Evaluación de la señalización de la muerte celular por inmunofluorescencia en un modelo de rata de accidente cerebrovascular isquémico

Resumen

Los modelos in vivo de ratas son herramientas indispensables para investigar los mecanismos patológicos y las dianas terapéuticas del ictus isquémico. Este trabajo describirá la realización de tinciones de inmunofluorescencia en cortes de cerebro infartados después de la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) en ratas.

Resumen

El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de muerte y discapacidad en todo el mundo. La mayoría de los casos de accidente cerebrovascular son isquémicos y resultan de la oclusión de la arteria cerebral media (ACM). Los enfoques farmacológicos actuales para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico son limitados; Por lo tanto, se necesitan con urgencia nuevas terapias que proporcionen una neuroprotección eficaz contra la lesión isquémica después de un accidente cerebrovascular. En el tejido cerebral después de un accidente cerebrovascular isquémico, el área de la penumbra isquémica es salvable, pero corre el riesgo de progresar a un daño irreversible. El área penumbral que rodea el núcleo infartado es un objetivo conceptual para la neuroprotección. Dado que el flujo sanguíneo se mantiene parcialmente en el área penumbral, las células neuronales y no neuronales de esta área sobreviven transitoriamente después del accidente cerebrovascular, y estas células que aún son viables pueden ser rescatadas mediante intervenciones médicas adecuadas. La comprensión de la fisiopatología de la penumbra es importante en el desarrollo de terapias neuroprotectoras porque las vías de muerte celular activadas en la penumbra isquémica pueden indicar dianas terapéuticas, como RUNX1 y catepsinas. Estas dianas proteicas que funcionan como mediadoras de la muerte celular programada pueden explotarse aún más en la investigación traslacional. Con un tamaño moderado y similitud con el cerebro humano, el modelo in vivo de rata de oclusión de MCA (MCAO) imita el accidente cerebrovascular isquémico humano y ofrece una herramienta aplicable para investigar la patología penumbral, examinar la señalización de la muerte celular y evaluar los efectos de posibles objetivos en el contexto de MCAO. Aquí, describimos cómo inducir MCAO en ratas y cómo realizar la tinción de inmunofluorescencia para la detección de la señalización de muerte celular en el cerebro de rata después de MCAO.

Introducción

El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de muerte y discapacidad en todo el mundo¹. La elevada mortalidad y morbilidad del ictus supone una inmensa carga sanitaria pública y graves consecuencias socioeconómicas. Aunque la tasa de incidencia y mortalidad por accidente cerebrovascular se mantiene estable, el número de pacientes con accidente cerebrovascular y las muertes relacionadas con el accidente cerebrovascular están aumentando en las últimas^{décadas 2,3}. Los accidentes cerebrovasculares se pueden clasificar como isquémicos o hemorrágicos. La mayoría de los casos de ictus son ictus isquémicos causados por la oclusión de una arteria cerebral principal⁴. Hasta la fecha, el activador tisular del plasminógeno (tPA) es el único fármaco aprobado por la FDA para el accidente cerebrovascular isquémico, pero su aplicación está muy limitada por la estrecha ventana terapéutica, las complicaciones y las contraindicaciones ^5,6,7. Por lo tanto, es urgente desarrollar nuevas opciones de tratamiento con una ventana terapéutica más amplia para mitigar los efectos del ictus.

Los modelos animales experimentales son herramientas útiles para estudiar la fisiopatología del ictus isquémico. En la mayoría de los pacientes humanos, el accidente cerebrovascular isquémico es causado por la obstrucción de la arteria cerebral media (ACM)⁸. Por lo tanto, se han desarrollado modelos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) en roedores para parecerse al infarto cerebral humano. Si bien existen varios enfoques de MCAO que se utilizan en estudios con animales pequeños, el método más utilizado es el modelo de sutura intraluminal, que implica la inserción de un filamento de nailon en la arteria cerebral media desde las arterias carótidas externas o internas, lo que resulta en una oclusión transitoria o permanente del flujo sanguíneo ^4,9. Este modelo conduce a un gran volumen de infarto cerebral y permite examinar la señalización de muerte celular en el tejido cerebral infartado con técnicas de inmunofluorescencia.

El área que rodea el núcleo infartado, denominada penumbra, es el objetivo de posibles terapias para el ictus^10,11. Dado que el flujo sanguíneo en la penumbra se mantiene parcialmente, las neuronas lesionadas y las células no neuronales en esta área pueden salvarse mediante la inhibición de la activación de la señalización de muerte celular. Dirigirse a las vías de muerte celular puede ser una estrategia prometedora para la neuroprotección después del accidente cerebrovascular¹². Por lo tanto, la evaluación de la señalización de la muerte celular es crucial para la investigación experimental del ictus. Recientemente, se ha demostrado que la catepsina-B, una proteasa lisosomal, desempeña un papel en la mediación de la muerte celular programada después de un accidente cerebrovascular, y ha ganado una atención sustancial en el campo neurológico¹³. La catepsina-B representa un objetivo potencial para la neuroprotección que amerita más investigación.

Este artículo demuestra cómo inducir MCAO utilizando el abordaje de sutura intraluminal en ratas. También mostramos cómo realizar la tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazalio (TTC) para determinar el tamaño del infarto y detectar células apoptóticas mediante la tinción de marcaje de níquel (TUNEL) de desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP.

Protocolo

Este protocolo y los experimentos reportados aquí fueron aprobados por el Comité de Ética Médica de la Universidad de Sichuan. El cuidado y uso de los animales se realizó de acuerdo con criterios éticos locales e internacionales.

NOTA: En este estudio se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho adultas con un peso de 250-280 g. Las ratas se alojaron en una condición ambiental estándar (temperatura de 20-22 °C, ciclo de luz/oscuridad de 12 h), alimentadas con una dieta de fórmula estándar para ratas y agua de alta pureza. El procedimiento quirúrgico se realizó en condiciones estériles.

1. Modelo de rata de MCAO

1. Inducir la anestesia inicial con isoflurano al 4% con oxígeno a 1 L/min. Controle la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en el pie. Mientras se logra la anestesia, administre una pomada ocular para evitar la sequedad. Inyectar a la rata 1 mL de solución salina por vía subcutánea como reposición de volumen y 5 mg/kg de carprofeno y 0,1 mg/kg de buprenorfina para la analgesia preoperatoria. Reducir el isoflurano al 3,5% inicialmente y luego al 2% gradualmente a lo largo de la cirugía.
2. Coloque a la rata en posición supina y mantenga la temperatura corporal entre 36,5 ± 0,1 °C sobre una estera térmica regulada con una sonda de control de temperatura rectal. Afeitar y desinfectar la piel del cuello con una solución desinfectante de yodóforo.
3. Realice una incisión de 2 cm en la línea media del cuello y retraiga los tejidos blandos para exponer los vasos carotídeos. Use fórceps para aislar la arteria carótida común (CCA) derecha, la arteria carótida externa (ECA) y la arteria carótida interna (ACI).
4. Utilice suturas para ligar el CCA proximal derecho y pinzar el ACI y el ECA derechos con un microclip en su origen.
5. Inserte un monofilamento de nailon recubierto con una punta redonda de silicona en el lumen del CCA a través de una pequeña incisión y haga un nudo en el CCA para evitar el sangrado y el desprendimiento del monofilamento de nailon.
6. Abra el microclip ICA derecho e inserte el monofilamento de nailon en la arteria cerebral media derecha (MCA) a través del muñón ICA hasta que la punta de silicona ocluya el origen del MCA (~18-20 mm).
7. Corta la parte expuesta del monofilamento de nailon y cierra la incisión de la línea media del cuello.
8. Después de 2 h de oclusión de MCA, abra la incisión del cuello y desate el nudo en el CCA. A continuación, retire el monofilamento de nylon para volver a fundir el MCA. Lime el CCA distal derecho y cierre la incisión del cuello con suturas continuas o interrumpidas.
9. En el postoperatorio, administrar buprenorfina por inyección subcutánea cada 8 h, a una dosis de 0,03 mg/kg. Observe a las ratas durante toda la recuperación de la anestesia en una jaula calentada con una estera calefactora con temperatura regulada. Para animar a comer, coloque una placa de Petri con puré de comida en la jaula. Aloje una rata por jaula después de la cirugía.
10. Someta las ratas falsas al mismo procedimiento sin la inserción del monofilamento.
    NOTA: Se utilizan un total de 9 animales en cada grupo para la medición del tamaño del infarto (n = 3), el análisis de inmunofluorescencia (n = 3) y la detección de apoptosis (n = 3).
11. Evaluar la función neurológica a las 2 h después de la MCAO y 22 h después de la reperfusión utilizando la escala de valoración conductual de Zea-Longa con una escala de 0 a 5 puntos¹⁴. Excluya las tarifas con una puntuación de 0 o 4.

2. Medición del tamaño del infarto (Figura 1)

1. Sacrificar ratas bajo anestesia profunda (4% de isoflurano) mediante guillotina y aislar cuidadosamente todo el cerebro del cráneo.
2. Congele el cerebro a -20 °C durante 20 minutos y corte el cerebro congelado en seis cortes coronales con una distancia de 2 mm entre cortes. Tiñe las rodajas de cerebro con TTC al 2% durante 15 minutos a 37 °C en la oscuridad.
3. Fijar los trozos de cerebro con paraformaldehído al 4% durante 24 h a temperatura ambiente (RT). Fotografíe las rodajas manchadas con una cámara digital, con configuración de modo automático para objetos en primer plano.
4. Transfiera las imágenes a una computadora y mida el tamaño del infarto con ImageJ. Presente el tamaño del infarto como la relación entre la suma del área del infarto en 6 cortes y la suma de toda el área del cerebro en los mismos cortes. Exprese los datos como media ± error estándar de la media (SEM).

3. Análisis de inmunofluorescencia en criosección cerebral (Figura 2)

1. Inducir la anestesia con isoflurano al 4% y 1 L/min de oxígeno. Incidir la piel y el tejido subcutáneo para exponer el corazón.
2. Retire el pericardio y haga una pequeña incisión en la aurícula derecha. Perfundir 200 mL de solución salina a través del ventrículo izquierdo, seguido de 200 mL de paraformaldehído al 4%.
3. Abra el cráneo y extraiga el cerebro intacto.
4. Fijar el cerebro en paraformaldehído al 4% en RT durante más de 24 h. Luego, deshidratarlo en una serie de gradientes de solución de sacarosa de concentraciones de 10%, 15% y 30% hasta que el tejido se hunda, aproximadamente 6-8 horas para cada concentración.
5. Incruste el cerebro en el compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) y elimine las burbujas de aire si las hay. A continuación, congela el cerebro en nitrógeno líquido y guárdalo en el congelador a -80 °C.
6. Seccionar el cerebro con un criostato de 5 μm de grosor. Durante el seccionamiento, asegúrese de que la temperatura del gabinete permanezca entre -18 °C y -20 °C. Etiquete la ubicación de corte en función del sitio modelo y las condiciones experimentales. Guarde las secciones en un congelador.
7. Deje que las secciones congeladas se equilibren en RT durante ~ 30 min para realizar la tinción de inmunofluorescencia. Luego, remoje las secciones con PBS estéril 3 veces durante 5 minutos cada una.
8. Delinee el tejido con una pluma de inmunohistoquímica. Incubar con 20 μg/mL de proteinasa K (libre de ARNasa) y Triton X-100 al 0,3% a RT durante 10 min.
9. Remoje las secciones con PBS estéril 3 veces durante 5 minutos cada una. Aplique BSA al 3% en el tejido delineado e incube en RT durante 1 h para el bloqueo.
10. Después del bloqueo, retire la solución, agregue el anticuerpo primario apropiado (anticuerpo de catepsina monoclonal B recombinante de conejo, 1:200) e incube las secciones durante la noche en la oscuridad a 4 °C.
11. Retire el anticuerpo primario y lave las secciones con PBS estéril que contenga 0.1% Tween-20 3x durante 5 minutos cada una.
12. Añadir el anticuerpo secundario adecuado (IgG Anti-Rata de Cabra [H+L] [FITC conjugado], 1:200) con el fluoróforo requerido, e incubar las secciones en una cámara humidificada a RT durante 1 h, protegiéndolas de la luz.
13. Después de la incubación secundaria de anticuerpos, lavar las secciones con PBS estéril que contenga 0,1% de Tween-20 3x durante 5 minutos cada una. Teñir las secciones con un medio de montaje que contenga DAPI y cubrirlas con un cubreobjetos.
14. Capture imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia con los siguientes ajustes: longitud de onda de excitación de 488 nm, longitud de onda de emisión de 520 nm y tiempo de exposición de 500 ms. Guarde las secciones en la oscuridad a 4 °C para su conservación a largo plazo.

4. Detección de apoptosis por tinción TUNEL (Figura 3)

NOTA: Se utiliza un kit de ensayo TUNEL comercial para la tinción de TUNEL. Este kit TUNEL incluye una solución de trabajo de tampón de DNasa I, un tampón de equilibrio de desoxinucleotidil transferasa (TdT), una solución de trabajo de etiquetado y una solución de trabajo DAPI.

1. Perfundir y aislar el cerebro utilizando el mismo procedimiento que el anterior (pasos 3.2-3.3). Sumerja el cerebro en paraformaldehído al 4% durante 3-4 h para la fijación.
2. Cortar el cerebro en rodajas coronales de aproximadamente 2 mm de grosor, comenzando desde el extremo rostral hasta el extremo caudal, y sumergir en paraformaldehído al 4% durante 12 h adicionales. Después de la fijación, lavar las rodajas de cerebro con agua corriente durante 1 h.
3. Sumerja los trozos de cerebro en soluciones de etanol de concentraciones de 50%, 70%, 80%, 90%, 95% y 100% secuencialmente durante 35-50 minutos cada una para la deshidratación.
4. Trate las rodajas de cerebro con agente biológico transparente tipo TO I durante 35-50 minutos, seguido de agente aclarante II durante 35-50 minutos, hasta que el tejido esté completamente transparente.
5. Sumerja los cortes de cerebro secuencialmente en el medio de inclusión I durante 60 minutos, el medio de inclusión II durante 60 minutos, el medio de inclusión III durante 60 minutos y el medio de inclusión IV durante 60 minutos.
6. Coloque las rodajas de cerebro en un casete de inclusión. Selle el casete, etiquételo claramente y colóquelo en una cámara frigorífica para su solidificación.
7. Ajuste el micrótomo a un grosor inicial de 10 μm para recortar el bloque de tejido. A continuación, ajuste el grosor a 5 μm para cortar.
8. Caliente el baño de agua a 45 °C, haga flotar las secciones de tejido en la superficie del agua y recójalas en portaobjetos. Después de aproximadamente 30 s, retire los portaobjetos, séquelos en RT y guárdelos en una caja de secado.
9. Desparafinar las secciones de cerebro almacenadas sumergiéndolas en un agente de limpieza durante 2 ciclos, de 10 minutos cada uno.
10. Para rehidratar las secciones, sumérjalas en etanol anhidro durante 5 min, repitiendo 3 veces. Transfiera las secciones a etanol al 90% durante 3 min. Además, remoje las secciones en etanol al 80% durante 3 minutos. Finalmente, sumerja las secciones en etanol al 70% durante 3 min.
11. Enjuague las muestras en PBS 3 veces durante 5 minutos cada una. Elimine suavemente el exceso de humedad con papel de filtro.
12. Administrar 100 μL de solución de trabajo de proteinasa K 1x a cada muestra e incubar a 37 °C durante 20 min. Después de la permeabilización, enjuague las muestras en PBS 3x durante 5 minutos cada una.
13. Prepare las muestras para el control positivo.
    1. Añadir 100 μL de solución de trabajo tampón de DNasa I 1x (kit de ensayo TUNEL) a la muestra permeabilizada y dejar que se equilibre a RT durante 5 min. Retire con cuidado el exceso de líquido de la muestra con papel absorbente.
    2. Añadir 100 μL de solución de trabajo de DNasa I diluida (200 U/mL) a la muestra e incubar a 37 °C durante 10-30 min. Enjuague las muestras en PBS 3 veces durante 5 minutos cada una.
14. Prepare las muestras para el control negativo.
    1. Aplique 100 μL de solución de trabajo tampón de DNasa I 1x a la muestra permeabilizada y equilibre a RT durante 5 min. Incubar la muestra de control negativo con tampón de DNasa I a 37 °C durante 10-30 min, asegurándose de que no se añada ninguna enzima de DNasa I. Enjuague las muestras en PBS 3 veces durante 5 minutos cada una.
15. Aplique 100 μL de tampón de equilibrio de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (kit de ensayo TUNEL) a cada muestra e incube en una cámara humidificada a 37 °C durante 10-30 min. A continuación, retire el tampón de equilibrio TdT con papel absorbente.
16. Añada 50 μl de solución de trabajo de etiquetado (kit de ensayo TUNEL) a cada muestra, luego incélelas a 37 °C en una cámara oscura humidificada durante 60 minutos. Si la intensidad de la señal es baja, considere extender el tiempo de reacción de marcado de ADN. Luego, enjuague las muestras en PBS 3x durante 5 minutos cada una.
17. Después de secar el exceso de humedad, aplique la solución de trabajo DAPI (kit de ensayo TUNEL) e incube a RT en la oscuridad durante 5 min para contrateñir los núcleos. Luego, enjuague las muestras en PBS 4x durante 5 minutos cada una. Retire el exceso de líquido con papel absorbente y selle los portaobjetos con un medio de montaje antidecoloración.
18. Escanee los portaobjetos teñidos con el sistema de imágenes multiespectrales Vectra Polaris y analice los datos con el software del sistema.

5. Análisis estadístico

1. Presentar los resultados experimentales como medios ± SEM y analizar los datos con una prueba t de Student para dos comparaciones de grupos utilizando el software GraphPad Prism 10 (GraphPad Software, San Diego, CA).
2. Establezca un valor p inferior a 0,05 como diferencia estadística.

Resultados

Las ratas se someten a una isquemia de 120 min durante la MCAO, seguida de una reperfusión de 22 h. La tasa de mortalidad fue mínima durante la cirugía de MCAO y se situó en torno al 25% en el periodo de reperfusión. Se observó daño cerebral significativo en el grupo MCAO, mientras que no se observó infarto en el cerebro del grupo Sham (24,87 ± 1,21% vs. 0% de la suma del área del infarto a toda el área cerebral; MCAO [n = 3] vs. Sham [n = 3], P < 0,001;

Discusión

La oclusión de una arteria cerebral conduce a la privación de oxígeno y nutrición, seguida de la activación de especies reactivas de oxígeno, sobrecarga de calcio intracelular, liberación de glutamato e inducción de respuestas inflamatorias¹⁵. Esta serie de eventos resulta en la muerte celular y daño irreversible del tejido en el cerebro infartado. La penumbra es potencialmente salvable a través de la intervención médica dentro de una ventana terapéut...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Akoya Vectra Polaris	Akoya Biosciences	N/A	Vectra Polaris multispectral imaging system
Anhydrous ethanol	Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co.	N/A
Buprenorphine	West China Hospital	N/A
Carprofen	West China Hospital	N/A
Cathepsin-B antibody	Abcam	Ab214428
Cryostat	LEICA	LEICA CM 1950
Digital camera	OLYMPUS	TG-7
Goat Anti-Rat IgG (H+L) (FITC conjugated)	Elabscience	E-AB-1021
Goat serum	Solarbio	SL038
GraphPad Prism 10 software	N/A	https://www.graphpad-prism.cn/?c=i&a=prismdownload_cn
ImageJ	N/A	https://imagej.net/ij/
Immunohistochemistry pen	Biosharp	http://www.biosharp.cn/index/product/details/language/en/product_id/2828.html
InForm software	Akoya Biosciences	Version 2.6.0	system software for the multispectral imaging system
Iodophor disinfecting solution	Huatian Technology Industry Co.	N/A
Isoflurane	RWD Life Science Co.	https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/
Mounting medium containing DAPI	Solarbio	S2110
Nylon monofilament	RWD Life Science Co.	https://www.rwdstco.com/
Optimal cutting temperature (OCT) compound	Epredia	N/A
Paraformaldehyde	Biosharp	N/A
Phosphate buffer solution (PBS)	Solarbio	N/A
Prism	GraphPad	Version 10
Proteinase K	Tiangen	RT403-02
Saline	Kelun Co.	N/A
Sprague-Dawley rats	Huafukang Co.	N/A
Sucrose	BioFroxx	1245GR500
Surgical instruments	RWD Life Science Co.	N/A
TO-type transparent biological agent	Beijing Solarbio Science & Tecnology Co., Ltd.	http://www.solarbio.net/
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solution	Solarbio	G3005
Triton X-100	BioFroxx	1139ML100
TUNEL kit	Elabscience	E-CK-A321