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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

I modelli in vivo di ratto sono strumenti indispensabili per studiare i meccanismi patologici e i bersagli terapeutici per l'ictus ischemico. Questo lavoro descriverà l'esecuzione della colorazione in immunofluorescenza in fette di cervello infartuate dopo occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) nei ratti.

Abstract

L'ictus è una delle principali cause di morte e disabilità in tutto il mondo. La maggior parte dei casi di ictus sono ischemici e derivano dall'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCA). Gli attuali approcci farmacologici per il trattamento dell'ictus ischemico sono limitati; Pertanto, sono urgentemente necessarie nuove terapie che forniscano un'efficace neuroprotezione contro il danno ischemico a seguito di ictus. Nel tessuto cerebrale a seguito di ictus ischemico, l'area della penombra ischemica è recuperabile ma a rischio di progredire verso un danno irreversibile. L'area penombrale che circonda il nucleo infartuato è un bersaglio concettuale per la neuroprotezione. Poiché il flusso sanguigno è parzialmente mantenuto nell'area penombrale, le cellule neuronali e non neuronali in quest'area sopravvivono transitoriamente dopo l'ictus e queste cellule che sono ancora vitali possono essere salvate da appropriati interventi medici. Comprendere la fisiopatologia della penombra è importante nello sviluppo di terapie neuroprotettive perché le vie di morte cellulare attivate nella penombra ischemica possono indicare bersagli terapeutici, come RUNX1 e catepsine. Questi bersagli proteici che funzionano come mediatori della morte cellulare programmata possono essere ulteriormente sfruttati nella ricerca traslazionale. Con dimensioni moderate e somiglianza con il cervello umano, il modello di occlusione MCA ( MCAO) in vivo di ratto imita l'ictus ischemico umano e offre uno strumento applicabile per indagare la patologia penombrale, esaminare la segnalazione della morte cellulare e valutare gli effetti di potenziali bersagli nel contesto di MCAO. Qui, descriviamo come indurre MCAO nei ratti e come eseguire la colorazione in immunofluorescenza per il rilevamento della segnalazione della morte cellulare nel cervello di ratto dopo MCAO.

Introduzione

L'ictus cerebrale è una delle principali cause di morte e disabilità in tutto il mondo1. L'elevata mortalità e morbilità dell'ictus comporta un immenso onere per la sanità pubblica e gravi conseguenze socio-economiche. Sebbene il tasso di incidenza e mortalità dell'ictus rimanga stabile, il numero di pazienti con ictus e di decessi correlati all'ictus sta aumentando nel corso dei decenni 2,3. Gli ictus possono essere classificati come ischemici o emorragici. La maggior parte dei casi di ictus sono ictus ischemici causati dall'occlusione di un'arteria cerebrale principale4. Ad oggi, l'attivatore del plasminogeno tissutale (tPA) è l'unico farmaco approvato dalla FDA per l'ictus ischemico, ma la sua applicazione è altamente limitata dalla finestra terapeutica ristretta, dalle complicanze e dalle controindicazioni 5,6,7. Pertanto, è urgente sviluppare nuove opzioni di trattamento con una finestra terapeutica più ampia per mitigare gli effetti dell'ictus.

I modelli animali sperimentali sono strumenti utili per studiare la fisiopatologia dell'ictus ischemico. Nella maggior parte dei pazienti umani, l'ictus ischemico è causato dall'ostruzione dell'arteria cerebrale media (MCA)8. Pertanto, sono stati sviluppati modelli di roditori di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) per assomigliare all'infarto cerebrale umano. Sebbene esistano diversi approcci MCAO utilizzati negli studi sui piccoli animali, il metodo più utilizzato è il modello di sutura intraluminale, che prevede l'inserimento di un filamento di nylon nell'arteria cerebrale media dalle arterie carotidi esterne o interne, con conseguente occlusione transitoria o permanente del flusso sanguigno 4,9. Questo modello porta a un grande volume di infarto cerebrale e consente l'esame della segnalazione della morte cellulare nel tessuto cerebrale infartuato con tecniche di immunofluorescenza.

L'area che circonda il nucleo infartuato, denominata penombra, è l'obiettivo di potenziali terapie per l'ictus10,11. Poiché il flusso sanguigno nella penombra è parzialmente mantenuto, i neuroni danneggiati e le cellule non neuronali in quest'area possono essere recuperati inibendo l'attivazione della segnalazione della morte cellulare. Prendere di mira le vie di morte cellulare può essere una strategia promettente per la neuroprotezione dopo l'ictus12. Pertanto, la valutazione della segnalazione della morte cellulare è fondamentale per la ricerca sperimentale sull'ictus. Recentemente, la catepsina-B, una proteasi lisosomiale, ha dimostrato di svolgere un ruolo nel mediare la morte cellulare programmata dopo l'ictus e ha guadagnato una notevole attenzione in campo neurologico13. La catepsina-B rappresenta un potenziale bersaglio per la neuroprotezione che merita ulteriori indagini.

Questo articolo dimostra come indurre la MCAO utilizzando l'approccio della sutura intraluminale nei ratti. Mostriamo anche come eseguire la colorazione con 2,3,5-trifeniltetrazalium chloride (TTC) per determinare le dimensioni dell'infarto e rilevare le cellule apoptotiche utilizzando la colorazione TUNEL (Terminal deoxynucleotidil transferase dUTP nick-end labeling).

Protocollo

Questo protocollo e gli esperimenti qui riportati sono stati approvati dal Comitato Etico Medico dell'Università del Sichuan. La cura e l'uso degli animali sono stati conformi a criteri etici locali e internazionali.

NOTA: In questo studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley maschi adulti del peso di 250-280 g. I ratti sono stati alloggiati in una condizione ambientale standard (temperatura di 20-22 °C, ciclo luce/buio di 12 ore), alimentati con una dieta standard a base di latte artificiale per ratti e acqua ad alta purezza. La procedura chirurgica è stata eseguita in condizioni sterili.

1. Modello di ratto di MCAO

  1. Indurre l'anestesia iniziale utilizzando isoflurano al 4% con ossigeno a 1 L/min. Monitorare la profondità dell'anestesia pizzicando il piede. Durante l'anestesia, somministrare un unguento oculare per prevenire la secchezza. Iniettare nel ratto 1 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea come rifornimento di volume e con 5 mg/kg di carprofene e 0,1 mg/kg di buprenorfina per l'analgesia preoperatoria. Ridurre l'isoflurano inizialmente al 3,5% e poi al 2% gradualmente durante l'intervento chirurgico.
  2. Posizionare il ratto in posizione supina e mantenere la temperatura corporea a 36,5 ± 0,1 °C su un tappetino termico regolato con una sonda per il monitoraggio della temperatura rettale. Radere e disinfettare la pelle del collo con una soluzione disinfettante iodophor.
  3. Praticare un'incisione di 2 cm sulla linea mediana del collo e ritrarre i tessuti molli per esporre i vasi carotidee. Usa il forcipe per isolare l'arteria carotide comune destra (CCA), l'arteria carotide esterna (ECA) e l'arteria carotide interna (ICA).
  4. Usa le suture per legare il CCA destro prossimale e bloccare l'ICA e l'ECA destro con una micro-clip alla loro origine.
  5. Inserire un monofilamento di nylon rivestito con una punta rotonda in silicone nel lume del CCA attraverso una piccola incisione e fare un nodo nel CCA per evitare il sanguinamento e lo spostamento del monofilamento di nylon.
  6. Aprire la micro-clip ICA destra e inserire il monofilamento di nylon nell'arteria cerebrale media destra (MCA) attraverso il moncone ICA fino a quando la punta in silicone non occlude l'origine dell'MCA (~18-20 mm).
  7. Tagliare la parte esposta del monofilamento di nylon e chiudere l'incisione della linea mediana del collo.
  8. Dopo 2 ore di occlusione dell'MCA, aprire l'incisione del collo e sciogliere il nodo nel CCA. Quindi estrarre il monofilamento di nylon per riperfondere l'MCA. Legare il CCA destro distale e chiudere l'incisione del collo con suture continue o interrotte.
  9. Dopo l'intervento, somministrare buprenorfina per iniezione sottocutanea ogni 8 ore, alla dose di 0,03 mg/kg. Osservare i ratti durante il recupero dall'anestesia in una gabbia riscaldata con un tappetino riscaldante a temperatura regolata. Per incoraggiare il consumo, metti nella gabbia una capsula di Petri con purè di cibo. Ospita un ratto per gabbia dopo l'intervento chirurgico.
  10. Sottoporre i ratti finti alla stessa procedura senza l'inserimento del monofilamento.
    NOTA: In ogni gruppo vengono utilizzati un totale di 9 animali per la misurazione delle dimensioni dell'infarto (n = 3), l'analisi dell'immunofluorescenza (n = 3) e la rilevazione dell'apoptosi (n = 3).
  11. Valutare la funzione neurologica a 2 ore dopo MCAO e 22 ore dopo la riperfusione utilizzando la scala di valutazione comportamentale Zea-Longa con una scala da 0 a 5 punti14. Escludi le tariffe con un punteggio di 0 o 4.

2. Misurazione delle dimensioni dell'infarto (Figura 1)

  1. Sacrificare i ratti in anestesia profonda (isoflurano al 4%) mediante ghigliottina e isolare accuratamente l'intero cervello dal cranio.
  2. Congelare il cervello a -20 °C per 20 minuti e tagliare il cervello congelato in sei fette coronali con una distanza di 2 mm tra le fette. Colorare le fette di cervello con il 2% di TTC per 15 minuti a 37 °C al buio.
  3. Fissare le fette di cervello con paraformaldeide al 4% per 24 ore a temperatura ambiente (RT). Fotografa le fette macchiate con una fotocamera digitale, con l'impostazione della modalità automatica per gli oggetti ravvicinati.
  4. Trasferisci le immagini su un computer e misura la dimensione dell'infarto utilizzando ImageJ. Presenta la dimensione dell'infarto come il rapporto tra la somma dell'area dell'infarto in 6 fette e la somma dell'intera area cerebrale nelle stesse fette. Esprimere i dati come media ± errore standard della media (SEM).

3. Analisi di immunofluorescenza su criosezione cerebrale (Figura 2)

  1. Indurre l'anestesia con isoflurano al 4% e 1 L/min di ossigeno. Incidere la pelle e il tessuto sottocutaneo per esporre il cuore.
  2. Togliete il pericardio e praticate un piccolo taglio nell'atrio destro. Perfondere 200 mL di soluzione fisiologica attraverso il ventricolo sinistro, seguiti da 200 mL di paraformaldeide al 4%.
  3. Apri il cranio e rimuovi il cervello intatto.
  4. Fissare il cervello in paraformaldeide al 4% a RT per oltre 24 ore. Quindi, disidratarlo in una serie di gradienti di soluzione di saccarosio del 10%, 15% e 30% fino a quando il tessuto non affonda, circa 6-8 ore per ogni concentrazione.
  5. Incorporare il cervello nel composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT) e rimuovere le bolle d'aria, se presenti. Quindi, congelare il cervello in azoto liquido e conservarlo nel congelatore a -80 °C.
  6. Sezionare il cervello utilizzando un criostato a uno spessore di 5 μm. Durante il sezionamento, assicurarsi che la temperatura dell'armadio rimanga compresa tra -18 °C e -20 °C. Etichettare la posizione di sezionamento in base al sito del modello e alle condizioni sperimentali. Conservare le sezioni in congelatore.
  7. Lasciare che le sezioni congelate si equilibrino a RT per ~30 minuti per eseguire la colorazione in immunofluorescenza. Quindi, immergere le sezioni con PBS sterile 3 volte per 5 minuti ciascuna.
  8. Delineare il tessuto con una penna immunoistochimica. Incubare con 20 μg/mL di proteinasi K (senza RNasi) e 0,3% di Triton X-100 a RT per 10 minuti.
  9. Immergere le sezioni con PBS sterile 3 volte per 5 minuti ciascuna. Applicare il 3% di BSA sul tessuto delineato e incubare a RT per 1 ora per il blocco.
  10. Dopo il blocco, rimuovere la soluzione, aggiungere l'anticorpo primario appropriato (Rabbit recombinant monoclonal cathepsin-B antibody, 1:200) e incubare le sezioni per una notte al buio a 4 °C.
  11. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare le sezioni con PBS sterile contenente lo 0,1% di Tween-20 3 volte per 5 minuti ciascuna.
  12. Aggiungere l'anticorpo secondario appropriato (IgG di capra anti-ratto [H+L] [FITC coniugato], 1:200) con il fluoroforo richiesto e incubare le sezioni in una camera umidificata a RT per 1 ora, proteggendole dalla luce.
  13. Dopo l'incubazione secondaria degli anticorpi, lavare le sezioni con PBS sterile contenente lo 0,1% di Tween-20 3 volte per 5 minuti ciascuna. Colorare le sezioni con un supporto di montaggio contenente DAPI e coprirle con un vetrino coprioggetti.
  14. Acquisisci immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza con le seguenti impostazioni: lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm, lunghezza d'onda di emissione di 520 nm e tempo di esposizione di 500 ms. Conservare le sezioni al buio a 4 °C per una conservazione a lungo termine.

4. Rilevamento dell'apoptosi mediante colorazione TUNEL (Figura 3)

NOTA: Per la colorazione TUNEL viene utilizzato un kit di test TUNEL commerciale. Questo kit TUNEL include una soluzione di lavoro tampone DNasi I, un tampone di equilibrazione deossinucleotidiltransferasi (TdT), una soluzione di lavoro per la marcatura e una soluzione di lavoro DAPI.

  1. Perfondere e isolare il cervello utilizzando la stessa procedura di cui sopra (passaggi 3.2-3.3). Immergere il cervello in paraformaldeide al 4% per 3-4 ore per il fissaggio.
  2. Tagliare il cervello in fette coronali di circa 2 mm di spessore, partendo dall'estremità rostrale fino all'estremità caudale, e immergere in paraformaldeide al 4% per ulteriori 12 ore. Dopo la fissazione, lavare le fette di cervello in acqua corrente per 1 ora.
  3. Immergere le fette di cervello in soluzioni di etanolo con concentrazioni del 50%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100% in sequenza per 35-50 minuti ciascuna per la disidratazione.
  4. Trattare le fette di cervello con l'agente biologico trasparente I di tipo TO per 35-50 minuti, seguito dall'agente schiarente II per 35-50 minuti, fino a quando il tessuto non è completamente trasparente.
  5. Immergere le fette di cervello in sequenza nel terreno di inclusione I per 60 minuti, nel terreno di inclusione II per 60 minuti, nel terreno di inclusione III per 60 minuti e nel terreno di inclusione IV per 60 minuti.
  6. Metti le fette di cervello in una cassetta da inclusione. Sigillare la cassetta, etichettarla chiaramente e metterla in una cella frigorifera per la solidificazione.
  7. Impostare il microtomo su uno spessore iniziale di 10 μm per tagliare il blocco di tessuto. Quindi, regolare lo spessore a 5 μm per l'affettatura.
  8. Riscaldare il bagnomaria a 45 °C, far galleggiare le sezioni di tessuto sulla superficie dell'acqua e raccoglierle su scivoli. Dopo circa 30 s, rimuovere i vetrini, asciugarli a RT e conservarli in una scatola di asciugatura.
  9. Deparaffinare le sezioni cerebrali immagazzinate immergendole in un agente di pulizia per 2 cicli, 10 minuti ciascuno.
  10. Per reidratare le sezioni, immergerle in etanolo anidro per 5 minuti, ripetendo 3 volte. Trasferire le sezioni in etanolo al 90% per 3 minuti. Inoltre, immergere le sezioni in etanolo all'80% per 3 minuti. Infine, immergere le sezioni in etanolo al 70% per 3 minuti.
  11. Sciacquare i campioni in PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno. Rimuovere delicatamente l'umidità in eccesso utilizzando carta da filtro.
  12. Somministrare 100 μL di soluzione di lavoro 1x proteinasi K a ciascun campione e incubare a 37 °C per 20 minuti. Dopo la permeabilizzazione, sciacquare i campioni in PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno.
  13. Preparare i campioni per il controllo positivo.
    1. Aggiungere 100 μl di 1x DNase I Buffer working solution (TUNEL assay kit) al campione permeabilizzato e lasciarlo equilibrare a RT per 5 minuti. Rimuovere con cautela il liquido in eccesso dal campione utilizzando carta assorbente.
    2. Aggiungere 100 μL di soluzione di lavoro diluita di DNasi I (200 U/mL) al campione e incubare a 37 °C per 10-30 min. Sciacquare i campioni in PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno.
  14. Preparare i campioni per il controllo negativo.
    1. Applicare 100 μl di soluzione di lavoro tampone DNasi I 1x sul campione permeabilizzato ed equilibrare a RT per 5 minuti. Incubare il campione di controllo negativo con DNase I Buffer a 37 °C per 10-30 minuti, assicurandosi che non venga aggiunto l'enzima DNasi I. Sciacquare i campioni in PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno.
  15. Applicare 100 μL di tampone di equilibrio deossinucleotidiltransferasi terminale (TdT) (kit del saggio TUNEL) su ciascun campione e incubare in una camera umidificata a 37 °C per 10-30 minuti. Quindi, rimuovere il tampone di equilibratura TdT con carta assorbente.
  16. Aggiungere 50 μl di soluzione di lavoro per la marcatura (kit del saggio TUNEL) a ciascun campione, quindi incubarli a 37 °C in una camera buia umidificata per 60 minuti. Se l'intensità del segnale è bassa, prendere in considerazione l'estensione del tempo di reazione di marcatura del DNA. Quindi, sciacquare i campioni in PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno.
  17. Dopo aver tamponato l'umidità in eccesso, applicare la soluzione di lavoro DAPI (kit del saggio TUNEL) e incubare a RT al buio per 5 minuti per controcolorare i nuclei. Quindi, sciacquare i campioni in PBS 4 volte per 5 minuti ciascuno. Rimuovere il liquido in eccesso con carta assorbente e sigillare i vetrini utilizzando un mezzo di montaggio anti-sbiadimento.
  18. Scansiona i vetrini colorati utilizzando il sistema di imaging multispettrale Vectra Polaris e analizza i dati con il software di sistema.

5. Analisi statistica

  1. Presentare i risultati sperimentali come mezzi ± SEM e analizzare i dati con un t-test di Student per due confronti di gruppo utilizzando il software GraphPad Prism 10 (GraphPad Software, San Diego, CA).
  2. Impostare un valore p inferiore a 0,05 come differenza statistica.

Risultati

I ratti sono sottoposti a ischemia di 120 minuti durante MCAO seguita da riperfusione di 22 ore. Il tasso di mortalità è stato minimo durante l'intervento chirurgico MCAO ed è stato di circa il 25% durante il periodo di riperfusione. Un danno cerebrale significativo è stato osservato nel gruppo MCAO, mentre nessun infarto è stato osservato nel cervello del gruppo Sham (24,87 ± 1,21% vs. 0% somma dell'area dell'infarto all'intera area cerebrale; MCAO [n = 3] contro Sham [n = 3],

Discussione

L'occlusione di un'arteria cerebrale porta alla privazione di ossigeno e nutrizione, seguita dall'attivazione di specie reattive dell'ossigeno, dal sovraccarico intracellulare di calcio, dal rilascio di glutammato e dall'induzione di risposte infiammatorie15. Questa serie di eventi provoca la morte cellulare e il danno irreversibile dei tessuti nel cervello infartuato. La penombra è potenzialmente recuperabile attraverso l'intervento medico all'interno di un'appr...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Simiao Wu è stato supportato dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia della Provincia del Sichuan (2024YFHZ0330) e dal West China Hospital dell'Università del Sichuan. Weihong He è stato supportato dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia della Provincia del Sichuan (2023YFS0297) e dall'Università del Sichuan. Ringraziamo Yi Zhang e Yue Li presso la Research Core Facility, West China Hospital dell'Università del Sichuan, per il loro supporto tecnico sull'imaging e l'analisi TUNEL.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Akoya Vectra PolarisAkoya BiosciencesN/AVectra Polaris multispectral imaging system 
Anhydrous ethanolChengdu Jinshan Chemical Reagent Co.N/A
BuprenorphineWest China HospitalN/A
CarprofenWest China HospitalN/A
Cathepsin-B antibodyAbcamAb214428
CryostatLEICA LEICA CM 1950
Digital cameraOLYMPUSTG-7
Goat Anti-Rat IgG (H+L) (FITC conjugated)Elabscience E-AB-1021
Goat serumSolarbioSL038
GraphPad Prism 10 softwareN/Ahttps://www.graphpad-prism.cn/?c=i&a=prismdownload_cn
ImageJN/Ahttps://imagej.net/ij/
Immunohistochemistry penBiosharphttp://www.biosharp.cn/index/product/details/language/en/product_id/2828.html
InForm softwareAkoya BiosciencesVersion 2.6.0system software for the multispectral imaging system 
Iodophor disinfecting solutionHuatian Technology Industry Co.N/A
IsofluraneRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/
Mounting medium containing DAPISolarbioS2110
Nylon monofilamentRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/
Optimal cutting temperature (OCT) compoundEprediaN/A
ParaformaldehydeBiosharpN/A
Phosphate buffer solution (PBS)SolarbioN/A
PrismGraphPad Version 10
Proteinase KTiangenRT403-02
SalineKelun Co.N/A
Sprague-Dawley ratsHuafukang Co.N/A
SucroseBioFroxx1245GR500
Surgical instrumentsRWD Life Science Co.N/A
TO-type transparent biological agent  Beijing Solarbio Science & Tecnology Co., Ltd.http://www.solarbio.net/
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solutionSolarbioG3005
Triton X-100BioFroxx1139ML100
TUNEL kitElabscience E-CK-A321

Riferimenti

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