium containing DAPISolarbioS2110
Nylon monofilamentRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/
Optimal cutting temperature (OCT) compoundEprediaN/A
ParaformaldehydeBiosharpN/A
Phosphate buffer solution (PBS)SolarbioN/A
PrismGraphPad Version 10
Proteinase KTiangenRT403-02
SalineKelun Co.N/A
Sprague-Dawley ratsHuafukang Co.N/A
SucroseBioFroxx1245GR500
Surgical instrumentsRWD Life Science Co.N/A
TO-type transparent biological agent  Beijing Solarbio Science & Tecnology Co., Ltd.http://www.solarbio.net/
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solutionSolarbioG3005
Triton X-100BioFroxx1139ML100
TUNEL kitElabscience E-CK-A321

References

  1. Tsao, C. W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2023 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 147 (8), e93-e621 (2023).
  2. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  3. Hankey, G. J. Stroke. Lancet. 389 (10069), 641-654 (2017).
  4. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).
  5. Barthels, D., Das, H. Current advances in ischemic stroke research and therapies. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (4), 165260 (2020).
  6. Frank, D., Zlotnik, A., Boyko, M., Gruenbaum, B. F. The development of novel drug treatments for stroke patients: A review. Int J Mol Sci. 23 (10), 5796 (2022).
  7. Wang, S. -. N., et al. Humanized cerebral organoids-based ischemic stroke model for discovering of potential anti-stroke agents. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (3), 513-523 (2023).
  8. Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol Biochem Behav. 87 (1), 179-197 (2007).
  9. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  10. Donnan, G. A., Baron, J. C., Ma, H., Davis, S. M. Penumbral selection of patients for trials of acute stroke therapy. Lancet Neurol. 8 (3), 261-269 (2009).
  11. Lo, E. H. A new penumbra: transitioning from injury into repair after stroke. Nat Med. 14 (5), 497-500 (2008).
  12. Datta, A., et al. Cell death pathways in ischemic stroke and targeted pharmacotherapy. Transl Stroke Res. 11 (6), 1185-1202 (2020).
  13. Gaire, B. P., Subedi, L., Teramoto, H., Hu, B. . Cerebral Ischemia. , (2021).
  14. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  15. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  16. Fisher, M. The ischemic penumbra: identification, evolution and treatment concepts. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 1-6 (2004).
  17. Adams, H. P., et al. Guidelines for the early management of adults with ischemic stroke: A guideline from the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, Clinical Cardiology Council, Cardiovascular Radiology and Intervention Council, and the Atherosclerotic Peripheral Vascular Disease and Quality of Care Outcomes in Research Interdisciplinary Working Groups: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Circulation. 115 (20), e478-e534 (2007).
  18. Fonarow, G. C., et al. Timeliness of tissue-type plasminogen activator therapy in acute ischemic stroke: patient characteristics, hospital factors, and outcomes associated with door-to-needle times within 60 minutes. Circulation. 123 (7), 750-758 (2011).
  19. Yamori, Y., Horie, R., Handa, H., Sato, M., Fukase, M. Pathogenetic similarity of strokes in stroke-prone spontaneously hypertensive rats and humans. Stroke. 7 (1), 46-53 (1976).
  20. Bogousslavsky, J., Van Melle, G., Regli, F. The Lausanne stroke registry: analysis of 1,000 consecutive patients with first stroke. Stroke. 19 (9), 1083-1092 (1988).
  21. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1 (1), 53-60 (1981).
  22. Garcia, J. H., Liu, K. F., Ho, K. L. Neuronal necrosis after middle cerebral artery occlusion in Wistar rats progresses at different time intervals in the caudoputamen and the cortex. Stroke. 26 (4), 636-642 (1995).
  23. Türeyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56 (1 Suppl), 196-200 (2005).
  24. Spratt, N. J., et al. Modification of the method of thread manufacture improves stroke induction rate and reduces mortality after thread-occlusion of the middle cerebral artery in young or aged rats. J Neurosci Methods. 155 (2), 285-290 (2006).
  25. Naqvi, S. A. R., et al. . Biochemistry of Drug Metabolizing Enzymes. , (2022).
  26. Yadati, T., Houben, T., Bitorina, A., Shiri-Sverdlov, R. The ins and outs of cathepsins: Physiological function and role in disease management. Cells. 9 (7), 1679 (2020).
  27. Liu, C. L., et al. Cysteine protease cathepsins in cardiovascular disease: from basic research to clinical trials. Nat Rev Cardiol. 15 (6), 351-370 (2018).
  28. O'Toole, D., et al. Signalling pathways linking cysteine cathepsins to adverse cardiac remodelling. Cell Signal. 76, 109770 (2020).
  29. Luke, C. J., et al. Lysoptosis is an evolutionarily conserved cell death pathway moderated by intracellular serpins. Commun Biol. 5 (1), 47 (2022).
  30. Xie, Z., et al. Cathepsin B in programmed cell death machinery: mechanisms of execution and regulatory pathways. Cell Death Dis. 14 (4), 255 (2023).
  31. Nagakannan, P., Islam, M. I., Conrad, M., Eftekharpour, E. Cathepsin B is an executioner of ferroptosis. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (3), 118928 (2021).
  32. Conus, S., Simon, H. U. Cathepsins: key modulators of cell death and inflammatory responses. Biochem Pharmacol. 76 (11), 1374-1382 (2008).
  33. Bhoopathi, P., et al. Cathepsin B facilitates autophagy-mediated apoptosis in SPARC overexpressed primitive neuroectodermal tumor cells. Cell Death Differ. 17 (10), 1529-1539 (2010).
  34. Ding, X., Zhang, C., Chen, H., Ren, M., Liu, X. Cathepsins trigger cell death and regulate radioresistance in glioblastoma. Cells. 11 (24), 4108 (2022).
  35. He, W., et al. Inhibition of myocardial cathepsin-L release during reperfusion following myocardial infarction improves cardiac function and reduces infarct size. Cardiovasc Res. 118 (6), 1535-1547 (2022).
  36. McCarroll, C. S., et al. Runx1 deficiency protects against adverse cardiac remodeling after myocardial infarction. Circulation. 137 (1), 57-70 (2018).
  37. Song, J., et al. Age-related promoter-switch regulates Runx1 expression in adult rat hearts. BMC Cardiovasc Disord. 23 (1), 541 (2023).
  38. Riddell, A., et al. RUNX1: an emerging therapeutic target for cardiovascular disease. Cardiovasc Res. 116 (8), 1410-1423 (2020).
  39. Chen, H., et al. Pharmacological inhibition of RUNX1 reduces infarct size after acute myocardial infarction in rats and underlying mechanism revealed by proteomics implicates repressed cathepsin levels. Funct Integr Genomics. 24 (3), 113 (2024).
  40. Petanceska, S., Burke, S., Watson, S. J., Devi, L. Differential distribution of messenger RNAs for cathepsins B, L and S in adult rat brain: an in situ hybridization study. Neuroscience. 59 (3), 729-738 (1994).
  41. Chaitanya, G. V., Babu, P. P. Activation of calpain, cathepsin-b and caspase-3 during transient focal cerebral ischemia in rat model. Neurochem Res. 33 (11), 2178-2186 (2008).
  42. Yuan, D., Liu, C., Wu, J., Hu, B. Inactivation of NSF ATPase leads to cathepsin b release after transient cerebral ischemia. Transl Stroke Res. 9 (3), 201-213 (2018).
  43. Hill, I. E., Preston, E., Monette, R., MacManus, J. P. A comparison of cathepsin B processing and distribution during neuronal death in rats following global ischemia or decapitation necrosis. Brain Res. 751 (2), 206-216 (1997).
  44. Kilinc, M., et al. Lysosomal rupture, necroapoptotic interactions and potential crosstalk between cysteine proteases in neurons shortly after focal ischemia. Neurobiol Dis. 40 (1), 293-302 (2010).
  45. Seyfried, D., et al. Cathepsin B and middle cerebral artery occlusion in the rat. J Neurosurg. 87 (5), 716-723 (1997).
  46. Saido, T. C., Yokota, M. Neurodegenerative diseases as proteolytic disorders: brain ischemia and Alzheimer's disease. Tanpakushitsu Kakusan Koso. 42 (14 Suppl), 2408-2417 (1997).
  47. Zuo, X., et al. Inhibition of cathepsins b induces neuroprotection against secondary degeneration in ipsilateral substantia nigra after focal cortical infarction in adult male rats. Front Aging Neurosci. 10, 125 (2018).
  48. Zuo, X., et al. Inhibition of cathepsin b alleviates secondary degeneration in ipsilateral thalamus after focal cerebral infarction in adult rats. J Neuropathol Exp Neurol. 75 (9), 816-826 (2016).
  49. Pluta, R., Salínska, E., Puka, M., Stafiej, A., Lazarewicz, J. W. Early changes in extracellular amino acids and calcium concentrations in rabbit hippocampus following complete 15-min cerebral ischemia. Resuscitation. 16 (3), 193-210 (1988).
  50. Hatsuta, H., et al. Tau and TDP-43 accumulation of the basal nucleus of Meynert in individuals with cerebral lobar infarcts or hemorrhage. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 49 (2019).
  51. van Groen, T., Puurunen, K., Mäki, H. M., Sivenius, J., Jolkkonen, J. Transformation of diffuse beta-amyloid precursor protein and beta-amyloid deposits to plaques in the thalamus after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats. Stroke. 36 (7), 1551-1556 (2005).
  52. Gómez-Sintes, R., Ledesma, M. D., Boya, P. Lysosomal cell death mechanisms in aging. Ageing Res Rev. 32, 150-168 (2016).
  53. Heimer, S., Knoll, G., Schulze-Osthoff, K., Ehrenschwender, M. Raptinal bypasses BAX, BAK, and BOK for mitochondrial outer membrane permeabilization and intrinsic apoptosis. Cell Death Dis. 10 (8), 556 (2019).
  54. Elena-Real, C. A., et al. Cytochrome c speeds up caspase cascade activation by blocking 14-3-3ε-dependent Apaf-1 inhibition. Cell Death Dis. 9 (3), 365 (2018).
  55. Linfante, I., et al. Clinical and vascular outcome in internal carotid artery versus middle cerebral artery occlusions after intravenous tissue plasminogen activator. Stroke. 33 (8), 2066-2071 (2002).
  56. Farges, M. C., et al. Increased muscle proteolysis after local trauma mainly reflects macrophage-associated lysosomal proteolysis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 282 (2), E326-E335 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

RUNX1MCA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved