通过免疫荧光评估缺血性卒中大鼠模型中的细胞死亡信号

摘要

大鼠 体内 模型是研究缺血性脑卒中病理机制和治疗靶点不可或缺的工具。这项工作将描述在大鼠大脑中动脉闭塞 （MCAO） 后对梗死脑切片进行免疫荧光染色。

摘要

中风是全世界导致死亡和残疾的主要原因。大多数中风病例是缺血性的，由大脑中动脉 （MCA） 闭塞引起。目前治疗缺血性卒中的药理学方法有限;因此，迫切需要针对中风后缺血性损伤提供有效神经保护的新型疗法。在缺血性中风后的脑组织中，缺血性半影区域是可挽救的，但有发展为不可逆损伤的风险。梗死核心周围的半影区是神经保护的概念目标。由于半影区的血流部分维持，因此该区域的神经元和非神经元细胞在中风后会短暂存活，这些仍然存活的细胞可以通过适当的医疗干预来挽救。了解半影的病理生理学对于神经保护疗法的开发很重要，因为缺血性半影中激活的细胞死亡途径可能表明治疗靶点，例如 RUNX1 和组织蛋白酶。这些作为程序性细胞死亡介质的蛋白质靶标可以在转化研究中进一步开发。MCA 闭塞 （MCAO） 的 体内 大鼠模型具有中等大小和与人脑相似性，模拟人类缺血性中风，并为研究半影病变、检查细胞死亡信号和评估潜在靶点在 MCAO 背景下的影响提供了适用的工具。在这里，我们描述了如何在大鼠中诱导 MCAO 以及如何进行免疫荧光染色以检测 MCAO 后大鼠大脑中的细胞死亡信号。

引言

脑中风是全世界导致死亡和残疾的主要原因¹。中风的高死亡率和发病率导致巨大的公共医疗负担和严重的社会经济后果。尽管中风的发病率和死亡率保持稳定，但几十年来中风患者和中风相关死亡人数一直在增加 ^2,3。中风可分为缺血性或出血性。大多数中风病例是由大脑主动脉闭塞引起的缺血性中风⁴。迄今为止，组织纤溶酶原激活剂 （tPA） 是唯一获得 FDA 批准的缺血性中风药物，但其应用受到治疗窗狭窄、并发症和禁忌症的高度限制 ^5,6,7。因此，迫切需要开发具有更宽治疗窗口的新治疗方案来减轻中风的影响。

实验动物模型是研究缺血性卒中病理生理学的有用工具。在大多数人类患者中，缺血性中风是由大脑中动脉 （MCA） 阻塞引起的⁸。因此，已经开发了大脑中动脉闭塞 （MCAO） 的啮齿动物模型，以类似于人类脑梗死。虽然小动物研究中使用了几种 MCAO 方法，但使用最广泛的方法是腔内缝合模型，该模型涉及将尼龙丝从颈外动脉或颈内动脉插入大脑中动脉，导致血流短暂或永久闭塞 ^4,9.该模型导致大量脑梗死，并允许使用免疫荧光技术检查梗死脑组织中的细胞死亡信号。

梗死核心周围的区域，称为半影，是潜在中风治疗的目标^10,11。由于半影中的血流得到部分维持，因此可以通过抑制细胞死亡信号的激活来挽救该区域中受伤的神经元和非神经元细胞。靶向细胞死亡途径可能是中风后神经保护的一种很有前途的策略¹²。因此，评估细胞死亡信号转导对于实验性卒中研究至关重要。最近，组织蛋白酶 B 是一种溶酶体蛋白酶，已被证明在介导中风后程序性细胞死亡中发挥作用，并且在神经学领域受到广泛关注¹³。组织蛋白酶 B 代表了神经保护的潜在靶点，值得进一步研究。

本文演示了如何使用腔内缝合方法在大鼠中诱导 MCAO。我们还展示了如何进行 2,3,5-三苯基四氮氯化铵 （TTC） 染色以确定梗死面积并使用末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记 （TUNEL） 染色检测凋亡细胞。

研究方案

该方案和此处报告的实验得到了四川大学医学伦理委员会的批准。动物的护理和使用符合当地和国际道德标准。

注意：本研究使用体重 250-280 g 的成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠。将大鼠饲养在标准环境条件（20-22 °C 温度，12 小时光照/黑暗循环）中，用标准大鼠配方饮食和高纯度水喂养。外科手术在无菌条件下进行。

1. MCAO 大鼠模型

1. 使用 4% 异氟醚和 1 L/min 的氧气诱导初始麻醉。通过脚捏监测麻醉深度。在达到麻醉效果时，涂抹眼膏以防止干燥。皮下注射大鼠 1 mL 生理盐水作为容量补充，并注射 5 mg/kg 卡洛芬和 0.1 mg/kg 丁丙诺啡用于术前镇痛。最初将异氟醚减少到 3.5%，然后在整个手术过程中逐渐减少到 2%。
2. 将大鼠置于仰卧位，将体温保持在 36.5 ± 0.1 °C，放在带有直肠温度监测探头的调节加热垫上。用碘伏消毒液剃除和消毒颈部皮肤。
3. 在颈部做一个 2 cm 的中线切口，并缩回软组织以露出颈动脉血管。使用镊子分离右颈总动脉 （CCA）、颈外动脉 （ECA） 和颈内动脉 （ICA）。
4. 使用缝合线结扎右侧近端 CCA，并在其起点处用微夹夹住右侧 ICA 和 ECA。
5. 通过一个小切口将涂有圆形硅胶尖端的尼龙单丝插入 CCA 的管腔，并在 CCA 中打一个结，以防止尼龙单丝流血和移位。
6. 打开右侧 ICA 微夹，通过 ICA 残端将尼龙单丝插入右侧大脑中动脉 （MCA），直到硅胶尖端阻塞 MCA 的起点 （~18-20 mm）。
7. 剪掉尼龙单丝的外露部分，关闭颈部中线切口。
8. MCA 闭塞 2 小时后，打开颈部切口并解开 CCA 中的结。然后取出尼龙单丝以重新灌注 MCA。结扎右侧远端 CCA，并用连续或间断缝合闭合颈部切口。
9. 术后，每 8 小时皮下注射丁丙诺啡，剂量为 0.03 mg/kg。在带有温度调节加热垫的加热笼中观察大鼠从麻醉中恢复的整个过程。为了鼓励进食，在笼子里放一个装有食物泥的培养皿。手术后每个笼子饲养一只大鼠。
10. 将假大鼠置于相同的程序中，无需插入单丝。
    注意：每组共使用 9 只动物用于测量梗死面积 （n = 3）、免疫荧光分析 （n = 3） 和细胞凋亡检测 （n = 3）。
11. 使用 Zea-Longa 行为评定量表和 0-5 分制¹⁴ 评估 MCAO 后 2 小时和再灌注后 22 小时的神经功能。排除分数为 0 或 4 的汇率。

2. 测量梗塞面积（图 1）

1. 在深度麻醉（4%异氟醚）下用断头台处死大鼠，并小心地将整个大脑与颅骨隔离。
2. 将大脑在-20°C下冷冻20分钟，并将冷冻的大脑切成六个冠状切片，切片之间的距离为2毫米。在 37 °C 下在黑暗中用 2% TTC 对脑切片染色 15 分钟。
3. 在室温 （RT） 下用 4% 多聚甲醛固定脑切片 24 小时。使用数码相机拍摄染色的切片，并为特写对象设置自动模式。
4. 将图片传输到计算机并使用 ImageJ 测量梗塞大小。将梗塞大小表示为 6 个切片中梗塞区域之和与相同切片中整个大脑区域之和的比率。将数据表示为平均值±平均值 （SEM） 的标准误差。

3. 脑冷冻切片的免疫荧光分析（图 2）

1. 用 4% 异氟醚和 1 L/min 氧气诱导麻醉。切开皮肤和皮下组织，露出心脏。
2. 切除心包，在右心房做一个小切口。通过左心室灌注 200 mL 生理盐水，然后灌注 200 mL 4% 多聚甲醛。
3. 打开头骨并取出完整的大脑。
4. 在 RT 下将大脑固定在 4% 多聚甲醛中超过 24 小时。然后，以一系列浓度为 10%、15% 和 30% 的蔗糖溶液梯度将其脱水，直到组织下沉，每个浓度大约需要 6-8 小时。
5. 将大脑嵌入最佳切割温度 （OCT） 化合物中，并去除气泡（如果有）。然后，在液氮中快速冷冻大脑并将其储存在 -80 °C 冰箱中。
6. 使用 5 μm 厚度的低温恒温器切片大脑。在整个切片过程中，确保柜体温度保持在 -18 °C 和 -20 °C 之间。 根据模型地点和实验条件标记切片位置。将切片存放在冰箱中。
7. 让冷冻切片在 RT 下平衡 ~30 分钟以进行免疫荧光染色。然后，用无菌 PBS 3 次浸泡切片，每个切片 5 分钟。
8. 用免疫组织化学笔勾勒出组织轮廓。与 20 μg/mL 蛋白酶 K（无 RNase）和 0.3% Triton X-100 在 RT 下孵育 10 分钟。
9. 用无菌 PBS 浸泡切片 3 次，每次 5 分钟。将 3% BSA 涂在轮廓组织上，并在 RT 下孵育 1 小时以进行封闭。
10. 封闭后，去除溶液，加入适当的一抗（兔重组组织蛋白酶-B 抗体，1：200），并在 4 °C 下在黑暗中孵育切片过夜。
11. 去除一抗，用含有 0.1% Tween-20 的无菌 PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
12. 用所需的荧光团加入适当的二抗（山羊抗大鼠 IgG [H+L] [FITC 偶联]，1：200），并在室温下在加湿室中孵育切片 1 小时，保护它们避光。
13. 二抗孵育后，用含有 0.1% Tween-20 的无菌 PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。用含有 DAPI 的封固剂对切片进行染色，并用盖玻片覆盖它们。
14. 使用荧光显微镜捕获图像，激发波长为 488 nm，发射波长为 520 nm，曝光时间为 500 ms。将切片在 4 °C 的黑暗中长期保存。

4. 通过 TUNEL 染色检测细胞凋亡（图 3）

注：市售 TUNEL 检测试剂盒用于 TUNEL 染色。该 TUNEL 试剂盒包括 DNase I 缓冲液工作溶液、脱氧核苷酸转移酶 （TdT） 平衡缓冲液、标记工作溶液和 DAPI 工作溶液。

1. 使用与上述相同的程序灌注和分离大脑（步骤 3.2-3.3）。将大脑浸入 4% 多聚甲醛中 3-4 小时以进行固定。
2. 将大脑切成约 2 毫米厚的冠状切片，从喙端开始到尾端，并浸入 4% 多聚甲醛中再浸泡 12 小时。固定后，在流水中清洗脑切片 1 小时。
3. 将脑切片依次浸入 50%、70%、80%、90%、95% 和 100% 浓度的乙醇溶液中，每次 35-50 分钟脱水。
4. 用 TO 型透明生物制剂 I 处理脑切片 35-50 分钟，然后用透明化剂 II 处理 35-50 分钟，直到组织完全透明。
5. 将脑切片依次浸入包埋培养基 I 中 60 分钟，包埋培养基 II 60 分钟，包埋培养基 III 60 分钟，包埋培养基 IV 60 分钟。
6. 将脑切片放入嵌入盒中。将包埋盒密封，贴上清晰标签，放入冷藏室凝固。
7. 将切片机设置为 10 μm 的初始厚度以修剪组织块。然后，将厚度调整为 5 μm 进行切片。
8. 将水浴加热至 45 °C，将组织切片漂浮在水面上，然后将它们捡起到载玻片上。大约 30 秒后，取出载玻片，在 RT 下干燥，并将它们存放在干燥箱中。
9. 通过将储存的脑切片浸入透明剂中 2 个循环，每个循环 10 分钟来脱蜡。
10. 要使切片再水化，请将它们浸泡在无水乙醇中 5 分钟，重复 3 次。将切片转移到 90% 乙醇中 3 分钟。此外，将切片浸泡在 80% 乙醇中 3 分钟。最后，将切片浸入 70% 乙醇中 3 分钟。
11. 在 PBS 中冲洗样品 3 次，每次 5 分钟。使用滤纸轻轻去除多余的水分。
12. 向每个样品中加入 100 μL 1x 蛋白酶 K 工作溶液，并在 37 °C 下孵育 20 分钟。透化后，用 PBS 冲洗样品 3 次，每次 5 分钟。
13. 准备阳性对照样品。
    1. 向透化样品中加入 100 μL 1x DNase I 缓冲液工作溶液（TUNEL 检测试剂盒），并使其在 RT 下平衡 5 分钟。使用吸水纸小心地去除样品中多余的液体。
    2. 向样品中加入 100 μL 稀释的 DNase I 工作溶液 （200 U/mL），并在 37 °C 下孵育 10-30 分钟。在 PBS 中冲洗样品 3 次，每次 5 分钟。
14. 准备用于阴性对照的样品。
    1. 将 100 μL 1x DNase I 缓冲液工作溶液涂到透化样品中，并在室温下平衡 5 分钟。将阴性对照样品与 DNase I 缓冲液在 37 °C 下孵育 10-30 分钟，确保未添加 DNase I 酶。在 PBS 中冲洗样品 3 次，每次 5 分钟。
15. 将 100 μL 末端脱氧核苷酸转移酶 （TdT） 平衡缓冲液（TUNEL 检测试剂盒）涂在每个样品中，并在 37 °C 的加湿室中孵育 10-30 分钟。然后，用吸水纸去除 TdT 平衡缓冲液。
16. 向每个样品中加入 50 μL 标记工作溶液（TUNEL 检测试剂盒），然后在 37 °C 下在加湿、黑暗的室中孵育 60 分钟。如果信号强度较低，请考虑延长 DNA 标记反应时间。然后，用 PBS 3 次冲洗样品，每次 5 分钟。
17. 吸干多余的水分后，涂上 DAPI 工作溶液（TUNEL 检测试剂盒）并在室温下避光孵育 5 分钟以对细胞核进行复染。然后，在 PBS 中冲洗样品 4 次，每次 5 分钟。用吸水纸去除多余的液体，并使用防褪色封固剂密封载玻片。
18. 使用 Vectra Polaris 多光谱成像系统扫描染色的载玻片，并使用系统软件分析数据。

5. 统计分析

1. 将实验结果表示为SEM±平均值，并使用GraphPad Prism 10软件（GraphPad Software，San Diego，CA）用学生t检验分析数据以进行两组比较。
2. 将小于 0.05 的 p 值设置为统计差值。

结果

大鼠在 MCAO 期间缺血 120 分钟，然后再灌注 22 小时。MCAO 手术期间的死亡率最低，再灌注期间约为 25%。在 MCAO 组中观察到显著的脑损伤，而在 Sham 组的大脑中未观察到梗死 （24.87 ± 1.21% vs. 0% 梗死区域与整个大脑区域的总和;MCAO [n = 3] vs. 假 [n = 3]，P < 0.001;图 1A、B）。在 MCAO 组中，组织蛋白酶 B 的免疫反应性在缺血核心（组织蛋白?...

讨论

脑动脉闭塞导致缺氧和营养，然后是活性氧的激活、细胞内钙超负荷、谷氨酸释放和炎症反应的诱导¹⁵。这一系列事件导致梗塞脑中的细胞死亡和不可逆的组织损伤。半影有可能在适当的治疗窗口内通过医疗干预来挽救¹⁶。唯一批准的缺血性中风治疗方法是 tPA¹⁷ 静脉溶栓;然而，tPA 治疗的应用仅限于所有患者的 5%，主?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Akoya Vectra Polaris	Akoya Biosciences	N/A	Vectra Polaris multispectral imaging system
Anhydrous ethanol	Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co.	N/A
Buprenorphine	West China Hospital	N/A
Carprofen	West China Hospital	N/A
Cathepsin-B antibody	Abcam	Ab214428
Cryostat	LEICA	LEICA CM 1950
Digital camera	OLYMPUS	TG-7
Goat Anti-Rat IgG (H+L) (FITC conjugated)	Elabscience	E-AB-1021
Goat serum	Solarbio	SL038
GraphPad Prism 10 software	N/A	https://www.graphpad-prism.cn/?c=i&a=prismdownload_cn
ImageJ	N/A	https://imagej.net/ij/
Immunohistochemistry pen	Biosharp	http://www.biosharp.cn/index/product/details/language/en/product_id/2828.html
InForm software	Akoya Biosciences	Version 2.6.0	system software for the multispectral imaging system
Iodophor disinfecting solution	Huatian Technology Industry Co.	N/A
Isoflurane	RWD Life Science Co.	https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/
Mounting medium containing DAPI	Solarbio	S2110
Nylon monofilament	RWD Life Science Co.	https://www.rwdstco.com/
Optimal cutting temperature (OCT) compound	Epredia	N/A
Paraformaldehyde	Biosharp	N/A
Phosphate buffer solution (PBS)	Solarbio	N/A
Prism	GraphPad	Version 10
Proteinase K	Tiangen	RT403-02
Saline	Kelun Co.	N/A
Sprague-Dawley rats	Huafukang Co.	N/A
Sucrose	BioFroxx	1245GR500
Surgical instruments	RWD Life Science Co.	N/A
TO-type transparent biological agent	Beijing Solarbio Science & Tecnology Co., Ltd.	http://www.solarbio.net/
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solution	Solarbio	G3005
Triton X-100	BioFroxx	1139ML100
TUNEL kit	Elabscience	E-CK-A321