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Resumo

Modelos in vivo de ratos são ferramentas indispensáveis para investigar os mecanismos patológicos e alvos terapêuticos do AVC isquêmico. Este trabalho descreverá a realização de coloração por imunofluorescência em fatias de cérebro infartadas após oclusão da artéria cerebral média (MCAO) em ratos.

Resumo

O AVC é uma das principais causas de morte e incapacidade em todo o mundo. A maioria dos casos de AVC é isquêmica e resulta da oclusão da artéria cerebral média (ACM). As abordagens farmacológicas atuais para o tratamento do AVC isquêmico são limitadas; Portanto, novas terapias que forneçam neuroproteção eficaz contra lesão isquêmica após AVC são urgentemente necessárias. No tecido cerebral após o AVC isquêmico, a área da penumbra isquêmica é recuperável, mas corre o risco de progredir para danos irreversíveis. A área penumbral ao redor do núcleo infartado é um alvo conceitual para neuroproteção. Como o fluxo sanguíneo é parcialmente mantido na área penumbral, as células neuronais e não neuronais nessa área sobrevivem transitoriamente após o AVC, e essas células que ainda são viáveis podem ser resgatadas por intervenções médicas apropriadas. Compreender a fisiopatologia da penumbra é importante no desenvolvimento de terapias neuroprotetoras, pois as vias de morte celular ativadas na penumbra isquêmica podem indicar alvos terapêuticos, como RUNX1 e catepsinas. Esses alvos proteicos que funcionam como mediadores da morte celular programada podem ser explorados ainda mais na pesquisa translacional. Com tamanho moderado e semelhança com o cérebro humano, o modelo in vivo de rato de oclusão de MCA (MCAO) imita o AVC isquêmico humano e oferece uma ferramenta aplicável para investigar a patologia penumbral, examinar a sinalização de morte celular e avaliar os efeitos de alvos potenciais no contexto de MCAO. Aqui, descrevemos como induzir MCAO em ratos e como realizar a coloração por imunofluorescência para a detecção de sinalização de morte celular no cérebro de ratos após MCAO.

Introdução

O acidente vascular cerebral é uma das principais causas de morte e incapacidade em todo o mundo1. A alta mortalidade e morbidade do AVC resultam em imenso ônus para a saúde pública e sérias consequências socioeconômicas. Embora a taxa de incidência e mortalidade por AVC permaneça estável, o número de pacientes com AVC e mortes relacionadas ao AVC está aumentando ao longo de décadas 2,3. Os AVCs podem ser categorizados como isquêmicos ou hemorrágicos. A maioria dos casos de AVC são acidentes vasculares cerebrais isquêmicos causados pela oclusão de uma artéria cerebral principal4. Até o momento, o ativador de plasminogênio tecidual (tPA) é o único medicamento aprovado pela FDA para AVC isquêmico, mas sua aplicação é altamente limitada pela estreita janela terapêutica, complicações e contraindicações 5,6,7. Assim, é urgente desenvolver novas opções de tratamento com uma janela terapêutica mais ampla para mitigar os efeitos do AVC.

Modelos animais experimentais são ferramentas úteis para estudar a fisiopatologia do AVC isquêmico. Na maioria dos pacientes humanos, o AVC isquêmico é causado pelo bloqueio da artéria cerebral média (ACM)8. Portanto, modelos de roedores de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) foram desenvolvidos para se assemelhar ao infarto cerebral humano. Embora existam várias abordagens MCAO que são usadas em estudos com pequenos animais, o método mais amplamente utilizado é o modelo de sutura intraluminal, que envolve a inserção de um filamento de náilon na artéria cerebral média a partir das artérias carótidas externa ou interna, resultando em oclusão transitória ou permanente do fluxo sanguíneo 4,9. Este modelo leva a um grande volume de infarto cerebral e permite o exame da sinalização de morte celular no tecido cerebral infartado com técnicas de imunofluorescência.

A área ao redor do núcleo infartado, conhecida como penumbra, é o alvo de possíveis terapias de AVC10,11. Como o fluxo sanguíneo na penumbra é parcialmente mantido, os neurônios lesados e as células não neuronais nessa área podem ser recuperados inibindo a ativação da sinalização de morte celular. O direcionamento das vias de morte celular pode ser uma estratégia promissora para a neuroproteção após o AVC12. Portanto, avaliar a sinalização de morte celular é crucial para a pesquisa experimental de AVC. Recentemente, a catepsina-B, uma protease lisossômica, demonstrou desempenhar um papel na mediação da morte celular programada após o AVC, e ganhou atenção substancial no campo neurológico13. A catepsina-B representa um alvo potencial para neuroproteção que merece uma investigação mais aprofundada.

Este artigo demonstra como induzir MCAO usando a abordagem de sutura intraluminal em ratos. Também mostramos como realizar a coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazálio (TTC) para determinar o tamanho do infarto e detectar células apoptóticas usando a coloração Terminal desoxinucleotidil transferase dUTP nick-end (TUNEL).

Protocolo

Este protocolo e os experimentos relatados aqui foram aprovados pelo Comitê de Ética Médica da Universidade de Sichuan. O cuidado e o uso dos animais obedeceram a critérios éticos locais e internacionais.

NOTA: Ratos Sprague-Dawley machos adultos pesando 250-280 g foram usados neste estudo. Os ratos foram alojados em uma condição ambiental padrão (temperatura de 20-22 °C, ciclo claro/escuro de 12 h), alimentados com uma dieta padrão de fórmula de rato e água de alta pureza. O procedimento cirúrgico foi realizado em condições estéreis.

1. Modelo de rato de MCAO

  1. Induzir a anestesia inicial com isoflurano a 4% com oxigênio a 1 L/min. Monitore a profundidade da anestesia por pinça do pé. Enquanto a anestesia é alcançada, administre uma pomada ocular para evitar o ressecamento. Injete no rato 1 mL de solução salina por via subcutânea como reposição de volume e com 5 mg/kg de carprofeno e 0,1 mg/kg de buprenorfina para analgesia pré-operatória. Reduza o isoflurano para 3,5% inicialmente e depois para 2% gradualmente durante a cirurgia.
  2. Coloque o rato em decúbito dorsal e mantenha a temperatura corporal a 36,5 ± 0,1 °C em um tapete térmico regulado com uma sonda de monitoramento de temperatura retal. Faça a barba e desinfete a pele do pescoço com uma solução desinfetante iodófora.
  3. Faça uma incisão na linha média de 2 cm no pescoço e retraia os tecidos moles para expor os vasos carotídeos. Use uma pinça para isolar a artéria carótida comum direita (ACC), a artéria carótida externa (ECA) e a artéria carótida interna (ACI).
  4. Use suturas para ligar a ACC proximal direita e pinçar a ACI e a ACE direitas com um microclipe em sua origem.
  5. Insira um monofilamento de náilon revestido com uma ponta redonda de silicone no lúmen do CCA através de uma pequena incisão e dê um nó no CCA para evitar sangramento e deslocamento do monofilamento de náilon.
  6. Abra o microclipe ICA direito e insira o monofilamento de náilon na artéria cerebral média direita (MCA) através do coto ICA até que a ponta de silicone oclua a origem da MCA (~ 18-20 mm).
  7. Corte a parte exposta do monofilamento de náilon e feche a incisão na linha média do pescoço.
  8. Após 2 h de oclusão da ACM, abra a incisão no pescoço e desfaça o nó na ACC. Em seguida, retire o monofilamento de náilon para reperfundir o MCA. Ligue a ACC direita distal e feche a incisão cervical com suturas contínuas ou interrompidas.
  9. No pós-operatório, administrar buprenorfina por injeção subcutânea a cada 8 h, na dose de 0,03 mg/kg. Observe os ratos durante a recuperação da anestesia em uma gaiola aquecida com uma esteira de aquecimento com temperatura regulada. Para incentivar a alimentação, coloque uma placa de Petri com ração amassada na gaiola. Abriga um rato por gaiola após a cirurgia.
  10. Sujeitar os ratos simulados ao mesmo procedimento sem a inserção do monofilamento.
    NOTA: Um total de 9 animais são usados em cada grupo para medição do tamanho do infarto (n = 3), análise de imunofluorescência (n = 3) e detecção de apoptose (n = 3).
  11. Avaliar a função neurológica 2 h após MCAO e 22 h após a reperfusão usando a escala de classificação comportamental Zea-Longa com uma escala de 0 a 5 pontos14. Exclua tarifas com pontuação de 0 ou 4.

2. Medição do tamanho do infarto (Figura 1)

  1. Sacrifique ratos sob anestesia profunda (isoflurano a 4%) por guilhotina e isole cuidadosamente todo o cérebro do crânio.
  2. Congele o cérebro a -20 °C por 20 min e corte o cérebro congelado em seis fatias coronais com uma distância de 2 mm entre as fatias. Manchar as fatias do cérebro com TTC a 2% durante 15 min a 37 °C no escuro.
  3. Fixe as fatias do cérebro com paraformaldeído a 4% por 24 h em temperatura ambiente (RT). Fotografe as fatias manchadas com uma câmera digital, com configuração de modo automático para objetos em close-up.
  4. Transfira as fotos para um computador e meça o tamanho do infarto usando o ImageJ. Apresente o tamanho do infarto como a razão entre a soma da área do infarto em 6 fatias e a soma de toda a área do cérebro nas mesmas fatias. Expresse os dados como média ± erro padrão da média (SEM).

3. Análise de imunofluorescência na criossecção cerebral (Figura 2)

  1. Induzir anestesia com isoflurano a 4% e oxigênio 1 L/min. Incisar a pele e o tecido subcutâneo para expor o coração.
  2. Retire o pericárdio e faça um pequeno corte no átrio direito. Perfundir 200 mL de solução salina através do ventrículo esquerdo, seguido por 200 mL de paraformaldeído a 4%.
  3. Abra o crânio e remova o cérebro intacto.
  4. Fixe o cérebro em paraformaldeído a 4% em RT por mais de 24 h. Em seguida, desidrate-o em uma série de gradientes de solução de sacarose de concentrações de 10%, 15% e 30% até que o tecido afunde, aproximadamente 6-8 horas para cada concentração.
  5. Incorpore o cérebro no composto de temperatura de corte ideal (OCT) e remova as bolhas de ar, se houver. Em seguida, congele o cérebro em nitrogênio líquido e armazene-o no freezer a -80 ° C.
  6. Corte o cérebro usando um criostato com uma espessura de 5 μm. Durante o seccionamento, certifique-se de que a temperatura do gabinete permaneça entre -18 °C e -20 °C. Rotule o local de seccionamento com base no local do modelo e nas condições experimentais. Guarde as seções em um freezer.
  7. Deixe as seções congeladas se equilibrarem em RT por ~ 30 min para realizar a coloração por imunofluorescência. Em seguida, mergulhe as seções com PBS estéril 3x por 5 min cada.
  8. Contorne o tecido com uma caneta de imuno-histoquímica. Incubar com 20 μg/mL de proteinase K (livre de RNase) e 0,3% de Triton X-100 em RT por 10 min.
  9. Mergulhe as seções com PBS estéril 3x por 5 min cada. Aplique 3% de BSA no tecido delineado e incube em RT por 1 h para bloqueio.
  10. Após o bloqueio, remova a solução, adicione o anticorpo primário apropriado (anticorpo monoclonal recombinante de catepsina B de coelho, 1:200) e incube as seções durante a noite no escuro a 4 ° C.
  11. Remova o anticorpo primário e lave as seções com PBS estéril contendo 0,1% de Tween-20 3x por 5 min cada.
  12. Adicione o anticorpo secundário apropriado (IgG anti-rato de cabra [H + L] [conjugado FITC], 1: 200) com o fluoróforo necessário e incube as seções em uma câmara umidificada em RT por 1 h, protegendo-as da luz.
  13. Após a incubação secundária de anticorpos, lave as seções com PBS estéril contendo 0,1% de Tween-20 3x por 5 min cada. Manchar as secções com um suporte de montagem contendo DAPI e cobri-las com uma lamínula.
  14. Capture imagens usando um microscópio de fluorescência com as seguintes configurações: comprimento de onda de excitação de 488 nm, comprimento de onda de emissão de 520 nm e tempo de exposição de 500 ms. Armazene as seções no escuro a 4 ° C para preservação a longo prazo.

4. Detecção de apoptose pela coloração TUNEL (Figura 3)

NOTA: Um kit de ensaio TUNEL comercial é usado para a coloração TUNEL. Este kit TUNEL inclui uma solução de trabalho DNase I Buffer, tampão de equilíbrio desoxinucleotidil transferase (TdT), solução de trabalho de rotulagem e solução de trabalho DAPI.

  1. Perfundir e isolar o cérebro usando o mesmo procedimento acima (etapas 3.2-3.3). Mergulhe o cérebro em paraformaldeído a 4% por 3-4 h para fixação.
  2. Corte o cérebro em fatias coronais de aproximadamente 2 mm de espessura, começando da extremidade rostral até a extremidade caudal, e mergulhe em paraformaldeído a 4% por mais 12 h. Após a fixação, lave as fatias de cérebro em água corrente por 1 h.
  3. Mergulhe as fatias de cérebro em soluções de etanol de concentrações de 50%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100% sequencialmente por 35-50 min cada para desidratação.
  4. Trate as fatias do cérebro com agente biológico transparente I do tipo TO por 35-50 min, seguido de agente de limpeza II por 35-50 min, até que o tecido esteja totalmente transparente.
  5. Mergulhe as fatias cerebrais sequencialmente no meio de incorporação I por 60 min, no meio II por 60 min, no meio III por 60 min e no meio IV por 60 min.
  6. Coloque as fatias de cérebro em um de incorporação. Sele o, etiquete-o claramente e coloque-o em uma câmara frigorífica para solidificação.
  7. Defina o micrótomo para uma espessura inicial de 10 μm para aparar o bloco de tecido. Em seguida, ajuste a espessura para 5 μm para fatiar.
  8. Aquecer o banho-maria a 45 °C, flutuar as secções de tecido na superfície da água e recolhê-las em lâminas. Após aproximadamente 30 s, remova as lâminas, seque-as em RT e guarde-as em uma caixa de secagem.
  9. Desparafinize as seções cerebrais armazenadas imergindo-as em um agente de limpeza por 2 ciclos, 10 min cada.
  10. Para reidratar as seções, mergulhe-as em etanol anidro por 5 min, repetindo 3 vezes. Transfira as seções para etanol a 90% por 3 min. Além disso, mergulhe as seções em etanol a 80% por 3 min. Por fim, mergulhe as seções em etanol a 70% por 3 min.
  11. Enxágue as amostras em PBS 3x por 5 min cada. Remova suavemente o excesso de umidade usando papel de filtro.
  12. Administrar 100 μL de solução de trabalho 1x proteinase K a cada amostra e incubar a 37 °C durante 20 min. Após a permeabilização, enxágue as amostras em PBS 3x por 5 min cada.
  13. Preparar amostras para controlo positivo.
    1. Adicione 100 μL de solução de trabalho 1x DNase I Buffer (kit de ensaio TUNEL) à amostra permeabilizada e deixe-a equilibrar em RT por 5 min. Remova cuidadosamente qualquer excesso de líquido da amostra usando papel absorvente.
    2. Adicionar 100 μL de solução de trabalho diluída de DNase I (200 U/ml) à amostra e incubar a 37 °C durante 10-30 min. Enxágue as amostras em PBS 3x por 5 min cada.
  14. Preparar amostras para controlo negativo.
    1. Aplique 100 μL de solução de trabalho 1x DNase I Buffer na amostra permeabilizada e equilibre em RT por 5 min. Incubar a amostra de controlo negativo com tampão DNase I a 37 °C durante 10-30 min, garantindo que não é adicionada enzima DNase I. Enxágue as amostras em PBS 3x por 5 min cada.
  15. Aplicar 100 μL de tampão de equilíbrio da desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) (kit de ensaio TUNEL) a cada amostra e incubar numa câmara humidificada a 37 °C durante 10-30 min. Em seguida, remova o TdT Equilibration Buffer com papel absorvente.
  16. Adicione 50 μL de solução de trabalho de rotulagem (kit de ensaio TUNEL) a cada amostra e, em seguida, incube-as a 37 °C em uma câmara escura e umidificada por 60 min. Se a intensidade do sinal for baixa, considere estender o tempo de reação de marcação do DNA. Em seguida, enxágue as amostras em PBS 3x por 5 min cada.
  17. Depois de enxugar o excesso de umidade, aplique a solução de trabalho DAPI (kit de ensaio TUNEL) e incube em RT no escuro por 5 min para contra-corar os núcleos. Em seguida, enxágue as amostras em PBS 4x por 5 min cada. Remova o excesso de líquido com papel absorvente e sele as lâminas usando um meio de montagem anti-desbotamento.
  18. Digitalize as lâminas coradas usando o sistema de imagem multiespectral Vectra Polaris e analise os dados com o software do sistema.

5. Análise estatística

  1. Apresentar os resultados experimentais como meio ± SEM e analisar os dados com um teste t de Student para comparações de dois grupos usando o software GraphPad Prism 10 (GraphPad Software, San Diego, CA).
  2. Defina um valor de p menor que 0,05 como uma diferença estatística.

Resultados

Os ratos são submetidos a isquemia de 120 min durante a OCM, seguida de reperfusão de 22 horas. A taxa de mortalidade foi mínima durante a cirurgia de MCAO e ficou em torno de 25% no período de reperfusão. Danos cerebrais significativos foram observados no grupo MCAO, enquanto nenhum infarto foi observado no cérebro do grupo Sham (24,87 ± 1,21% vs. 0% da soma da área do infarto em toda a área do cérebro; MCAO [n = 3] vs. Sham [n = 3], P < 0,001; Fi...

Discussão

A oclusão de uma artéria cerebral leva à privação de oxigênio e nutrição, seguida pela ativação de espécies reativas de oxigênio, sobrecarga de cálcio intracelular, liberação de glutamato e indução de respostas inflamatórias15. Essa série de eventos resulta em morte celular e danos irreversíveis aos tecidos do cérebro infartado. A penumbra é potencialmente recuperável por meio de intervenção médica dentro de uma janela terapêutica apropr...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Simiao Wu foi apoiado pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (2024YFHZ0330) e pelo Hospital da China Ocidental da Universidade de Sichuan. Weihong He foi apoiado pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (2023YFS0297) e pela Universidade de Sichuan. Agradecemos a Yi Zhang e Yue Li do Centro de Pesquisa do Hospital da China Ocidental da Universidade de Sichuan, por seu suporte técnico em imagens e análises do TUNEL.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Akoya Vectra PolarisAkoya BiosciencesN/AVectra Polaris multispectral imaging system 
Anhydrous ethanolChengdu Jinshan Chemical Reagent Co.N/A
BuprenorphineWest China HospitalN/A
CarprofenWest China HospitalN/A
Cathepsin-B antibodyAbcamAb214428
CryostatLEICA LEICA CM 1950
Digital cameraOLYMPUSTG-7
Goat Anti-Rat IgG (H+L) (FITC conjugated)Elabscience E-AB-1021
Goat serumSolarbioSL038
GraphPad Prism 10 softwareN/Ahttps://www.graphpad-prism.cn/?c=i&a=prismdownload_cn
ImageJN/Ahttps://imagej.net/ij/
Immunohistochemistry penBiosharphttp://www.biosharp.cn/index/product/details/language/en/product_id/2828.html
InForm softwareAkoya BiosciencesVersion 2.6.0system software for the multispectral imaging system 
Iodophor disinfecting solutionHuatian Technology Industry Co.N/A
IsofluraneRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/
Mounting medium containing DAPISolarbioS2110
Nylon monofilamentRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/
Optimal cutting temperature (OCT) compoundEprediaN/A
ParaformaldehydeBiosharpN/A
Phosphate buffer solution (PBS)SolarbioN/A
PrismGraphPad Version 10
Proteinase KTiangenRT403-02
SalineKelun Co.N/A
Sprague-Dawley ratsHuafukang Co.N/A
SucroseBioFroxx1245GR500
Surgical instrumentsRWD Life Science Co.N/A
TO-type transparent biological agent  Beijing Solarbio Science & Tecnology Co., Ltd.http://www.solarbio.net/
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solutionSolarbioG3005
Triton X-100BioFroxx1139ML100
TUNEL kitElabscience E-CK-A321

Referências

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