Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول إصابة جذور Solanum tuberosum بالديدان الخيطية الطفيلية النباتية في ظروف الدفيئة في الجسم الحي وجذور البطاطس المعدلة وراثيا في المختبر للتحليل الكيميائي النسيجي لبنية الجذر من خلال الفحص المجهري البصري.

Abstract

تعتبر الديدان الخيطية الطفيلية النباتية التي تعيش في التربة (PPNs) من آفات البطاطس المهمة التي تسبب آفات و / أو تغير بنية جذور النبات ، مما يؤدي إلى انخفاض لياقة المحاصيل وإنتاجيتها. يمكن أن تلجأ الأبحاث حول الآليات الخلوية وتحت الخلوية لعدوى PPNs وتطورها إلى النباتات الحقلية أو الشتلات في ظل ظروف الاحتباس الحراري. الدراسات الميدانية أكثر تمثيلا للبيئات الطبيعية ولكنها تخضع لعدم القدرة على التنبؤ بالظروف البيئية التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نتائج البحث. تسمح دراسات الدفيئة بتحكم أعلى في المتغيرات البيئية وسلامة أعلى ضد الملوثات أو مسببات الأمراض. ومع ذلك ، في بعض المضيفين ، يصبح التنوع الجيني عاملا مهما للتباين ويؤثر على الاستجابة المعقدة للطفيلي المضيف. لقد قمنا بتطوير الثقافات المشتركة في المختبر للجذور المعدلة وراثيا مع PPNs كبديل موثوق به يشغل مساحة أقل ، ويتطلب وقتا أقل للحصول عليه ، وخالي من التلوث أو من التباين الجيني للمضيف. يتم الحصول على الثقافات المشتركة عن طريق إدخال PPNs المعقمة لاستضافة الجذور المعدلة وراثيا في المختبر . يمكن الاحتفاظ بها إلى أجل غير مسمى ، مما يجعلها دعما ممتازا للاحتفاظ بمجموعات PPNs المرجعية. في العمل الحالي ، تم تفصيل بروتوكول للعدوى الخاضعة للرقابة لجذور البطاطس في الجسم الحي بالديدان الخيطية لآفة الجذر ولإنشاء مزارع مشتركة في المختبر لجذور البطاطس المعدلة وراثيا مع الديدان الخيطية ذات عقدة الجذر. وفرت الاستزراعات المشتركة في المختبر وكيلا مختبريا لحالة العدوى الطبيعية بالبطاطس وأنتجت مراحل حياة الديدان الخيطية بغض النظر عن الموسم أو الظروف المناخية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تفصيل المنهجية المستخدمة في التحليل الهيكلي باستخدام الكيمياء النسيجية والفحص المجهري البصري. تستخدم صبغة الفوشين الحمضية لمتابعة مواقع هجوم الديدان الخيطية على الجذور ، بينما يسلط التلوين التفاضلي باستخدام حمض الشيف الدوري (PAS) والتولودين الأزرق O الضوء على هياكل الديدان الخيطية في أنسجة جذر البطاطس الداخلية.

Introduction

تحتل المحاصيل الجذرية والدرنات المرتبةالرابعة بين أهم الأطعمة الأساسية في العالم. البطاطس (Solanum tuberosum L.) هي واحدة من أهم الدرنات المزروعة. أصله في جبال الأنديز في أمريكا الجنوبية ، ولكن بعد إدخاله إلى أوروبافي القرن السادس عشر ، سرعان ما أصبح مصدر الغذاء الأكثر شيوعا للسكان ذوي الدخل المنخفض. اليوم ، تشكل البطاطس 1.7٪ من السعرات الحرارية في العالم1. يتأثر إنتاج المحاصيل بشدة بالآفات النباتية ومسببات الأمراض ، والتي يمكن أن تتسبب الديدان الخيطية الطفيلية النباتية (PPNs) في متوسط خسائر في الغلة ترتفع إلى 12٪2. الديدان الخيطية الطفيلية النباتية مسؤولة عن بعض الأمراض الأكثر ضررا للمحاصيل في الزراعة الحديثة. تفرض PPNs التي تعيش في التربة خسائر فادحة على المزارعين لأنها تؤثر على جذور النباتات وتتداخل مع إنتاجية المحاصيل عن طريق تقليل الإنتاج و / أو إصابة المنتجات ، مما يجعلها غير قابلة للتسويق3. تستخدم هذه الطفيليات النباتية الخطيرة أسلوبها (جزء فم يشبه الإبرة) لثقب الخلايا الجذرية وتغذيها على محتوى الخلايا. تتغذى بعض PPNs من خارج الجذور ، والبعض الآخر يدخل الجذر ويسبب تلفا في الأنسجة (مهاجرة) ، بينما يدخل البعض الآخر إلى الجذور ويصبح مستقرا ، ويتغير بشكل كبير في بنية الجذرلتسهيل التغذية 4. ال PPNs الرئيسية التي تؤثر على البطاطس هي نيماتودا كيس البطاطس ، Globodera spp. ، الديدان الخيطية ذات العقدة الجذرية (RKN) ، Meloidogyne spp. ، الديدان الخيطية لآفة الجذر ، Pratylenchus spp. ، الديدان الخيطية الكاذبة لعقدة الجذر Nacobbus aberrans ، والديدان الخيطية لتعفن البطاطس Ditylenchus destructor. بالنسبة إلى PPNs هذه ، تؤدي عادات التغذية المختلفة إلى تغييرات هيكلية مختلفة في أنسجة الجذر المضيف5،6. غالبا ما يتم إجراء البحث حول آليات عدوى PPN واستجابة المضيف من خلال التجارب الميدانية أو الدفيئة للحفاظ على مجموعات استزراع PPN المرجعية أو لإجراء تجارب واسعة النطاق7،8. يتأثر الاختبار في ظل الظروف الطبيعية بشدة بالتباين البيئي وعوامل الإجهاد الحيوي أو اللاأحيائي تعد المقايسات الحيوية للاحتباس الحراري بديلا أقرب للحالة الطبيعية مع السماح بالتحكم النسبي في التباين البيئي والحد من تأثير الإجهاد اللاأحيائي والحيوي. ومع ذلك ، يمكن أن يظل التنوع الجيني المضيف يمثل تحديا للتجارب التي تتطلب تحكما أدق في التباين البيولوجي. يمكن التغلب على هذه القيود باللجوء إلى مزارع الأنسجة النباتية في المختبر . هذه أنظمة معملية متعددة الاستخدامات مع العديد من المزايا لأبحاث مرض PPNs. بالنسبة إلى PPNs التي تعيش في التربة ، تعد المزارع المختبرية للجذور المعدلة وراثيا أداة مفيدة للبحث في ظروف المختبر9،10.

يتم الحصول على الجذور المعدلة وراثيا ، أو الجذور المشعرة (HR) ، بعد إصابة المواد النباتية ب Rhizobium rhizogenes (Riker et al. 1930) Young et al. 200111. تحفز هذه البكتيريا سالبة الجرام تعداء بلازميد Ri في جينوم المضيف وتغير تنظيم التخليق الحيوي للهرمون النباتي ، مما يعزز تكوين أنسجة الجذر12. يمكن الحفاظ على الجذور المعدلة وراثيا إلى أجل غير مسمى تحت التعقيم في وسط الاستزراع. تتمثل مزايا استخدام الموارد البشرية لدراسة PPNs في معدل نمو مرتفع في غياب منظمات نمو النبات التي تؤثر على عدوى الديدان الخيطية وتطورها ، ونسبة عالية من إنتاج الكتلة الحيوية لكل وحدة زمنية ، وسلامة الخلايا وطول العمر ، والتي تحدد استقرارا وراثيا وكيميائيا حيوياأعلى 6. من خلال اللجوء إلى الجذور المعدلة وراثيا في المختبر ، يمكن الحفاظ على الأنماط الجينية ل PPNs إلى أجل غير مسمى في ظل ظروف معملية ، ويمكن متابعة تطور العدوى و PPNs بسهولة ، ويمكن تقليل التباين الجيني للمضيف ، ويمكن ربط التلاعب بالتركيب الجزيئي للمضيف ارتباطا مباشرا باستجابة الديدان الخيطية ، ويمكن متابعة التغييرات الهيكلية للمضيف والطفيليات بشكل أكثر دقة6،13. بالنسبة للدراسات التي أجريت على أمراض PPN للبطاطس ، تسمح المزارع المشتركة للجذور المعدلة وراثيا في المختبر بإجراء تجارب بشكل مستقل عن الموسم أو سكون درنات البطاطس.

في هذا البروتوكول ، يتم تفصيل المنهجية التقليدية لصيانة PPNs والعدوى في الجسم الحي لنباتات البطاطس. بالنسبة للتحليل الهيكلي للجذور المصابة ، تم أيضا تفصيل منهجية محسنة تعتمد على إنشاء مزارع مشتركة في المختبر لجذور البطاطس المعدلة وراثيا باستخدام PPNs كبديل يسمح بتحكم أعلى في التباين الجيني البيئي والمضيف. لمتابعة عدوى PPNs وتطورها في أنسجة الجذر ، يتم استخدام الكيمياء النسيجية للمساعدة في مراقبة PPNs تحت الفحص المجهري البصري. الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحسين دراسة تفاعلات مضيف PPN ، وضمان ظروف أكثر تحكما وقابلية للتكرار للتجريب مع تسهيل التحليلات الهيكلية والتنموية التفصيلية للديدان الخيطية في أنسجة الجذر.

Protocol

1. إصابة نباتات البطاطس المزروعة في الدفيئة

ملاحظة: تجرى تجارب الدفيئة مع تعليق PPNs في مراحل الحياة المختلطة أو الأحداث في المرحلة الثانية (J2) ، اعتمادا على دورة الحياة المحددة لآفة PPN. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم استخدام معلقات مراحل الحياة المختلطة للديدان الخيطية للآفة الجذرية (RLN) Pratylenchus penetrans . يمكن تربية PPNs في المختبر أو طلبها من المختبرات المرجعية المعتمدة.

  1. تكاثر وصيانة الديدان الخيطية للآفات الجذرية
    ملاحظة: تستخدم أقراص الجزر المعقمة لتكاثر وصيانة RLNs14. استخدم الجزر المكتسب تجاريا (var. Nice) بدون ضرر واضح لتقليل التلوث الميكروبي. ويفضل أن تكون خالية من المبيدات الحشرية لتجنب إعاقة تطور RLN.
    1. اغسل الجزر بماء الصنبور الجاري لإزالة الحطام الأكبر حجما ، وبعد ذلك ، باستخدام محلول منظف شائع (قطرة واحدة لكل 40 مل من الماء) لإزالة الحطام الدقيق. جفف بالمناشف الورقية المختبرية.
    2. تحت التعقيم ، في غطاء التدفق الرأسي ، أدخل سيخا معدنيا معقما في الجزء العلوي من الجزر (من 1 إلى 2 سم إلى الداخل) حتى يمكن حمله بسهولة أكبر.
    3. بمساعدة زجاجة غسيل بفوهة ، بلل الجزر بنسبة 96٪ (v / v) من الإيثانول. امسح الطرف السفلي من الجزر في ورق ترشيح معقم وخذه بحذر إلى اللهب.
      تنبيه: اعلم أن الإيثانول يشتعل بقوة ، لذا قف على مسافة.
    4. قشر الجزر من أعلى إلى أسفل باستخدام مقشرة معقمة ثم كرر الخطوة السابقة. تخلص من القسمين العلوي والسفلي (2 سم للداخل) وضع الجزء الأوسط من الجزر في طبق بتري معقم (قطره 150 مم). باستخدام شفرة معقمة وملاقط ، قم بقص أقسام بسمك 1 سم بعناية من الجزء الذي يبلغ قطره حوالي 2 سم من الجزر (الشكل 1).
    5. انقل الأقسام إلى أطباق بتري معقمة (قطر 60 مم) وأغلق الحدود بغشاء شفاف. باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، قم بتعقيم سطح أقراص الجزر لمدة 60 دقيقة على كل جانب.
    6. يحفظ في درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع في الظلام وتخلص من أي أقراص جزر تبدأ في إظهار علامات التلوث الميكروبي15.
      ملاحظة: علامات التلوث المرئية هي اللون البني المفرط (التعفن) ، أو تراكم السوائل في الحد السفلي لقرص الجزر ، أو نمو الفطريات الفطرية على السطح.
    7. أقراص الجزر المتبقية جاهزة للإصابة بتعليق RLN. ابدأ بعمل شق على شكل X في وسط قرص الجزر باستخدام شفرة معقمة. تأكد من قطع منتصف الطريق بعمق.
    8. تلقيح RLN عن طريق سحب 50 ميكرولتر من المعلق الذي يحتوي على 50 مرحلة حياة مختلطة على الأقل في وسط الجرح على شكل X. أغلق طبق بتري وأغلق الحدود بغشاء شفاف لتجنب الجفاف.
      1. حدد متوسط عدد الديدان الخيطية في المعلق عن طريق حساب خمسة 50 ميكرولتر تحت مجهر مجهر مجهر (40x) في درجة حرارة الغرفة في شريحة مقعرة. اضبط تعليق RLNs في مرحلة الحياة المختلطة على 1000 لكل مل عن طريق إضافة الماء إلى المعلق أو انتظار استقرار الديدان الخيطية (حوالي 60 دقيقة) وخفض الحجم عن طريق صب المياه السطحية.
    9. احتفظ بأقراص الجزر عند 25 درجة مئوية ، في الظلام ، لمدة تصل إلى 3 أشهر واتبعها أسبوعيا تحت مجهر مجهر بحثا عن علامات الآفات النخرية الناتجة عن النمو السكاني ل RLN.
      ملاحظة: يمكن تخزين أقراص الجزر المتطفلة بنجاح عند 11 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا لمدة تصل إلى شهرين ولكن تحقق بانتظام من التلوث الميكروبي. يجب تطهير أقراص الجزر المتطفلة التي تظهر عليها علامات العدوى الميكروبية عن طريق التعقيم قبل التخلص منها.
    10. تحت غطاء التدفق ، قم باستخراج RLNs عن طريق نقل أقراص الجزر مع نخر الأنسجة المرئي في موقع التلقيح (الشكل 1) إلى غربال شبكي بقطر 8 سم و 75 ميكرومتر في وعاء زجاجي معقم. اترك فجوة صغيرة بحجم 1 سم بين قاع المنخل وتقعر الوعاء لجمع RLNs.
      ملاحظة: في حالة عدم وجود غربال تم الحصول عليه تجاريا ، يمكن صنع واحد من أنبوب بلاستيكي بقطر 8 سم / كوب بلاستيكي قوي وشاش شبكي محكم. استخدم الأربطة المطاطية لتثبيت الشاش في الأنبوب أو الكوب البلاستيكي.
    11. صب محلول مضاد حيوي في المنخل حتى يتم تغطية أقراص الجزر واحتفظ بها لمدة 12 ساعة (بين عشية وضحاها) في الظلام. تخرج RLNs من أقراص الجزر وتستقر في قاع الوعاء. يجب تحضير محلول المضادات الحيوية بشكل مؤقت مع الاستخراج بإضافة 50 ميكروغرام / مل لكل من الكاناميسين والكاربينيسيلين في الماء المقطرالمعقم 16.
      ملاحظة: يتم تحضير محاليل مخزون المضادات الحيوية عند 50 مجم / مل عن طريق إذابة 0.5 جم من أحادي كبريتات الكاناميسين أو 0.5 جم من كاربينيسلين ثنائي الصوديوم لكل منها في 10 مل من الماء المقطر المعقم. يتم ترشيح محاليل المخزون (شبكة 0.22 ميكرومتر) في غطاء التدفق ويمكن الاحتفاظ بها عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد.
    12. قم بإزالة المنخل ، واستخدم ماصة زجاجية معقمة لسحب RLNs من قاع الوعاء إلى كتلة تلطيخ زجاجية معقمة (4 سم × 4 سم × 1 سم) ، واغسلها عن طريق سحب 1 مل من محلول المضادات الحيوية. انتظر من 30 إلى 40 دقيقة حتى تستقر الديدان الخيطية قبل جمع محلول المضادات الحيوية المستخدم. كرر هذا الغسيل 4x-5x.
    13. استخدم المعلق المائي مع RLNs على الفور أو احتفظ به عند 11 درجة مئوية لفترة تخزين أطول (تصل إلى شهرين).
  2. عدوى نباتات البطاطس في الجسم الحي ب PPNs
    ملاحظة: لزراعة نباتات البطاطس الحساسة (S. tuberosum var. Désirée) ، يجب الحصول على بذور البطاطس المعتمدة من التجار الزراعيين بين يناير ومارس. اختر بذور البطاطس المعتمدة لأنها تباع بجواز سفر للصحة النباتية ، مما يضمن عدم ملوثتها بالطفيليات النباتية في الحجر الصحي. كإجراء احترازي ، يمكن إجراء خطوة أولية للتطهير بمحلول مبيض بنسبة 10٪ متبوعا بالغسيل بماء الصنبور الجاري لضمان تطهير سطح درنة البطاطس. لا ينصح باستخدام البطاطس التجارية الشائعة لأن العلاجات المفروضة لتقليل الإنبات والحيوية قد تتداخل مع نمو البطاطس والاستجابة للعدوى.
    1. اختر درنات البطاطس من نفس الحجم وتخلص من تلك التي بها ثقوب أو كدمات أو أقسام أكثر ليونة. قم بإزالة جميع البراعم المزروعة برفق (1 مم) قبل البذر لمزامنة الإنبات.
      ملحوظة: إذا لزم الأمر ، قم بتخزين بذور البطاطس في مكان جيد التهوية وجاف ومظلم قبل البذر.
    2. املأ أواني سعة 5 لتر (22 سم × 18 سم) بمزيج 1: 1 من التربة المعقمة والرمل الخشن الناعم الممزوج ب 22.5 جم من سماد NPK بطيء الإطلاق (12-12-12) وزرع البطاطس على عمق 9 سم تحت سطح التربة.
      ملاحظة: يجب غربلة التربة والرمل لإزالة الحطام الأكبر من 2 مم ، وتعقيمها 2x عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، وتجفيفها عند 100 درجة مئوية لمدة 1 إلى يومين ، مع الخلط المتكرر. قم بتهوية الأيام 7-10 التالية عن طريق الخلط بشكل متكرر قبل الاستخدام.
    3. احتفظ بالأواني في دفيئة في ظروف رطبة (رطوبة 50٪ -70٪) والماء بشكل متكرر (حافظ على التربة عند 70٪ من القدرة القصوى للاحتفاظ بالمياه) ، وتجنب درجات الحرارة القصوى ، حتى تبدأ براعم نبات البطاطس في الظهور على سطح التربة.
    4. بعد ظهور النبات ، استخدم معلقات RLN المستخرجة حديثا لإصابة جذور البطاطس. ابدأ بإنشاء 4 إلى 6 ثقوب موزعة بالتساوي (بعرض 1 سم) حول النبات إلى عمق البذور.
    5. قم بوضع معلق سعة 8 مل بالتساوي من 30,000 RLNs في مرحلة الحياة المختلطة الحية في الثقوب ، بحيث يكون اللقاح بنسبة 4 RLNs حية لكل غرام من خليط التربة ، وتغطيته بخليط التربة. بالنسبة للأواني التي تحتوي على RLNs ، امتنع عن الري في يوم التلقيح.
      ملاحظة: يتم حساب RLNs تحت مجهر مجسم (40x). الديدان الخيطية الميتة غير متحركة ولها شكل ممتد ، بينما تتحرك الديدان الخيطية الحية بشكل عام (شكل غير ممتد). يستخدم الحث الجسدي للتأكد من معدل الوفيات.
    6. احتفظ بالأواني لمدة شهرين في ظل الظروف الموضحة أعلاه (الشكل 2). بعد ذلك ، اقتلع نباتات البطاطس ووزن البراعم والجذور بشكل منفصل.
    7. اغسل نظام الجذر بعناية قبل التحقق من موقع مواقع هجوم RLN من خلال تقنيات التلوين5.

2. إنشاء مزارع مشتركة في المختبر لجذور البطاطس المعدلة وراثيا مع PPNs

  1. انشاء in vitro جذور البطاطس المعدلة وراثيا
    ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول ، استخدمنا Rhizobium rhizogenes تحمل gus جين المراسل مدمج في بلازميد Ri ومدفوع بمحفز 35S مزدوج (A4pRiA4:: 70GUS)17. يمكن الحصول على البكتيريا من مصادر تجارية أو طلبها من المختبرات المرجعية المعتمدة.
    1. للحصول على البكتيريا في مرحلة النمو الأسي ، انشر اللوحة R. rhizogenes في صفيحة متوسطة صلبة من Luria-Bertani (LB) 18 واحتفظ بها طوال الليل عند 26 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن الحصول على وسط LB تجاريا أو تحضيره في المختبر عن طريق إضافة 10 جم / لتر من البيبتون ، و 5 جم / لتر من مستخلص الخميرة ، و 10 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، و 15 جم / لتر من أجار ثم التعقيم بالبخار لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
    2. باستخدام حلقة التلقيح ، اختر مستعمرة وقم بتلقيح 10 مل من مرق LB السائل (وسط LB بدون أجار) في قارورة معقمة سعة 50 مل. يحفظ طوال الليل في الظلام عند 26 درجة مئوية تحت التحريك (180 دورة في الدقيقة).
    3. قم بقياس امتصاص المزرعة السائلة حتى يصل A600 إلى 0.6. في هذه المرحلة ، تكون البكتيريا في مرحلة النمو الأسي وتستخدم لتلقيح المواد النباتية.
    4. يتم إجراء التلقيح في درنات البطاطس الطازجة المعقمة. لتعقيم سطح درنات البطاطس ، ابدأ بالغسيل في ماء الصنبور الجاري لإزالة الحطام الأكبر ، ثم بمحلول منظف شائع (قطرة واحدة لكل 40 مل من الماء) ، مع تحريض قوي ، لإزالة الحطام الدقيق.
      ملاحظة: حدد مجموعة متنوعة من البطاطس ذات قابلية معروفة ل PPNs المستخدمة. في هذا البروتوكول ، استخدمنا S. tuberosum var. Désirée.
    5. ضع الدرنات في وعاء ، وقم بتغطيتها بمحلول مبيض تجاري (1: 4 ، مبيض تجاري في ماء الصنبور) وأغلقها. امزج لمدة 15 دقيقة ، وتخلص من محلول التبييض واشطفه 3 مرات بماء الصنبور المعقم.
    6. في غطاء التدفق ، اغمر الدرنات في محلول الإيثانول (80٪ ، حجم / حجم) لمدة 15 دقيقة مع تحريك قوي ، وتخلص من الإيثانول واشطفه 3 مرات بماء الصنبور المعقم.
    7. باستخدام مشرط معقم ، قم بإزالة الأجزاء الطرفية من الدرنات (حوالي 50٪ من الدرنة من السطح إلى الداخل) ، وقم بتقسيم القطعة المركزية الداخلية إلى شرائح بسمك 0.5 سم19. قم بالتلقيح على الفور باستخدام المعلق البكتيري المحضر في الخطوة 2.1.3.
    8. للتلقيح ، قم بتخفيف المعلق البكتيري بإضافة 1 مل من المعلق البكتيري إلى 9 مل من وسط Schenk و Hildebrandt20 (SH) المكمل ب 30 جم / لتر من السكروز عند الرقم الهيدروجيني = 5.6. اغمس طرف مشرط معقم في المعلق المخفف وجرح سطح قطعة البطاطس. كرر هذه الخطوة 5 مرات لكل قطعة بطاطس.
    9. جفف أجزاء الرطوبة الزائدة في ورق ترشيح معقم لمدة دقيقة واحدة ، وضعها في وسط SH شبه صلب (وسط SH مع 30 جم / لتر من السكروز ، 8 جم / لتر أجار ، الرقم الهيدروجيني = 5.6) واحتفظ بها في الظلام عند 25 درجة مئوية حتى يحدث تعداء البلازميد.
    10. بعد 3 أيام ، قم بنقل الأجزاء المصابة إلى صفائح من وسط SH شبه صلب مكمل ب 150 ميكروغرام / مل من كل من سيفوتكشيم المضاد الحيوي والكاربينيسيلين. احتفظ بها لأكثر من 3 أشهر مع التجديد المتوسط الأسبوعي لضمان القضاء على البكتيريا.
      ملاحظة: يمكن تحضير محلول مخزون Cefotaxime عند 100 مجم / مل عن طريق إذابة 1 جم من الصوديوم السيفوتاكسيم في 10 مل من الماء المعقم منزوع المعادن والترشيح (شبكة 0.22 ميكرومتر) تحت غطاء التدفق. يمكن الاحتفاظ بالمضادات الحيوية عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
    11. بعد 3 أشهر ، يكون نمو الجذور المعدلة وراثيا واسع النطاق. انقل الجذور إلى وسط SH جديد وشبه صلب بدون مضادات حيوية عن طريق جمع كتلة جذر 1 جم بأطراف ملاقط معقمة ووضعها في وسط وسط الاستزراع في طبق جديد (الشكل 3).
      ملاحظة: بعد شهر واحد تقريبا من الإصابة ، تظهر كتل صغيرة من نمو الخلايا في سطح جزء البطاطس ، حيث تبدأ الجذور المعدلة وراثيا في التطور6. تأكد من إبقائهم على اتصال بوسط الثقافة وإلا فقد يجفوا.
    12. لضمان الاستقرار الجيني والتمثيلي ، حافظ على الجذور المعدلة وراثيا تحت روتين استزراع فرعي شهري (كما هو موضح في الخطوة 2.1.11.) عند 25 درجة مئوية في الظلام لأكثر من عام واحد قبل الإصابة ب PPNs.
      ملاحظة: تأكد من الاحتفاظ بستة مكررات على الأقل في كل خطوة من خطوات البروتوكول نظرا لحدوث تلوث ميكروبي غير مرغوب فيه في كثير من الأحيان. بمجرد إنشائها ، يمكن استخدام لوحة واحدة للزراعة المشتركة كلقاح للعديد من الثقافات المشتركة الجديدة. ومع ذلك ، تأكد من الاحتفاظ بستة لوحات مكررة على الأقل.
  2. إنشاء مزارع مشتركة في المختبر لجذور البطاطس المعدلة وراثيا باستخدام PPNs
    ملاحظة: للحصول على الثقافات المشتركة للجذور المعدلة وراثيا مع PPNs ، تعد عملية تعقيم الديدان الخيطية أمرا بالغ الأهمية. بالنسبة للبروتوكول الحالي ، استخدمنا المرحلة الثانية من ديدان النيماتودا ذات العقدة الجذرية الحجر الصحي Meloidogyne chitwoodi. يمكن الحصول على لقاح الديدان الخيطية من المختبرات المرجعية المعتمدة على شكل كرات الجذر.
    1. تحت مجهر مجهر مجهر (20x) ، قم بعزل كتل بيض الديدان الخيطية من كرات الجذر باستخدام ملاقط معقمة فائقة النعومة. ضع كتل البيض في طبق بتري مغطى مع 5 مل من ماء الصنبور المعقم واترك البيض يفقس لمدة 48 ساعة. اضبط تعليق J2 على 100 ديدان خيطية لكل مل.
    2. في غطاء التدفق، ضع الماصة سعة 5 مل من المعلق الذي يحتوي على 500 J2 في منخل معقم شبكي معقم بحجم 20 ميكرومتر وغسلها بماء الصنبور المعقم.
    3. اغمر النصف السفلي من المنخل الذي يحتوي على J2s في محلول بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 20٪ (H2O2) ، واخلطه يدويا بحركة دائرية لمدة 15 دقيقة.
    4. اغسل J2s المعقمة عن طريق توزيع ماء الصنبور المعقم من خلال المنخل. كرر هذه الخطوة 3x. في الغسيل النهائي ، قم بإمالة المنخل بحيث تتجمع الديدان الخيطية عند حدود الغربال. استرجع تعليق الديدان الخيطية المعقمة عن طريق سحب 1 مل من الماء المعقم فائق النقاء في حدود الغربال ، وتخزينه في 11 درجة مئوية أو استخدمه على الفور.
      ملاحظة: يمكن تقييم نجاح التعقيم عن طريق طلاء 100 ميكرولتر من تعليق الديدان الخيطية في وسط SH والمراقبة المنتظمة ، لمدة أسبوع واحد ، للتلوث.
    5. في غطاء التدفق ، استزراع كتلة 1 جم من الجذور المعدلة وراثيا للبطاطس (كما هو موضح في الخطوة 2.1.11.) على ألواح SH مع 100 ديدان خيطية معقمة (100 ميكرولتر من المعلق مع 1000 J2s لكل مل). بعد 2 إلى 3 أسابيع ، تبدأ الكرات الصغيرة في الظهور في الجذور الجديدة.
    6. اتبع الزراعة المشتركة بانتظام تحت المجهر المقلوب (100x) ، وعندما تبدأ كتل البيض في أن تكون ملحوظة ، قم بالزراعة الفرعية إلى صفيحة متوسطة SH شبه صلبة جديدة ، مع التأكد من أخذ الكرات مع كتلة الجذر (الشكل 4). حافظ على الثقافات المشتركة في روتين استزراع فرعي شهري عند 25 درجة مئوية في الظلام.

3. التحليل الهيكلي لعدوى PPNs

ملاحظة: لمتابعة التغييرات التي تسببها PPNs في بنية أنسجة الجذر ، يتم استخدام تقنيات التلوين الكيميائي النسيجي لتباين الأنسجة ذات التركيبات الكيميائية المختلفة. يتم إجراء التلوين التفاضلي في كتل الجذور أو في الأجزاء الرقيقة من مادة الجذر الثابتة ، حيث تتفاعل أصباغ معينة مع الأنسجة المستهدفة وفقا لتقاربها الكيميائي21. بالنسبة للبروتوكول الحالي ، استخدمنا حمض الفوشين ، أو كاشف حمض شيف الدوري (PAS) جنبا إلى جنب مع أصباغ التولودين الزرقاء O للتلوين التفاضلي.

  1. توزيع الديدان الخيطية الطفيلية النباتية في الجذور الملطخة بحمض الفوشين
    ملاحظة: لمتابعة توزيع PPNs في جميع أنحاء نظام الجذر ، يتم استخدام الفوشين الحمضي لتلطيخ أنسجة عضلة الديدان الخيطية بلون أحمر5.
    1. ابدأ بغسل نظام الجذر تحت ماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق لإزالة أي بقايا تربة (في الجسم الحي جذور النباتات) أو بقايا وسط الاستزراع (في المختبر الجذور المعدلة وراثيا). استخدم أصابعك بحركة دائرية للمساعدة في فصل التربة عن نظام الجذر.
    2. قطع نظام الجذر إلى أقسام بطول 1 إلى 2 سم وضعها داخل دورق 150 مل. ضعي 70 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم 1.5٪ (NaOCl) واخلطيهم بقوة لمدة 4 دقائق لتنظيف أنسجة الجذر. بعد ذلك ، تخلص من محلول NaOCl ، واشطف الجذور في ماء الصنبور الجاري ، وانقعها لمدة 15 دقيقة في ماء منزوع المعادن لإزالة بقايا NaOCl22.
      ملاحظة: يحتوي مبيض الكلور على 5.25٪ على الأقل من NaOCl ، لذا أضف 20 مل من مبيض الكلور إلى 50 مل من الماء للحصول على محلول NaOCl بنسبة 1.5٪. بالنسبة للمواد الأكثر نعومة (على سبيل المثال ، الأنسجة اللينة للجذور الصغيرة أو الجذور المعدلة وراثيا المزروعة في المختبر ) استخدم محلول NaOCl بنسبة 0.9٪ ، بينما بالنسبة للمواد الأكثر صلابة (الجذور الخشبية القديمة) يتم استخدام محلول NaOCl بنسبة 2.0٪.
    3. صفي الجذور التي تم تطهيرها وضعيها على دورق زجاجي من البورسليكات مع 30 مل من الماء منزوع المعادن. ماصة 1 مل من محلول صبغة الفوشين الحمضي ، تخلط يدويا وتغلي لمدة 30 ثانية على طبق ساخن. دع الدورق الزجاجي يبرد ، واستنزاف المحلول واغسل الجذور الملطخة بماء الصنبور الجاري.
      ملاحظة: يتكون محلول صبغة الفوشين الحمضي عن طريق إذابة 3.5 جم من مسحوق صبغة الفوشين الحمضي في 250 مل من حمض الأسيتيك وإضافة 750 مل من الماء منزوع المعادن. يتبع التلوين دائما خطوة إزالة البقع لإزالة البقع الزائدة غير المستخدمة وتعزيز تباين العينات.
    4. قم بإضافة 10-30 مل من الجلسرين المحمض ببضع قطرات من حمض الهيدروكلوريك (5N) 13.
    5. راقب تحت المجهر المجسم أو المجهر المقلوب لتقييم المكان الذي تهاجم فيه PPNs بشكل تفضيلي في بنية الجذر (الشكل 5 والشكل 6).
  2. تقييم مورفولوجيا الخلايا الجذرية باستخدام حمض شيف الدوري (PAS) / تولويدين الأزرق O
    ملاحظة: يمكن تقييم تأثير عدوى PPNs أو تلف مورفولوجيا الخلايا الجذرية تحت المجهر عن طريق تثبيت جذور البطاطس المصابة وتقسيمها وتلوينها بشكل تفاضلي.
    1. في قارورة عينة مغلقة ، قم بإصلاح مادة الجذر الطازجة مع 2.5٪ جلوتارالديهايد ، المحضرة في محلول فوسفات الصوديوم 0.1 M ، عند درجة الحموضة 7.2 ، لمدة 24-48 ساعة ، في درجة حرارةالغرفة 6.
      تنبيه: الجلوتارالديهايد سام. تجنب الاستنشاق والاتصال. استخدم معطف المختبر الواقي والقفازات واعمل في غطاء الدخان. يجب إغلاق قوارير العينة ما لم يتم شطفها أو في إجراءات التفريغ. تخلص من الجلوتارالديهايد باتباع قواعد إجراءات النفايات الخطرة. يتم تنفيذ الخطوات من 3.2.1 إلى 3.2.5 في غطاء الدخان لتجنب استنشاق الكواشف.
      ملاحظة: لتحضير 1 لتر من محلول فوسفات الصوديوم ، درجة الحموضة 7.2 ، أضف 68.4 مل من 1M Na2HPO4 (141.96 جم في محلول 1 لتر) إلى 31.6 مل من 1M NaH2PO4 (119.98 جم في محلول 1 لتر) واملأ ما يصل إلى 1 لتر بإضافة 900 مل من الماء منزوع المعادن. للمساعدة في تسلل المثبت ، ضع قوارير العينة غير المغطى بمادة الجذر تحت فراغ منخفض (26 مم زئبق) لمدة دقيقتين في مجفف متصل بمضخة تفريغ.
    2. باستخدام ماصة باستور الزجاجية، تخلص من محلول التثبيت واغسل الجذور الثابتة بمحلول فوسفات الصوديوم (3x).
    3. ابدأ في تجفيف أنسجة الجذر المثبتة تدريجيا عن طريق استبدال المخزن المؤقت بمحلول إيثانول بنسبة 10٪ (حجم / حجم) لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، استبدل بمحلول إيثانول بنسبة 20٪ باستخدام ماصة زجاجية ، واحتفظ بالجذور مغروسة لمدة 15 دقيقة. استمر في التتابع المتدرج لزيادة تركيزات الإيثانول (30٪ ، 40٪ ، 50٪ ، 60٪ ، 70٪ ، 80٪ و 90٪ لمدة 15 دقيقة لكل منهما) حتى خطوة الإيثانول النقي ، حيث يجب الاحتفاظ بالجذور لمدة 1 ساعة.
    4. قم بتضمين الجذور المجففة تدريجيا في الراتنج (2-هيدروكسي إيثيل ميثاكريلات). باستخدام ماصة زجاجية، استبدل الإيثانول النقي بمحلول إيثانول/راتنج 3:1 (حجم/حجم) واحتفظ به لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية. اتبع ذلك مع محاليل الإيثانول / الراتنج 1: 1 و 1: 3 (v / v) ، لكل منها فترة حضانة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، استبدل محلول 1: 3 (حجم / حجم) براتنج نقي مكمل ببيروكسيد ثنائي بنزويل (1٪) كبادئ بلمرة.
    5. ضع العينات في صينية قالب من الراتنج ، وأضف الراتنج: خليط ثنائي ميثيل سلفوكسيد 15: 1 (V / v) ، واحتفظ به عند 60 درجة مئوية فوق لوح ساخن لمدة 48 ساعة حتى يتصلب الراتنج.
    6. ضع العينات المشبعة في ميكروتوم دوار مزود بسكين تنجستن وقم بتقطيع أقسام 2-5 ميكرومتر على شرائح زجاجية ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    7. ابدأ التلوين التفاضلي عن طريق غمر الشرائح لمدة 10 دقائق في وعاء تلطيخ زجاجي بمحلول 15٪ 2,4-dinitrophenylhydrazine في حمض الأسيتيك ، في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسلها بعناية تحت ماء الصنبور الجاري لمدة 15 دقيقة وجففها في فرن على حرارة 60 درجة مئوية (15 دقيقة).
    8. بعد ذلك ، اغمر الشرائح في حمض دوري (1٪) لمدة 10 دقائق ، ثم اغسلها تحت ماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق واتركها لتجف في فرن على حرارة 60 درجة مئوية (15 دقيقة).
    9. اغمر الشرائح في كاشف شيف (يتكون من 1٪ باراروزانيلين و 4٪ ميتابيسلفيت الصوديوم ، في 0.25 م حمض الهيدروكلوريك) ، لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، يغسل بمحلول ميتابيسلفيت الصوديوم (0.5٪) في حمض الهيدروكلوريك (0.05 م) ، لمدة دقيقتين. أخيرا ، اغسلها بماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق ، وجففها في درجة حرارة الغرفة.
    10. على النقيض من ذلك ، قم بغمر الشرائح في 0.05٪ تولويدين أزرق O لمدة 15 دقيقة ، وغسلها بماء الصنبور الجاري لمدة 15 دقيقة وتجفيفها في فرن على حرارة 60 درجة مئوية (15 دقيقة).
    11. راقب تحت المجهر (100x) مزود بأجهزة التقاط الصور (الشكل 7).

النتائج

يمكن استخدام أقراص الجزر لتكاثر والحفاظ على عدة أنواع من PPNs المهاجرة23. بالنسبة ل RLN ، تستخدم هذه التقنية بشكل عام للحفاظ على مجموعات مرجعية لأنواع الديدان الخيطية أو العزلات. باستخدام أقراص الجزر ، يمكن الحصول على زيادة متوسطة قدرها 100 مرة في أعداد الديدان ا?...

Discussion

من الصعب دراسة آليات العدوى وتطور المرض في النباتات التي تهاجمها PPNs التي تعيش في التربة لأن هذه الطفيليات النباتية تصيب عموما الأنسجة الداخلية لنظام الجذر وتسبب أعراضا غير محددة في البراعم. على الرغم من الظروف البيئية الخاضعة للرقابة في الدفيئة ، لا تزال درنات البطاطس ?...

Disclosures

ليس لدينا ما نفصح عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث جزئيا من قبل Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) ، من خلال المنح NemACT ، DOI: 10.54499 / 2022.00359.CEECIND / CP1737 / CT0002 (JMSF) ، CEECIND / 00040 / 2018 ، DOI: 10.54499 / CEECIND / 00040/2018 / CP1560 / CT0001 (CSLV) و SFRH / BD / 134201/2017 (PB) ؛ مشروع PratyOmics ، DOI: 10.54499 / PTDC / ASP-PLA / 0197/2020 ؛ والتمويل الهيكلي UIDB/00329/2020 | cE3c (DOI: 10.54499/UIDB/00329/2020) + LA/P/0121/2020 |التغيير (DOI: 10.54499 / LA / P / 0121/2020) ، و GreenIT (DOI: 10.54499 / UIDB / 04551 / 2020 و DOI: 10.54499 / UIDP / 04551 / 2020) ..

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2,4-DinitrophenylhydrazineSigma-AldrichD199303
2-Hydroxyethyl methacrylateSigma-Aldrich17348
Acetic acidSigma-Aldrich695092
Acid FuchsinSigma-AldrichF8129
Benzoyl peroxideSigma-AldrichB5907
borosilicate glass beaker Sigma-AldrichZ231827
Carbenicillin disodium saltSigma-AldrichC3416
Cefotaxime sodium saltSigma-AldrichC7039
Dimethyl sulfoxideSigma-Aldrich472301
Ethanol Supelco1.00983
FertilizerCompo Expert
Flower pot 5 LVWR470049-676
GlutaraldehydeSigma-Aldrich354400
GlycerolSigma-AldrichG7893
Hydrochloric acidSigma-Aldrich258148
Kanamycin monosulfateSigma-AldrichBP861
LB Broth with agarSigma-AldrichL3147
MCE syringe filterMilliporeSLGSR33SS
PARAFILM M sealing filmBRANDHS234526B-1EA
Pararosaniline hydrochlorideSigma-AldrichP3750
Periodic acidSigma-AldrichP0430
Phyto agarDuchefa BiochemieP1003
Scalpel blade no. 24Romed HollandBLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt mediumDuchefa BiochemieS0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixtureDuchefa BiochemieS0411
Schiff′s reagentSigma-Aldrich1.09033
Sodium metabisulfiteSigma-Aldrich161519
Sodium phosphate dibasicSigma-AldrichS9763
Sodium phosphate monobasicSigma-AldrichS5011
Soil / SubstrateCompo Sana
Stainless Steel TweezersSigma-Aldrich22435-U
SucroseDuchefa BiochemieS0809
Toluidine Blue OSigma-Aldrich198161

References

  1. Çalışkan, M. E., Yousaf, M. F., Yavuz, C., Zia, M. A. B., Çalışkan, S. History, production, current trends, and future prospects. Potato Production Worldwide. , 1-18 (2022).
  2. Barker, K. R., Koenning, S. R. Developing sustainable systems for nematode management. Ann Rev Phytopathol. 36 (1), 165-205 (1998).
  3. Jones, J. T., et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol. 14 (9), 946-961 (2013).
  4. Davis, E. L., Hussey, R. S., Baum, T. J. Getting to the roots of parasitism by nematodes. Trend Parasitol. 20 (3), 134-141 (2004).
  5. Figueiredo, J., Vieira, P., Abrantes, I., Esteves, I. Commercial potato cultivars exhibit distinct susceptibility to the root lesion nematode Pratylenchus penetrans. Horticulturae. 8 (3), 244 (2022).
  6. Faria, J. M. S., et al. In vitro co-culture of Solanum tuberosum hairy roots with Meloidogyne chitwoodi: Structure, growth and production of volatiles. Plant Cell Tissue Organ Culture. 118 (3), 519-530 (2014).
  7. Wesemael, W. M. L., Moens, M., Viaene, N., Taning, L. M. Life cycle and damage of the root-knot nematode Meloidogyne minor on potato, Solanum tuberosum. Nematology. 16 (2), 185-192 (2014).
  8. Subramanian, P., et al. Differential metabolic profiles during the developmental stages of plant-parasitic nematode Meloidogyne incognita. Int J Mol Sci. 18 (7), 1351 (2017).
  9. Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-A versatile tool with multiple applications. Front Plant Sci. 11, 33 (2020).
  10. Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta. 210 (2), 195-204 (2000).
  11. Young, J. M., Kuykendall, L. D., Martínez-Romero, E., Kerr, A., Sawada, H., et al. A revision of Rhizobium Frank 1889, with an emended description of the genus, and the inclusion of all species of Agrobacterium Conn 1942 and Allorhizobium undicola de Lajudie et al. 1998 as new combinations: Rhizobium radiobacter, R. rhizogenes, R. rubi, R. undicola and R. vitis. Int J Syst Evol Microbiol. 51 (1), 89-103 (2001).
  12. Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnol Adv. 18 (1), 1-22 (2000).
  13. Faria, J. M. S., Rusinque, L., Cavaco, T., Nunes, J. C., Inácio, M. L. Essential oil volatiles as sustainable antagonists for the root-knot nematode Meloidogyne ethiopica. Sustainability. 15 (14), 11421 (2023).
  14. European Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). PM 7/148 (1) Guidelines for the management of nematode collections used for the production and maintenance of reference material. EPPO Bulletin. 51 (3), 507-548 (2021).
  15. Boisseau, M., Sarah, J. L. In vitro rearing of Pratylenchidae nematodes on carrot discs. Fruits. 63 (5), 307-310 (2008).
  16. Barbosa, P., et al. Nematicidal activity of phytochemicals against the root-lesion nematode Pratylenchus penetrans. Plants. 13 (5), 726 (2024).
  17. Santos, P. M., et al. Essential oils from hairy root cultures and from fruits and roots of Pimpinella anisum. Phytochemistry. 48 (3), 455-460 (1998).
  18. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. J Bacteriol. 62 (3), 293-300 (1951).
  19. Kumar, A., Forrest, J. M. Reproduction of Globodera rostochiensis on transformed roots of Solanum tuberosum cv. Desiree. J Nematol. 22 (3), 395-398 (1990).
  20. Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Canadian J Botany. 50 (1), 199-204 (1972).
  21. Figueiredo, A. C. S., Barroso, J. M. G., Pedro, L. M. G., Ascensão, L. . Histoquímica e citoquímica em plantas: princípios e protocolos. Universidade de Lisboa. , (2007).
  22. Bybd, D. W., Kirkpatrick, T., Barker, K. R. An improved technique for clearing and staining plant tissues for detection of nematodes. J Nematol. 15 (1), 142-143 (1983).
  23. Coyne, D., Adewuyi, O., Mbiru, E. . Protocol for in vitro culturing of lesion nematodes: Radopholus similis and Pratylenchus spp. on carrot disc. , (2014).
  24. Faria, J. M. S., Vicente, C. S. L., Rusinque, L., Camacho, M. J., Inácio, M. L. Plant-Nematode co-cultures in the screening of sustainable nematicides against soil-dweling parasitic nematodes of plants. Revista de Ciências Agrárias. 45 (4), 436-439 (2022).
  25. Faria, J. M. S., et al. In vitro co-cultures of Pinus pinaster with Bursaphelenchus xylophilus: a biotechnological approach to study pine wilt disease. Planta. 241 (6), 1325-1336 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

PPNs PAS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved