In vivo und in vitro Infektion von Kartoffelwurzeln mit pflanzenparasitären Nematoden zur Beurteilung induzierter Strukturveränderungen

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt die Infektion der Wurzeln von Solanum tuberosum mit pflanzenparasitären Nematoden unter in vivo Gewächshausbedingungen und von in vitro transgenen Wurzeln von Kartoffeln für die histochemische Analyse der Wurzelstruktur durch optische Mikroskopie.

Zusammenfassung

Bodenbewohnende pflanzenparasitäre Nematoden (PPNs) sind wichtige Kartoffelschädlinge, die Läsionen verursachen und/oder die Wurzelstruktur der Pflanzen verändern, was zu einer verminderten Fitness und Produktivität der Pflanzen führt. Die Erforschung der zellulären und subzellulären Mechanismen der Infektion und Entwicklung von PPN kann auf Feldpflanzen oder Sämlinge unter Gewächshausbedingungen zurückgegriffen werden. Feldstudien sind repräsentativer für natürliche Umgebungen, unterliegen jedoch der Unvorhersehbarkeit von Umweltbedingungen, die die Forschungsergebnisse stark beeinflussen können. Gewächshausstudien ermöglichen eine bessere Kontrolle über Umweltvariablen und eine höhere Sicherheit gegen Kontaminanten oder Krankheitserreger. Bei einigen Wirten wird die genetische Vielfalt jedoch zu einem wichtigen Faktor der Variabilität und beeinflusst die Reaktion des Wirt-Parasiten-Komplexes. Wir haben in vitro Co-Kulturen von transgenen Wurzeln mit PPNs als zuverlässige Alternative entwickelt, die weniger Platz benötigt, weniger Zeit für die Gewinnung benötigt und frei von Kontamination oder genetischer Variabilität des Wirts ist. Co-Kulturen werden durch die Einführung aseptischer PPNs erhalten, um in vitro transgene Wurzeln zu beherbergen. Sie können unbegrenzt gewartet werden, was sie zu einer hervorragenden Unterstützung für die Aufbewahrung von Sammlungen von Referenz-PPNs macht. In der vorliegenden Arbeit wird ein Protokoll für die kontrollierte Infektion von in vivo Kartoffelwurzeln mit dem Wurzelläsionsnematoden und für die Etablierung von in vitro Co-Kulturen von transgenen Kartoffelwurzeln mit dem Wurzelknotennematoden detailliert beschrieben. Die In-vitro-Cokulturen lieferten einen Labor-Proxy für den natürlichen Zustand der Kartoffelinfektion und produzierten unabhängig von der Jahreszeit oder den klimatischen Bedingungen Lebensstadien der Nematoden. Darüber hinaus wird die für die Strukturanalyse verwendete Methodik mit Hilfe von Histochemie und optischer Mikroskopie detailliert. Der saure Fuchsin-Farbstoff wird verwendet, um Nematoden-Angriffsstellen an Wurzeln zu verfolgen, während die differentielle Färbung mit periodischem Säure-Schiff (PAS) und Toluidinblau O Nematodenstrukturen im inneren Wurzelgewebe der Kartoffel hervorhebt.

Einleitung

Wurzel- und Knollenfrüchte rangieren auf^Platz 4 der weltweit wichtigsten Grundnahrungsmittel. Die Kartoffel (Solanum tuberosum L.) ist eine der wichtigsten Kulturknollen. Er hat seinen Ursprung in den Anden Südamerikas, wurde aber nach seiner Einführung in Europa im 16^{. Jahrhundert schnell} zur häufigsten Nahrungsquelle für die Bevölkerung mit geringerem Einkommen. Heute machen Kartoffeln 1,7 % der weltweiten Kalorienaufnahme^{aus 1}. Die Pflanzenproduktion wird stark von Pflanzenschädlingen und Krankheitserregern beeinflusst, von denen pflanzenparasitäre Nematoden (PPNs) durchschnittliche Ertragsverluste von bis zu 12 %² verursachen können. Pflanzenparasitäre Nematoden sind für einige der schädlichsten Krankheiten für Nutzpflanzen in der modernen Landwirtschaft verantwortlich. Bodenbewohnende PPN verursachen für die Landwirte hohe Verluste, da sie die Pflanzenwurzeln beeinträchtigen und die Pflanzenproduktivität beeinträchtigen, indem sie die Produktion verringern und/oder Produkte schädigen und sie unverkäuflich machen³. Diese gefährlichen Phytoparasiten verwenden ihr Mandrint (ein nadelartiges Mundwerkzeug), um Wurzelzellen zu durchstechen und sich von Zellinhalt zu ernähren. Einige PPNs fressen von außerhalb der Wurzeln, andere dringen in die Wurzel ein und verursachen Gewebeschäden (wandern), während andere in die Wurzeln eindringen und sesshaft werden, wodurch sich die Wurzelstruktur stark verändert, um die Nahrungsaufnahme zu erleichtern⁴. Die wichtigsten PPNs, die die Kartoffel betreffen, sind die Kartoffelzystennematoden, Globodera spp., Wurzelknotennematoden (RKN), Meloidogyne spp., Wurzelläsionsnematoden, Pratylenchus spp., der Falsche Wurzelknotennematode Nacobbus aberrans und der Kartoffelfäule-Nematode Ditylenchus destructor. Bei diesen PPNs führen unterschiedliche Ernährungsgewohnheiten zu unterschiedlichen strukturellen Veränderungen im Wirtswurzelgewebe ^5,6. Die Erforschung der Mechanismen der PPN-Infektion und der Wirtsreaktion wird häufig durch Feld- oder Gewächshausversuche durchgeführt, um Referenz-PPN-Kultursammlungen zu pflegen oder groß angelegte Experimente durchzuführen ^7,8. Die Prüfung unter natürlichen Bedingungen wird stark von Umweltschwankungen und biotischen oder abiotischen Stressfaktoren beeinflusst. Gewächshaus-Bioassays sind eine engere Alternative zu einem natürlichen Zustand, ermöglichen gleichzeitig eine relative Kontrolle der Umweltvariation und begrenzen den Einfluss von abiotischem und biotischem Stress. Die genetische Vielfalt des Wirts kann jedoch immer noch eine Herausforderung für Studien darstellen, die eine genauere Kontrolle der biologischen Variabilität erfordern. Diese Einschränkungen können durch den Rückgriff auf in vitro Pflanzengewebekulturen überwunden werden. Dabei handelt es sich um vielseitige Laborsysteme mit vielen Vorteilen für die PPN-Krankheitsforschung. Für bodenbewohnende PPN sind In-vitro-Kulturen transgener Wurzeln ein nützliches Werkzeug für die Forschung unter Laborbedingungen ^9,10.

Transgene Wurzeln oder Haarwurzeln (HR) werden nach Infektion von Pflanzenmaterial mit Rhizobium rhizogenes erhalten (Riker et al. 1930) Young et al. 2001¹¹. Dieses gramnegative Bakterium induziert die Transfektion seines Ri-Plasmids in das Wirtsgenom und verändert die Regulation der Biosynthese von Pflanzenhormonen, wodurch die Bildung von Wurzelgewebe gefördert^{wird 12}. Transgene Wurzeln können auf unbestimmte Zeit unter Asepsis in einem Nährmedium aufbewahrt werden. Die Vorteile der Verwendung von HR zur Untersuchung von PPNs sind eine hohe Wachstumsrate ohne Pflanzenwachstumsregulatoren, die die Nematodeninfektion und -entwicklung beeinflussen, ein hohes Verhältnis der Biomasseproduktion pro Zeiteinheit sowie die zelluläre Integrität und Langlebigkeit, die eine höhere genetische und biochemische Stabilität bestimmen⁶. Durch den Rückgriff auf transgene In-vitro-Wurzeln können PPN-Genotypen unter Laborbedingungen unbegrenzt erhalten werden, Infektionen und PPN-Entwicklung können leicht verfolgt werden, die genetische Variabilität des Wirts kann reduziert werden, die Manipulation der molekularen Zusammensetzung des Wirts kann direkt mit der Nematodenreaktion in Verbindung gebracht werden, und strukturelle Veränderungen von Wirt und Parasit können genauer verfolgt werden ^6,13. Für Studien zu PPN-Erkrankungen von Kartoffeln ermöglichen in vitro transgene Wurzel-Cokulturen die Durchführung von Experimenten unabhängig von der Jahreszeit oder der Kartoffelknollen-Ruhephase.

In diesem Protokoll wird die traditionelle Methodik der Aufrechterhaltung von PPNs und der In-vivo-Infektion von Kartoffelpflanzen detailliert beschrieben. Für die Strukturanalyse infizierter Wurzeln wird auch eine verbesserte Methodik auf der Grundlage der Etablierung von in vitro Co-Kulturen transgener Kartoffelwurzeln mit PPNs als Alternative beschrieben, die eine bessere Kontrolle der genetischen Variabilität von Umwelt und Wirt ermöglicht. Um die Infektion und Entwicklung von PPN im Wurzelgewebe zu verfolgen, wird die Histochemie eingesetzt, um die Beobachtung von PPNs unter optischer Mikroskopie zu unterstützen. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Untersuchung von PPN-Wirt-Interaktionen zu optimieren, um kontrolliertere und reproduzierbarere Bedingungen für Experimente zu gewährleisten und gleichzeitig detaillierte Struktur- und Entwicklungsanalysen von Nematoden im Wurzelgewebe zu ermöglichen.

Protokoll

1. Infektion von im Gewächshaus angebauten Kartoffelpflanzen

HINWEIS: Gewächshausversuche werden mit Suspensionen von PPN in gemischten Lebensstadien oder Jungtieren im zweiten Stadium (J2) durchgeführt, abhängig vom spezifischen Lebenszyklus des PPN-Schädlings. Für dieses Protokoll wurden Suspensionen von gemischten Lebensstadien des Wurzelläsionsnematoden (RLN) Pratylenchus penetrans verwendet. PPNs können entweder im Labor gezüchtet oder bei zertifizierten Referenzlabors angefordert werden.

1. Vermehrung und Erhaltung von Nematoden mit Wurzelläsionen
   HINWEIS: Sterilisierte Karottenscheiben werden für die Vermehrung und Aufrechterhaltung von RLNs verwendet¹⁴. Verwenden Sie kommerziell erworbene Karotten (var. Nizza) ohne sichtbare Schäden, um die mikrobielle Kontamination zu reduzieren. Vorzugsweise sollten sie frei von Pestiziden sein, um die Entwicklung von RLN nicht zu behindern.
   1. Waschen Sie die Karotte unter fließendem Leitungswasser, um größere Ablagerungen zu entfernen, und anschließend mit einer üblichen Waschmittellösung (1 Tropfen pro 40 ml Wasser), um feinere Ablagerungen zu entfernen. Mit Laborpapiertüchern trocknen.
   2. Führen Sie unter Asepsis in einer Haube mit vertikalem Durchfluss einen sterilisierten Metallspieß auf die Oberseite der Karotte (1 bis 2 cm nach innen), damit sie leichter gehalten werden kann.
   3. Befeuchten Sie die Karotte mit Hilfe einer Waschflasche mit Düse mit 96% (v/v) Ethanol. Tupfen Sie die untere Spitze der Karotte in ein sterilisiertes Filterpapier und bringen Sie sie vorsichtig zur Flamme.
      ACHTUNG: Seien Sie sich bewusst, dass sich Ethanol stark entzündet, also stellen Sie sich in einiger Entfernung auf.
   4. Schälen Sie die Karotte mit einem sterilen Sparschäler von oben nach unten und wiederholen Sie dann den vorherigen Schritt. Den oberen und unteren Teil (2 cm nach innen) entsorgen und den mittleren Teil der Karotte in eine sterile Petrischale (150 mm Durchmesser) legen. Schneiden Sie mit einer sterilen Klinge und einer Pinzette vorsichtig 1 cm dicke Abschnitte aus dem etwa 2 cm großen Teil der Karotte ab (Abbildung 1).
   5. Übertragen Sie die Schnitte in sterile Petrischalen (60 mm Durchmesser) und versiegeln Sie den Rand mit Klarsichtfolie. Mit einem UV-Licht die Oberfläche der Karottenscheiben auf jeder Seite 60 Minuten lang sterilisieren.
   6. Bei 25 °C 1-2 Wochen im Dunkeln aufbewahren und Karottenscheiben entsorgen, die Anzeichen einer mikrobiellen Kontamination zeigen¹⁵.
      HINWEIS: Sichtbare Anzeichen einer Kontamination sind übermäßige Bräunung (Fäulnis), Flüssigkeitsansammlungen am unteren Rand der Karottenscheibe oder Pilzmyzelwachstum auf der Oberfläche.
   7. Die verbleibenden Karottenscheiben sind bereit, mit RLN-Suspensionen infiziert zu werden. Beginne damit, mit einer sterilen Klinge einen X-förmigen Schnitt in der Mitte der Karottenscheibe zu machen. Achten Sie darauf, nur halb tief zu schneiden.
   8. Beimpfen Sie das RLN durch Pipettieren von 50 μl einer Suspension, die mindestens 50 gemischte Lebensstadien enthält, in der Mitte der X-förmigen Wunde. Verschließen Sie die Petrischale und versiegeln Sie den Rand mit einer Klarsichtfolie, um ein Austrocknen zu vermeiden.
      1. Bestimmen Sie die durchschnittliche Anzahl von Nematoden in der Suspension, indem Sie fünf 50-μl-Aliquoten unter einem binokularen Stereomikroskop (40x) bei Raumtemperatur in einem konkaven Objektträger zählen. Stellen Sie die Suspension von gemischten RLNs im Lebensstadium auf 1000 pro ml ein, indem Sie der Suspension Wasser zusetzen oder warten, bis sich Nematoden abgesetzt haben (ca. 60 Minuten), und das Volumen durch Dekantieren des Oberflächenwassers verringern.
   9. Halten Sie die Karottenscheiben bis zu 3 Monate lang bei 25 °C im Dunkeln und überwachen Sie sie wöchentlich unter einem binokularen Stereomikroskop auf Anzeichen von nekrotischen Läsionen, die auf das Wachstum der RLN-Population zurückzuführen sind.
      HINWEIS: Erfolgreich parasitierte Karottenscheiben können für die spätere Verwendung bis zu 2 Monate bei 11 °C gelagert werden, aber überprüfen Sie sie regelmäßig auf mikrobielle Kontamination. Parasitierte Karottenscheiben, die Anzeichen einer mikrobiellen Infektion aufweisen, müssen vor der Entsorgung durch Autoklavieren dekontaminiert werden.
   10. Unter der Strömungshaube werden RLNs extrahiert, indem Karottenscheiben mit sichtbarer Gewebenekrose an der Impfstelle (Abbildung 1) auf ein Sieb mit einem Durchmesser von 8 cm und einer Maschenweite von 75 μm in einer sterilen Glasschüssel gegeben werden. Lassen Sie einen kleinen Abstand von 1 cm zwischen dem Boden des Siebs und der Konkavität der Schüssel, um die RLNs aufzufangen.
       HINWEIS: In Ermangelung eines kommerziell erworbenen Siebs kann eines aus einem Kunststoffrohr mit einem Durchmesser von 8 cm/einem stabilen Plastikbecher und einer engmaschigen Gaze hergestellt werden. Verwende Gummibänder, um die Gaze an der Plastiktube oder dem Becher zu befestigen.
   11. Gießen Sie eine antibiotische Lösung in das Sieb, bis die Karottenscheiben bedeckt sind, und bewahren Sie sie 12 h (über Nacht) im Dunkeln auf. Die RLNs treten aus den Karottenscheiben aus und setzen sich am Boden der Schüssel ab. Die Antibiotikalösung sollte nach der Extraktion durch Zugabe von je 50 μg/ml Kanamycin und Carbenicillin in sterilisiertem destilliertem Wasser¹⁶ hergestellt werden.
       HINWEIS: Antibiotika-Stammlösungen werden mit 50 mg/ml hergestellt, indem jeweils 0,5 g Kanamycinmonosulfat oder 0,5 g Carbenicillin-Dinatrium in 10 ml sterilisiertem destilliertem Wasser gelöst werden. Stammlösungen werden in der Strömungshaube filtriert (0,22 μm Masche) und können bis zu 1 Jahr bei -20 °C aufbewahrt werden.
   12. Entfernen Sie das Sieb, ziehen Sie die RLNs mit einer sterilisierten Glaspipette vom Boden der Schüssel in einen sterilisierten Glasfärbeblock (4 cm x 4 cm x 1 cm) und waschen Sie sie, indem Sie 1 ml Antibiotikalösung pipettieren. Warten Sie 30 bis 40 Minuten, bis sich die Nematoden abgesetzt haben, bevor Sie die verwendete Antibiotikalösung auffangen. Wiederholen Sie diese Wäsche 4x-5x.
   13. Verwenden Sie die wässrige Suspension sofort mit den RLNs oder bewahren Sie sie für eine längere Lagerzeit (bis zu 2 Monate) bei 11 °C auf.
2. In vivo Infektion von Kartoffelpflanzen mit PPNs
   HINWEIS: Für den Anbau anfälliger Kartoffelpflanzen (S. tuberosum var. Désirée) sollten zertifizierte Pflanzkartoffeln zwischen Januar und März bei Agrarhändlern erworben werden. Entscheiden Sie sich für zertifizierte Pflanzkartoffeln, da sie mit einem Pflanzenschutzpass verkauft werden, der sicherstellt, dass sie nicht mit Quarantäne-Phytoparasiten kontaminiert sind. Als Vorsichtsmaßnahme kann ein erster Schritt der Desinfektion mit einer 10%igen Bleichlösung gefolgt von einem Waschen unter fließendem Leitungswasser durchgeführt werden, um die Desinfektion der Oberfläche der Kartoffelknolle zu gewährleisten. Übliche kommerzialisierte Kartoffeln werden nicht empfohlen, da die Behandlungen zur Verringerung des Keimens und der Vitalität das Wachstum der Kartoffel und die Reaktion auf eine Infektion beeinträchtigen können.
   1. Wählen Sie gleich große Kartoffelknollen und entsorgen Sie solche mit Löchern, Druckstellen oder weicheren Stellen. Entfernen Sie vor der Aussaat vorsichtig alle angewachsenen Sprossen (1 mm), um die Keimung zu synchronisieren.
      HINWEIS: Lagern Sie die Pflanzkartoffeln bei Bedarf vor der Aussaat an einem gut belüfteten, trockenen und dunklen Ort.
   2. Füllen Sie 5 L Töpfe (22 cm x 18 cm) mit einer 1:1 Mischung aus autoklavierter Erde und feinem groben Sand, gemischt mit 22,5 g NPK-Langzeitdünger (12-12-12) und säen Sie die Kartoffeln 9 cm unter der Erdoberfläche.
      HINWEIS: Erde und Sand sollten gesiebt werden, um Ablagerungen zu entfernen, die größer als 2 mm sind, 2x bei 121 °C für 15 min autoklaviert und 1 bis 2 Tage lang bei 100 °C getrocknet werden, unter häufigem Mischen. Belüften Sie die nächsten 7 – 10 Tage, indem Sie vor dem Gebrauch häufig mischen.
   3. Bewahren Sie die Töpfe in einem Gewächshaus unter feuchten Bedingungen (50 % bis 70 % Luftfeuchtigkeit) auf und gießen Sie häufig (halten Sie den Boden auf einer maximalen Wasserspeicherkapazität von 70 %), um extreme Temperaturen zu vermeiden, bis die Triebe der Kartoffelpflanzen an der Bodenoberfläche zu sprießen beginnen.
   4. Verwenden Sie nach dem Auflaufen der Pflanzen frisch extrahierte RLN-Suspensionen, um die Kartoffelwurzeln zu infizieren. Beginnen Sie damit, gleichmäßig verteilte 4 bis 6 Löcher (1 cm breit) um die Pflanze herum bis zur Samentiefe zu schaffen.
   5. Pipettieren Sie gleichmäßig eine 8-ml-Suspension von 30.000 lebenden gemischten RLNs in die Löcher, so dass das Inokulum ein Verhältnis von 4 lebenden RLNs pro g Erdmischung aufweist, und bedecken Sie es mit einer Erdmischung. Bei den Töpfen mit RLNs sollte das Gießen am Tag der Impfung zurückgehalten werden.
      HINWEIS: RLNs werden unter einem Stereomikroskop (40x) gezählt. Tote Nematoden sind unbeweglich und haben eine ausgedehnte Form, während lebende Nematoden sich im Allgemeinen bewegen (nicht verlängerte Form). Physisches Anstoßen wird verwendet, um die Sterblichkeit zu ermitteln.
   6. Bewahren Sie die Töpfe 2 Monate unter den oben beschriebenen Bedingungen auf (Abbildung 2). Anschließend entwurzelst du die Kartoffelpflanzen und wiegst die Triebe und Wurzeln einzeln.
   7. Waschen Sie das Wurzelsystem sorgfältig, bevor Sie die Position der RLN-Angriffsstellen durch Färbetechniken überprüfen⁵.

2. Etablierung von In-vitro-Cokulturen transgener Kartoffelwurzeln mit PPNs

1. Gründend in vitro Transgene Wurzeln von Kartoffeln
   HINWEIS: Für dieses Protokoll haben wir Rhizobium rhizogenes das Tragen des gus Reportergen, das in das Ri-Plasmid integriert ist und von einem doppelten 35S-Promotor (A4pRiA4::70GUS) angetrieben wird¹⁷. Bakterien können aus kommerziellen Quellen bezogen oder bei zertifizierten Referenzlabors angefordert werden.
   1. Um Bakterien in der exponentiellen Wachstumsphase zu erhalten, wird die Platte R. rhizogenes in eine Luria-Bertani (LB)¹⁸ feste mittlere Platte eingelegt und über Nacht bei 26 °C aufbewahrt.
      HINWEIS: LB-Medium kann kommerziell erworben oder im Labor hergestellt werden, indem 10 g/l Pepton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl und 15 g/l Agar hinzugefügt und dann 15 Minuten lang bei 121 °C mit Dampf sterilisiert werden.
   2. Mit einer Impföse wird eine Kolonie entnommen und 10 ml flüssige LB-Bouillon (LB-Medium ohne Agar) in einen sterilen 50-ml-Kolben geimpft. Über Nacht im Dunkeln bei 26 °C unter Rühren (180 U/min) lagern.
   3. Die Extinktion der Flüssigkultur wird gemessen, bis A₆₀₀ 0,6 erreicht. In diesem Stadium befinden sich die Bakterien in der exponentiellen Wachstumsphase und werden zur Inokulation des Pflanzenmaterials verwendet.
   4. Die Inokulation erfolgt in aseptischen frischen Kartoffelknollen. Um die Oberfläche von Kartoffelknollen zu sterilisieren, waschen Sie sie zunächst unter fließendem Leitungswasser, um größere Rückstände zu entfernen, und dann mit einer gewöhnlichen Waschmittellösung (1 Tropfen pro 40 ml Wasser) unter kräftigem Rühren, um die feineren Rückstände zu entfernen.
      HINWEIS: Wählen Sie eine Kartoffelsorte mit bekannter Anfälligkeit für die verwendeten PPNs. Für dieses Protokoll haben wir S. tuberosum var. Désirée verwendet.
   5. Die Knollen in ein Gefäß geben, mit einer handelsüblichen Bleichlösung (1:4, handelsübliches Bleichmittel in Leitungswasser) abdecken und verschließen. 15 min mischen, die Bleichlösung entsorgen und 3x mit sterilisiertem Leitungswasser abspülen.
   6. In einer Strömungshaube die Knollen 15 min unter kräftigem Rühren in eine Ethanollösung (80%, v/v) tauchen, das Ethanol entsorgen und 3x mit sterilisiertem Leitungswasser spülen.
   7. Mit einem sterilen Skalpell werden die peripheren Teile der Knollen (etwa 50 % der Knolle von der Oberfläche nach innen) entfernt und das innere Mittelstück in 0,5 cm dicke Segmente^{geschnitten 19}. Sofort mit der in Schritt 2.1.3 hergestellten Bakteriensuspension impfen.
   8. Zur Inokulation wird die Bakteriensuspension verdünnt, indem 1 ml Bakteriensuspension zu 9 ml Schenk und Hildebrandt²⁰ (SH) Medium, ergänzt mit 30 g/l Saccharose bei pH = 5,6, gegeben wird. Tauchen Sie die Spitze eines sterilen Skalpells in die verdünnte Suspension und wickeln Sie die Oberfläche des Kartoffelsegments auf. Wiederholen Sie diesen Schritt 5x für jedes Kartoffelsegment.
   9. Trocknen Sie die Segmente der überschüssigen Feuchtigkeit 1 Minute lang in sterilem Filterpapier, legen Sie sie in halbfestes SH-Medium (SH-Medium mit 30 g/L Saccharose, 8 g/L Agar, pH = 5,6) und lagern Sie es dunkel bei 25 °C, damit eine Plasmidtransfektion stattfinden kann.
   10. Nach 3 Tagen werden die infizierten Segmente auf Platten mit halbfestem SH-Medium übertragen, die mit jeweils 150 μg/ml Cefotaxim und Carbenicillin des Antibiotikums ergänzt werden. Über 3 Monate mit wöchentlicher Erneuerung des Mediums aufbewahren, um die Beseitigung der Bakterien zu gewährleisten.
       HINWEIS: Cefotaxim-Stammlösung kann mit 100 mg/ml hergestellt werden, indem 1 g Cefotaxim-Natrium in 10 ml sterilem demineralisiertem Wasser gelöst und unter der Durchflusshaube filtriert (0,22 μm Netz) wird. Antibiotika können bis zu 1 Jahr bei -20 °C aufbewahrt werden.
   11. Nach 3 Monaten ist das transgene Wurzelwachstum großflächig. Übertragen Sie die Wurzeln ohne Antibiotika in ein frisches, halbfestes SH-Medium, indem Sie mit den Spitzen einer sterilen Pinzette einen 1 g schweren Wurzelklumpen sammeln und in der Mitte des Nährmediums in eine neue Platte legen (Abbildung 3).
       HINWEIS: Etwa 1 Monat nach der Infektion treten kleine Massen von Zellwachstum in der Oberfläche des Kartoffelsegments auf, von wo aus sich die transgenen Wurzeln zu entwickeln^{beginnen 6}. Achten Sie darauf, dass sie mit dem Nährmedium in Kontakt kommen, da sie sonst austrocknen könnten.
   12. Um die genetische und metabolische Stabilität zu gewährleisten, sollten transgene Wurzeln in einer monatlichen Subkulturroutine (wie in Schritt 2.1.11 beschrieben) bei 25 °C länger als 1 Jahr im Dunkeln gehalten werden, bevor sie mit PPN infiziert werden.
       HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass bei jedem Schritt des Protokolls mindestens sechs Replikate aufbewahrt werden, da es häufig zu unerwünschten mikrobiellen Kontaminationen kommt. Nach der Etablierung kann eine einzelne Co-Kulturplatte als Inokulum für mehrere neue Co-Kulturen verwendet werden. Achten Sie jedoch darauf, mindestens sechs Replikplatten aufzubewahren.
2. Etablierung von in vitro Co-Kulturen von transgenen Kartoffelwurzeln mit PPNs
   HINWEIS: Um Co-Kulturen von transgenen Wurzeln mit PPNs zu erhalten, ist der Nematodensterilisationsprozess von entscheidender Bedeutung. Für das vorliegende Protokoll haben wir Jungtiere des Zweitstadiums des Quarantäne-Wurzelknoten-Fadenwurms Meloidogyne chitwoodi verwendet. Nematoden-Inokulum kann von zertifizierten Referenzlabors in Form von Wurzelgallen bezogen werden.
   1. Isolieren Sie unter einem binokularen Stereomikroskop (20x) Nematoden-Eimassen aus den Wurzelgallen mit einer sterilen ultrafeinen Punktpinzette. Legen Sie die Eimassen in eine abgedeckte Petrischale mit 5 mL sterilem Leitungswasser und lassen Sie die Eier 48 h schlüpfen. Stellen Sie die J2-Suspension auf 100 Nematoden pro ml ein.
   2. In einer Strömungshaube werden 5 ml einer Suspension, die 500 J2 enthält, in ein steriles Sieb mit 20 μm Maschenweite pipettiert und mit sterilem Leitungswasser gewaschen.
   3. Die untere Hälfte des Siebs mit den J2s wird in eine 20%ige Wasserstoffperoxidlösung (H₂O₂) getaucht und 15 Minuten lang manuell in kreisenden Bewegungen gemischt.
   4. Waschen Sie die sterilen J2s, indem Sie steriles Leitungswasser durch das Sieb geben. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x. Kippen Sie in der letzten Wäsche das Sieb so, dass sich die Nematoden am Siebrand sammeln. Die sterile Nematodensuspension wird durch Pipettieren von 1 ml sterilem Reinstwasser in den Siebrand zurückgewonnen und bei 11 °C gelagert oder sofort verwendet.
      HINWEIS: Der Erfolg der Sterilisation kann beurteilt werden, indem ein 100-μl-Aliquot der Nematodensuspension in SH-Medium plattiert und 1 Woche lang regelmäßig auf Kontamination überwacht wird.
   5. In der Fließhaube wird ein 1 g Klumpen transgener Kartoffelwurzeln (wie in Schritt 2.1.11 beschrieben) auf SH-Platten mit 100 sterilen Nematoden (100 μl einer Suspension mit 1000 J2s pro ml) subkultiviert. Nach 2 bis 3 Wochen beginnen kleine Gallen in den neuen Wurzeln zu erscheinen.
   6. Verfolgen Sie die Co-Kultur regelmäßig unter einem inversen Mikroskop (100x), und wenn sich Eimassen bemerkbar machen, subkulturieren Sie auf eine neue halbfeste SH-Mediumplatte, wobei Sie sicherstellen, dass die Gallen mit dem Wurzelklumpen entnommen werden (Abbildung 4). Halten Sie Co-Kulturen unter einer monatlichen Subkultur-Routine bei 25 °C im Dunkeln.

3. Strukturelle Analyse der PPN-Infektion

HINWEIS: Um PPNs-induzierte Veränderungen in der Struktur des Wurzelgewebes zu verfolgen, werden histochemische Färbetechniken verwendet, um Gewebe mit unterschiedlichen chemischen Zusammensetzungen zu kontrastieren. Die differentielle Färbung wird in Wurzelmassen oder in dünnen Schnitten von fixiertem Wurzelmaterial durchgeführt, wobei spezifische Farbstoffe entsprechend ihrer chemischen Affinität mit dem Zielgewebe reagieren²¹. Für das vorliegende Protokoll haben wir saures Fuchsin oder periodisches Säure-Schiff-Reagenz (PAS) in Kombination mit Toluidinblau-O-Farbstoffen für die Differenzfärbung verwendet.

1. Verteilung parasitärer Nematoden in Wurzeln, die mit saurem Fuchsin gefärbt wurden
   HINWEIS: Um die Verteilung der PPNs im gesamten Wurzelsystem zu verfolgen, wird saures Fuchsin verwendet, um das Muskelgewebe der Nematoden in einem roten Farbton^{zu färben 5}.
   1. Beginnen Sie damit, das Wurzelsystem 5 Minuten lang unter fließendem Leitungswasser zu waschen, um Bodenreste (in vivo Pflanzenwurzeln) oder Rückstände des Nährmediums (in vitro transgene Wurzeln) zu entfernen. Benutze deine Finger in kreisenden Bewegungen, um die Erde vom Wurzelsystem zu lösen.
   2. Schneiden Sie das Wurzelsystem in 1 bis 2 cm lange Abschnitte und geben Sie es in ein 150 mL Becherglas. Geben Sie 70 ml einer 1,5%igen Natriumhypochloritlösung (NaOCl) ab und mischen Sie sie 4 Minuten lang kräftig, um das Wurzelgewebe zu reinigen. Entsorgen Sie anschließend die NaOCl-Lösung, spülen Sie die Wurzeln unter fließendem Leitungswasser ab und weichen Sie sie 15 Minuten lang in demineralisiertem Wasser ein, um das restliche^{NaOCl 22} zu entfernen.
      HINWEIS: Chlorbleiche enthält mindestens 5,25 % NaOCl, fügen Sie also 20 ml Chlorbleiche zu 50 ml Wasser hinzu, um eine 1,5%ige NaOCl-Lösung zu erhalten. Für weicheres Material (z. B. weicheres Gewebe junger Wurzeln oder von in vitro gezüchteten transgenen Wurzeln) wird eine 0,9%ige NaOCl-Lösung verwendet, während für härteres Material (ältere verholzte Wurzeln) eine 2,0%ige NaOCl-Lösung verwendet wird.
   3. Lassen Sie die gerodeten Wurzeln abtropfen und legen Sie sie auf ein Borosilikatglasbecherglas mit 30 mL demineralisiertem Wasser. 1 ml saure Fuchsin-Fleckenlösung pipettieren, manuell mischen und 30 s auf einer heißen Platte kochen lassen. Lassen Sie den Becher abkühlen, lassen Sie die Lösung abtropfen und waschen Sie die verschmutzten Wurzeln unter fließendem Leitungswasser.
      HINWEIS: Die saure Fuchsin-Fleckenlösung wird hergestellt, indem 3,5 g saures Fuchsin-Farbstoffpulver in 250 ml Essigsäure aufgelöst und 750 ml demineralisiertes Wasser hinzugefügt werden. Auf die Färbung folgt immer ein Entfärbungsschritt, um ungenutzte überschüssige Flecken zu entfernen und den Kontrast der Probe zu verbessern.
   4. Entfärben Sie die Flüssigkeit, indem Sie 10-30 ml Glycerin hinzufügen, das mit einigen Tropfen HCl (5N)¹³ angesäuert ist.
   5. Beobachten Sie unter dem Stereomikroskop oder dem inversen Mikroskop, um grob zu beurteilen, wo in der Wurzelstruktur die PPNs bevorzugt angreifen (Abbildung 5 und Abbildung 6).
2. Beurteilung der Wurzelzellmorphologie mit periodischer Säure-Schiff (PAS)/Toluidinblau O
   HINWEIS: Der Einfluss einer PPN-Infektion oder einer Schädigung der Wurzelzellmorphologie kann unter dem Mikroskop beurteilt werden, indem infizierte Kartoffelwurzeln zunächst fixiert, geschnitten und differentiell gefärbt werden.
   1. In einem geschlossenen Probenfläschchen frisches Wurzelmaterial mit 2,5 % Glutaraldehyd, hergestellt in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, bei pH 7,2 für 24-48 h bei Raumtemperatur^{fixieren 6}.
      ACHTUNG: Glutaraldehyd ist giftig. Vermeiden Sie Einatmen und Kontakt. Verwenden Sie einen schützenden Laborkittel und Handschuhe und arbeiten Sie in einem Abzug. Probengefäße sollten geschlossen werden, es sei denn, es handelt sich um Spül- oder Vakuumverfahren. Entsorgen Sie Glutaraldehyd gemäß den Regeln für Verfahren für gefährliche Abfälle. Die Schritte 3.2.1 bis 3.2.5 werden in einem Abzug durchgeführt, um das Einatmen von Reagenzien zu vermeiden.
      HINWEIS: Zur Herstellung von 1 l Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2 fügen Sie 68,4 mL 1 M Na₂HPO₄ (141,96 g in 1 l Lösung) zu 31,6 mL 1 M NaH₂PO₄ (119,98 g in 1 l Lösung) hinzu und füllen Sie bis zu 1 l durch Zugabe von 900 mL demineralisiertem Wasser auf. Um das Infiltrieren des Fixiermittels zu erleichtern, stellen Sie die unverschlossenen Probenfläschchen mit dem Wurzelmaterial 2 Minuten lang unter einem niedrigen Vakuum (26 mm Hg) in einen Exsikkator, der an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist.
   2. Entsorgen Sie mit einer Pasteurpipette aus Glas die Fixierlösung und waschen Sie die fixierten Wurzeln mit Natriumphosphatpuffer (3x).
   3. Beginnen Sie mit der schrittweisen Dehydrierung des fixierten Wurzelgewebes, indem Sie den Puffer für 15 Minuten durch eine 10 %ige Ethanollösung (v/v) ersetzen. Tauschen Sie sie anschließend mit einer 20%igen Ethanollösung mit einer Glaspipette aus und lassen Sie die Wurzeln 15 Minuten lang eingebettet. Fahren Sie mit der abgestuften Abfolge steigender Ethanolkonzentrationen fort (30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % und 90 % für jeweils 15 Minuten) bis zum Schritt reines Ethanol, in dem die Wurzeln 1 h lang aufbewahrt werden sollten.
   4. Betten Sie die entwässerten Wurzeln nach und nach in Harz (2-Hydroxyethylmethacrylat) ein. Ersetzen Sie das reine Ethanol mit einer Glaspipette durch eine 3:1 (v/v) Ethanol/Harz-Lösung und bewahren Sie es 24 h bei 4 °C auf. Anschließend werden 1:1 und 1:3 (v/v) Ethanol/Harz-Lösungen mit einer Inkubationszeit von jeweils 24 Stunden bei 4 °C verwendet. Ersetzen Sie anschließend die 1:3 (v/v) Lösung durch reines Harz, das mit Dibenzoylperoxid (1%) als Polymerisationsinitiator versetzt ist.
   5. Legen Sie die Proben in eine Harzformschale, fügen Sie eine Mischung aus Harz und Dimethylsulfoxid 15:1 (v/v) hinzu und lassen Sie sie 48 Stunden lang bei 60 °C über einer Heizplatte stehen, damit das Harz aushärten kann.
   6. Legen Sie die imprägnierten Proben in ein rotierendes Mikrotom, das mit einem Wolframmesser ausgestattet ist, und schneiden Sie 2-5 μm große Schnitte gemäß den Anweisungen des Herstellers auf Objektträger.
   7. Beginnen Sie die Differenzfärbung, indem Sie die Objektträger 10 Minuten lang in einem Glasfärbegefäß mit einer 15%igen 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Lösung in Essigsäure bei Raumtemperatur eintauchen. Anschließend 15 min unter fließendem Leitungswasser sorgfältig waschen und im Backofen bei 60 °C (15 min) trocknen.
   8. Tauchen Sie anschließend die Objektträger 10 Minuten lang in periodische Säure (1 %), waschen Sie sie dann 5 Minuten lang unter fließendem Leitungswasser und lassen Sie sie im Ofen bei 60 °C (15 Minuten) trocknen.
   9. Tauchen Sie die Objektträger 30 Minuten lang in Schiff's Reagenz (bestehend aus 1 % Pararosanilin und 4 % Natriummetabisulfit, in 0,25 M Salzsäure). Anschließend mit einer Natriummetabisulfitlösung (0,5%) in Salzsäure (0,05 M) 2 Min. waschen. 3x wiederholen. Zum Schluss 5 Minuten unter fließendem Leitungswasser waschen und bei Raumtemperatur trocknen.
   10. Als Kontrast färben Sie die Objektträger, indem Sie sie 15 Minuten lang in 0,05 % Toluidinblau O tauchen, 15 Minuten lang unter fließendem Leitungswasser waschen und im Ofen bei 60 °C (15 min) trocknen.
   11. Beobachten Sie unter einem Mikroskop (100x), das mit Bilderfassungshardware ausgestattet ist (Abbildung 7).

Ergebnisse

Karottenscheiben können verwendet werden, um verschiedene Arten von wandernden PPNs zu vermehren und zu erhalten²³. Für das RLN wird diese Technik im Allgemeinen verwendet, um Referenzsammlungen von Nematodenarten oder -isolaten zu führen. Mit Hilfe von Karottenscheiben kann eine durchschnittliche 100-fache Zunahme der Nematodenpopulationen in einem Zeitraum von 3 Monaten erzielt werden (Abbildung 1). Die Anzahl der Nematoden varii...

Diskussion

Die Untersuchung der Mechanismen der Infektion und Krankheitsentwicklung bei Pflanzen, die von bodenbewohnenden PPNs befallen werden, ist schwierig, da diese Phytoparasiten in der Regel das innere Gewebe des Wurzelsystems infizieren und unspezifische Symptome in den Trieben hervorrufen. Trotz der kontrollierten Umweltbedingungen des Gewächshauses werden das Keimen der Kartoffelknollen und das Wachstum der Kartoffelpflanzen in den Frühlings- und Sommermonaten immer noch begünstigt, wod...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-Dinitrophenylhydrazine	Sigma-Aldrich	D199303
2-Hydroxyethyl methacrylate	Sigma-Aldrich	17348
Acetic acid	Sigma-Aldrich	695092
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129
Benzoyl peroxide	Sigma-Aldrich	B5907
borosilicate glass beaker	Sigma-Aldrich	Z231827
Carbenicillin disodium salt	Sigma-Aldrich	C3416
Cefotaxime sodium salt	Sigma-Aldrich	C7039
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301
Ethanol	Supelco	1.00983
Fertilizer	Compo Expert
Flower pot 5 L	VWR	470049-676
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	354400
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Kanamycin monosulfate	Sigma-Aldrich	BP861
LB Broth with agar	Sigma-Aldrich	L3147
MCE syringe filter	Millipore	SLGSR33SS
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Pararosaniline hydrochloride	Sigma-Aldrich	P3750
Periodic acid	Sigma-Aldrich	P0430
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
Schiff′s reagent	Sigma-Aldrich	1.09033
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	161519
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011
Soil / Substrate	Compo Sana
Stainless Steel Tweezers	Sigma-Aldrich	22435-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161