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要約

ラット のin vivo モデルは、虚血性脳卒中の病態メカニズムと治療標的を調査するために不可欠なツールです。この研究では、ラットの中大脳動脈閉塞 (MCAO) 後の梗塞性脳切片における免疫蛍光染色の実施について説明します。

要約

脳卒中は、世界中で主要な死因と障害の原因となっています。脳卒中のほとんどの症例は虚血性であり、中大脳動脈(MCA)の閉塞に起因します。虚血性脳卒中の治療のための現在の薬理学的アプローチは限られています。したがって、脳卒中後の虚血性損傷に対する効果的な神経保護を提供する新しい治療法が緊急に必要とされています。虚血性脳卒中後の脳組織では、虚血性半影の領域は救助可能ですが、不可逆的な損傷に進行するリスクがあります。梗塞したコアを囲む半影領域は、神経保護の概念的なターゲットです。半影領域では血流が部分的に維持されているため、脳卒中後もこの領域の神経細胞および非神経細胞は一時的に生存し、まだ生存しているこれらの細胞は適切な医学的介入によって救出される可能性があります。虚血性半影で活性化された細胞死経路は、RUNX1やカテプシンなどの治療標的を示している可能性があるため、半影の病態生理学を理解することは、神経保護療法の開発において重要です。プログラム細胞死のメディエーターとして機能するこれらのタンパク質標的は、トランスレーショナルリサーチでさらに活用できます。適度なサイズとヒトの脳との類似性を持つMCA閉塞(MCAO)の in vivo ラットモデルは、ヒトの虚血性脳卒中を模倣し、半影の病理を調査し、細胞死シグナルを検査し、MCAOの文脈で潜在的な標的の影響を評価するための適用可能なツールを提供します。ここでは、ラットにMCAOを誘導する方法と、MCAO後のラット脳における細胞死シグナル検出のための免疫蛍光染色の方法について述べる。

概要

脳卒中は、世界中で主要な死因と障害の原因です1。脳卒中の高い死亡率と罹患率は、莫大な公的医療負担と深刻な社会経済的影響をもたらします。脳卒中の発生率と死亡率は安定していますが、脳卒中患者数と脳卒中関連死の数は数十年にわたって増加しています2,3。脳卒中は、虚血性または出血性に分類できます。脳卒中の症例の大部分は、主大脳動脈の閉塞によって引き起こされる虚血性脳卒中です4。今日まで、組織プラスミノーゲン活性化剤 (tPA) は虚血性脳卒中に対する唯一の FDA 承認薬ですが、その適用は、治療期間が狭いこと、合併症、および禁忌によって非常に制限されています 5,6,7。したがって、脳卒中の影響を軽減するために、より広い治療ウィンドウを備えた新しい治療オプションを開発することが急務です。

実験動物モデルは、虚血性脳卒中の病態生理学を研究するための有用なツールです。ほとんどのヒト患者では、虚血性脳卒中は中大脳動脈(MCA)の閉塞によって引き起こされます8。そのため、ヒトの脳梗塞に似せて中大脳動脈閉塞(MCAO)のげっ歯類モデルが開発されました。小動物実験で使用されるMCAOアプローチがいくつかありますが、最も広く使用されている方法は管腔内縫合モデルであり、これは外部または内部の頸動脈から中大脳動脈にナイロンフィラメントを挿入し、血流の一時的または永久的な閉塞をもたらす4,9.このモデルは、大量の脳梗塞を引き起こし、免疫蛍光法を用いて梗塞した脳組織の細胞死シグナルを調べることができます。

梗塞したコアの周囲の領域は、半影と呼ばれ、潜在的な脳卒中治療の標的です10,11。半影の血流は部分的に維持されているため、この領域の損傷したニューロンおよび非ニューロン細胞は、細胞死シグナル伝達の活性化を阻害することにより救助される可能性があります。細胞死経路を標的とすることは、脳卒中後の神経保護のための有望な戦略である可能性があります12。したがって、細胞死シグナルの評価は、実験的脳卒中研究にとって非常に重要です。最近、リソソームプロテアーゼであるカテプシンBは、脳卒中後のプログラム細胞死を媒介する役割を果たすことが示されており、神経学的分野で大きな注目を集めています13。カテプシンBは、さらなる調査に値する神経保護の潜在的な標的を表しています。

この記事では、ラットに管腔内縫合法を使用してMCAOを誘導する方法を示します。また、2,3,5-トリフェニルテトラザリウムクロリド(TTC)染色を行い、梗塞サイズを決定し、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンド標識(TUNEL)染色を使用してアポトーシス細胞を検出する方法を示します。

プロトコル

このプロトコルとここで報告された実験は、四川大学医療倫理委員会によって承認されました。動物の世話と使用は、地元および国際的な倫理基準に準拠していました。

注:この研究では、体重250〜280 gの成体雄のSprague-Dawleyラットを使用しました。ラットは、標準的な環境条件(温度20〜22°C、明暗サイクル12時間)で飼育され、標準的なラット調製飼料と高純度の水が与えられました。外科的処置は無菌条件下で行われました。

1. MCAOのラットモデル

  1. 4% イソフルランと酸素を 1 L/min で使用して初期麻酔を誘発します。足をつまんで麻酔の深さを監視します。麻酔が達成された間、乾燥を防ぐために眼軟膏を投与します。ラットに1 mLの生理食塩水を容量補給として皮下に注射し、術前鎮痛薬として5 mg / kgのカルプロフェンと0.1 mg / kgのブプレノルフィンを注射します。.イソフルランを最初に3.5%に減らし、その後、手術中に徐々に2%に減らします。.
  2. ラットを仰臥位に置き、直腸温度モニタープローブを備えた調整されたヒートマットの上で体温を36.5±0.1°Cに維持します。首の皮膚を剃り、ヨードフォア消毒液で消毒します。
  3. 首に2cmの正中線切開を行い、軟部組織を引っ込めて頸動脈を露出させます。鉗子を使用して、右総頸動脈(CCA)、外頸動脈(ECA)、および内頸動脈(ICA)を分離します。
  4. 縫合糸を使用して近位の右CCAを結紮し、右のICAとECAをその起点でマイクロクリップで固定します。
  5. 丸いシリコンチップでコーティングされたナイロンモノフィラメントを小さな切開部からCCAの内腔に挿入し、CCAに結び目を結びます。
  6. 右のICAマイクロクリップを開き、シリコンチップがMCAの起源(~18-20mm)を隠すまで、ICA切り株を介してナイロンモノフィラメントを右中大脳動脈(MCA)に挿入します。
  7. ナイロンモノフィラメントの露出部分を切り取り、首の正中線切開部を閉じます。
  8. MCAを2時間閉塞した後、首の切開部を開き、CCAの結び目をほどきます。次に、ナイロンモノフィラメントを引き出してMCAを再灌流します。遠位右CCAを結紮し、連続縫合糸または中断縫合糸のいずれかで首の切開を閉じます。
  9. 術後、ブプレノルフィンを 8 時間ごとに 0.03 mg/kg の用量で皮下注射します。麻酔からの回復期間中、温度調節された加熱マットを備えた加熱ケージでラットを観察します。食べることを奨励するために、ケージにマッシュポテトの入ったペトリ皿を置きます。手術後、ケージごとに1匹のラットを飼います。
  10. 偽ラットをモノフィラメントを挿入せずに同じ手順にかけます。
    注:各グループでは、梗塞サイズの測定(n = 3)、免疫蛍光分析(n = 3)、およびアポトーシス検出(n = 3)に合計9匹の動物が使用されます。
  11. MCAO の 2 時間後と再灌流の 22 時間後に、0-5 ポイント スケール14 の Zea-Longa 行動評価スケールを使用して神経機能を評価します。スコアが 0 または 4 のレートを除外します。

2. 梗塞サイズの測定(図1)

  1. ギロチンによる深い麻酔(4%イソフルラン)でラットを犠牲にし、頭蓋骨から全脳を慎重に分離します。
  2. 脳を-20°Cで20分間凍結し、凍結した脳をスライス間の距離を2mmにして6つの冠状スライスに切断します。暗闇で脳スライスを2%TTCで37°Cで15分間染色します。
  3. 脳スライスを4%パラホルムアルデヒドで室温(RT)で24時間固定します。デジタルカメラで染色されたスライスを撮影し、クローズアップオブジェクトの自動モード設定を行います。
  4. 画像をパソコンに転送し、ImageJで梗塞サイズを測定します。梗塞のサイズは、6つのスライスの梗塞領域の合計と、同じスライスの脳全体の領域の合計の比として表します。データを平均の平均±標準誤差(SEM)として表します。

3. 脳凍結切片の免疫蛍光法による解析(図2)

  1. 4%イソフルランと1L / min酸素で麻酔を誘発します。.皮膚と皮下組織を切開して心臓を露出させます。
  2. 心膜を取り外し、右心房に小さな切り込みを入れます。生理食塩水200mLを左心室から灌流し、続いて4%パラホルムアルデヒド200mLを灌流します。
  3. 頭蓋骨を開き、無傷の脳を取り出します。
  4. RTで4%パラホルムアルデヒドに脳を24時間以上固定します。次に、組織が沈むまで、10%、15%、および30%の濃度の一連のショ糖溶液勾配で脱水します(各濃度について約6〜8時間)。
  5. 最適な切断温度(OCT)コンパウンドに脳を埋め込み、気泡がある場合はそれを取り除きます。その後、脳を液体窒素で急速冷凍し、-80°Cの冷凍庫で保存します。
  6. クライオスタットを使用して脳を5μmの厚さで切片化します。セクショニング全体を通して、キャビネットの温度が-18°Cから-20°Cの間に保たれていることを確認してください。 モデルサイトと実験条件に基づいて切片位置にラベルを付けます。切片は冷凍庫に保管してください。
  7. 凍結切片を室温で~30分間平衡化させて、免疫蛍光染色を行います。次に、切片を滅菌PBS 3xでそれぞれ5分間浸します。
  8. 免疫組織化学ペンで組織の輪郭を描きます。20 μg/mL Proteinase K(RNase-free)および0.3% Triton X-100と室温で10分間インキュベートします。
  9. 切片を滅菌PBSで3回、それぞれ5分間浸します。概説した組織に3% BSAを塗布し、室温で1時間インキュベートしてブロッキングします。
  10. ブロッキング後、溶液を取り出し、適切な一次抗体(Rabbit recombinant monoclonal cathepsin-B antibody, 1:200)を添加し、切片を4°Cの暗所で一晩インキュベートします。
  11. 一次抗体を取り出し、0.1% Tween-20を含む滅菌PBSで切片を5分間ずつ3回洗浄します。
  12. 適切な二次抗体(Goat Anti-Rat IgG [H+L] [FITC conjugated]、1:200)を必要な蛍光色素と共に添加し、室温で加湿チャンバー内で切片を1時間インキュベートし、光から保護します。
  13. 二次抗体インキュベーション後、切片を0.1% Tween-20を含む滅菌PBSで切片を5分間ずつ3回洗浄します。DAPIを含む封入剤で切片を染色し、カバースリップで覆います。
  14. 蛍光顕微鏡を使用して、励起波長488 nm、発光波長520 nm、露光時間500 msの設定で画像を撮影します。切片は4°Cの暗所で保管し、長期保存してください。

4. TUNEL染色によるアポトーシスの検出(図3)

注:市販のTUNELアッセイキットは、TUNEL染色に使用されます。このTUNELキットには、DNase I Bufferワーキングソリューション、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)平衡バッファー、ラベリングワーキングソリューション、DAPIワーキングソリューションが含まれています。

  1. 上記と同じ手順(ステップ3.2-3.3)を使用して、脳を灌流および分離します。脳を4%パラホルムアルデヒドに3〜4時間浸して固定します。
  2. 脳を吻側端から尾側端まで厚さ約2mmの冠状スライスに切り、さらに12時間4%パラホルムアルデヒドに浸します。固定後、脳スライスを流水で1時間洗浄します。
  3. 脳スライスを50%、70%、80%、90%、95%、および100%濃度のエタノール溶液にそれぞれ35〜50分間連続して浸して脱水する。
  4. 脳切片をTO型透明生物剤Iで35〜50分間処理し、続いて透明化剤IIを35〜50分間処理し、組織が完全に透明になるまで処理します。
  5. 脳スライスを包埋培地Iに60分間、包埋培地IIに60分間、埋埋培地IIIに60分間、およびIVを包埋培地に60分間順に浸漬します。
  6. 脳のスライスを埋め込みカセットに入れます。カセットを密封し、明確にラベルを貼り、固化のために冷蔵室に置きます。
  7. ミクロトームを初期厚さ10μmに設定して、組織ブロックをトリミングします。その後、厚さを5μmに調整してスライスします。
  8. ウォーターバスを45°Cに加熱し、ティッシュ切片を水面に浮かべてスライドに拾い上げます。約30秒後、スライドを取り出し、RTで乾燥させ、乾燥ボックスに保管します。
  9. 保存された脳切片を清澄剤に2サイクル、各10分間浸すことにより、脱パラフィンします。
  10. 切片を再水和するには、無水エタノールに5分間浸し、3回繰り返します。切片を90%エタノールに3分間移します。さらに、切片を80%エタノールに3分間浸します。最後に、切片を70%エタノールに3分間浸します。
  11. サンプルをPBSで3回、それぞれ5分間すすぎます。濾紙で余分な水分をやさしく取り除きます。
  12. 1x プロテイナーゼKワーキング溶液100 μLを各サンプルに投与し、37°Cで20分間インキュベートします。透過処理後、サンプルをPBS 3xでそれぞれ5分間すすぎます。
  13. ポジティブコントロール用のサンプルを調製します。
    1. 透過処理したサンプルに100 μLの1x DNase I Bufferワーキング溶液(TUNELアッセイキット)を加え、室温で5分間平衡化します。吸収紙を使用して、サンプルから余分な液体を慎重に取り除きます。
    2. 希釈したDNase Iワーキング溶液100 μL(200 U/mL)をサンプルに加え、37°Cで10〜30分間インキュベートします。サンプルをPBSで3回、それぞれ5分間すすぎます。
  14. ネガティブコントロール用のサンプルを準備します。
    1. 透過処理したサンプルに100 μLの1x DNase I Bufferワーキング溶液をインプライし、室温で5分間平衡化します。ネガティブコントロールサンプルをDNase I Bufferと37°Cで10〜30分間インキュベートし、DNase I酵素が添加されていないことを確認します。サンプルをPBSで3回、それぞれ5分間すすぎます。
  15. 100 μLの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)平衡緩衝液(TUNELアッセイキット)を各サンプルに適用し、加湿チャンバー内で37°Cで10〜30分間インキュベートします。次に、TdT平衡化バッファーを吸収紙で取り除きます。
  16. 各サンプルに50 μLの標識作業溶液(TUNELアッセイキット)を加え、加湿した暗所チャンバーで37°Cで60分間インキュベートします。シグナル強度が低い場合は、DNA標識反応時間を長くすることを検討してください。次に、サンプルをPBS 3xでそれぞれ5分間すすぎます。
  17. 余分な水分をブロッティングした後、DAPIワーキング溶液(TUNELアッセイキット)を塗布し、暗所でRTで5分間インキュベートして核を対比します。次に、サンプルをPBS 4xでそれぞれ5分間すすぎます。吸収紙で余分な液体を取り除き、色あせ防止封入剤を使用してスライドをシールします。
  18. Vectra Polarisマルチスペクトルイメージングシステムを使用して染色されたスライドをスキャンし、システムソフトウェアでデータを分析します。

5. 統計分析

  1. 実験結果をSEM±手段として提示し、GraphPad Prism 10ソフトウェア(GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用して2つのグループ比較のスチューデントt検定でデータを分析します。
  2. p値を0.05未満に統計的な差として設定します。

結果

ラットは、MCAO中に120分間の虚血を受け、その後22時間の再灌流が行われます。MCAO手術中の死亡率は最小限で、再灌流期間中は約25%でした。MCAOグループでは有意な脳損傷が観察されたが、シャムグループの大脳では梗塞は観察されなかった(24.87 ± 1.21% vs. 脳全体に対する梗塞領域の合計が0%;MCAO [n = 3] 対 Sham [n = 3]、P < 0.001;図1A、B

ディスカッション

大脳動脈の閉塞は、酸素と栄養の欠乏につながり、続いて活性酸素種の活性化、細胞内カルシウム過剰、グルタミン酸の放出、および炎症反応の誘導につながります15。この一連の事象は、梗塞した脳の細胞死と不可逆的な組織損傷をもたらします。半影は、適切な治療ウィンドウ16内での医学的介入を通じて潜在的に救済可能で?...

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

Simiao Wu は、四川省科学技術部 (2024YFHZ0330) と四川大学中国西部病院の支援を受けました。Weihong He は、四川省科学技術部 (2023YFS0297) と四川大学の支援を受けました。四川大学西中国病院研究中核施設のYi Zhang氏とYue Li氏には、TUNELのイメージングと解析に関する技術サポートをいただき、感謝いたします。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Akoya Vectra PolarisAkoya BiosciencesN/AVectra Polaris multispectral imaging system 
Anhydrous ethanolChengdu Jinshan Chemical Reagent Co.N/A
BuprenorphineWest China HospitalN/A
CarprofenWest China HospitalN/A
Cathepsin-B antibodyAbcamAb214428
CryostatLEICA LEICA CM 1950
Digital cameraOLYMPUSTG-7
Goat Anti-Rat IgG (H+L) (FITC conjugated)Elabscience E-AB-1021
Goat serumSolarbioSL038
GraphPad Prism 10 softwareN/Ahttps://www.graphpad-prism.cn/?c=i&a=prismdownload_cn
ImageJN/Ahttps://imagej.net/ij/
Immunohistochemistry penBiosharphttp://www.biosharp.cn/index/product/details/language/en/product_id/2828.html
InForm softwareAkoya BiosciencesVersion 2.6.0system software for the multispectral imaging system 
Iodophor disinfecting solutionHuatian Technology Industry Co.N/A
IsofluraneRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/
Mounting medium containing DAPISolarbioS2110
Nylon monofilamentRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/
Optimal cutting temperature (OCT) compoundEprediaN/A
ParaformaldehydeBiosharpN/A
Phosphate buffer solution (PBS)SolarbioN/A
PrismGraphPad Version 10
Proteinase KTiangenRT403-02
SalineKelun Co.N/A
Sprague-Dawley ratsHuafukang Co.N/A
SucroseBioFroxx1245GR500
Surgical instrumentsRWD Life Science Co.N/A
TO-type transparent biological agent  Beijing Solarbio Science & Tecnology Co., Ltd.http://www.solarbio.net/
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solutionSolarbioG3005
Triton X-100BioFroxx1139ML100
TUNEL kitElabscience E-CK-A321

参考文献

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