Infection in vivo et in vitro des racines de pomme de terre par des nématodes parasites des plantes pour l’évaluation des changements structurels induits

Résumé

Le protocole décrit l’infection des racines de Solanum tuberosum par des nématodes parasites des plantes dans des conditions de serre in vivo et des racines transgéniques de la pomme de terre in vitro pour l’analyse histochimique de la structure racinaire par microscopie optique.

Résumé

Les nématodes parasites des plantes vivant dans le sol (NPP) sont d’importants ravageurs de la pomme de terre qui causent des lésions et/ou modifient la structure des racines des plantes, entraînant une réduction de la valeur adaptative et de la productivité des cultures. La recherche sur les mécanismes cellulaires et subcellulaires de l’infection et du développement des NMP peut avoir recours à des plantes de plein champ ou à des semis dans des conditions de serre. Les études sur le terrain sont plus représentatives des environnements naturels, mais sont soumises à l’imprévisibilité des conditions environnementales qui peuvent fortement influencer les résultats de la recherche. Les études en serre permettent un meilleur contrôle des variables environnementales et une plus grande sécurité contre les contaminants ou les agents pathogènes. Cependant, chez certains hôtes, la diversité génétique devient un facteur important de variabilité et influence la réponse du complexe hôte-parasite. Nous avons développé des co-cultures in vitro de racines transgéniques avec des NPP comme une alternative fiable qui occupe moins d’espace, nécessite moins de temps à obtenir et est exempte de contamination ou de variabilité génétique de l’hôte. Les co-cultures sont obtenues en introduisant des NPP aseptiques pour héberger in vitro des racines transgéniques. Ils peuvent être maintenus indéfiniment, ce qui en fait un excellent support pour la conservation de collections de PPN de référence. Dans le présent travail, un protocole est détaillé pour l’infection contrôlée des racines de pomme de terre in vivo par le nématode des racines des racines et pour l’établissement de co-cultures in vitro de racines transgéniques de pomme de terre avec le nématode à galles. Les cocultures in vitro ont fourni un indicateur de laboratoire de l’infection naturelle de la pomme de terre et ont produit des nématodes aux stades de vie indépendamment de la saison ou des conditions climatiques. De plus, la méthodologie utilisée pour l’analyse structurelle est détaillée à l’aide de l’histochimie et de la microscopie optique. Le colorant fuchsin acide est utilisé pour suivre les sites d’attaque des nématodes sur les racines, tandis que la coloration différentielle avec Periodic acid-Schiff (PAS) et le bleu de toluidine O met en évidence les structures nématodes dans le tissu racinaire interne de la pomme de terre.

Introduction

Les plantes racines et tubercules se classent au 4e^{rang des} aliments de base les plus importants au monde. La pomme de terre (Solanum tuberosum L.) est l’un des tubercules cultivés les plus importants. Il a son origine dans les montagnes des Andes d’Amérique du Sud, mais après avoir été introduit en Europe au^16ème siècle, il est rapidement devenu la source de nourriture la plus courante pour la population à faible revenu. Aujourd’hui, les pommes de terre représentent 1,7 % de l’apport calorique mondial¹. La production agricole est fortement affectée par les ravageurs et les agents pathogènes des plantes, dont les nématodes parasites des plantes (NEP) peuvent entraîner des pertes de rendement moyennes allant jusqu’à 12 %². Les nématodes parasites des plantes sont responsables de certaines des maladies les plus dommageables pour les cultures dans l’agriculture moderne. Les RPP vivant dans le sol imposent de lourdes pertes aux agriculteurs car ils affectent les racines des plantes et interfèrent avec la productivité des cultures en réduisant la production et/ou en endommageant les produits, les rendant invendables³. Ces phytoparasites dangereux utilisent leur stylet (une pièce buccale en forme d’aiguille) pour percer les cellules racinaires et se nourrir du contenu cellulaire. Certains NPP se nourrissent de l’extérieur des racines, d’autres pénètrent dans la racine et causent des lésions tissulaires (migratrices), tandis que d’autres pénètrent dans les racines et deviennent sédentaires, modifiant fortement la structure racinaire pour faciliter l’alimentation⁴. Les principaux NPP affectant la pomme de terre sont les nématodes à kystes de la pomme de terre, Globodera spp., les nématodes à galles (RKN), Meloidogyne spp., les nématodes des lésions des racines, Pratylenchus spp., le faux nématode à galles Nacobbus aberrans et le nématode à galles Ditylenchus destructor. Pour ces NPP, des habitudes alimentaires différentes induisent différents changements structurels dans les tissus racinaires de l’hôte ^5,6. Les recherches sur les mécanismes de l’infection par le NPP et la réponse de l’hôte sont souvent effectuées dans le cadre d’essais sur le terrain ou en serre afin de tenir à jour des collections de cultures de référence de NPP ou de réaliser des expériences à grande échelle ^7,8. Les essais dans des conditions naturelles sont fortement influencés par les variations environnementales et les facteurs de stress biotiques ou abiotiques. Les essais biologiques en serre sont une alternative plus proche d’une condition naturelle tout en permettant un contrôle relatif des variations environnementales et en limitant l’influence des stress abiotiques et biotiques. Cependant, la diversité génétique de l’hôte peut encore être un défi pour les essais qui nécessitent un contrôle plus fin de la variabilité biologique. Ces limites peuvent être surmontées en recourant à des cultures de tissus végétaux in vitro. Il s’agit de systèmes de laboratoire polyvalents présentant de nombreux avantages pour la recherche sur les maladies des PPN. Pour les RPP vivant dans le sol, les cultures in vitro de racines transgéniques sont un outil utile pour la recherche en laboratoire ^9,10.

Les racines transgéniques, ou racines poilues (HR), sont obtenues après l’infection de matériel végétal par Rhizobium rhizogenes (Riker et al., 1930) Young et al., 2001,¹¹. Cette bactérie à Gram négatif induit la transfection de son plasmide Ri dans le génome de l’hôte et modifie la régulation de la biosynthèse des hormones végétales, favorisant la formation de tissu racinaire¹². Les racines transgéniques peuvent être maintenues indéfiniment sous asepsie dans un milieu de culture. Les avantages de l’utilisation de la HR pour l’étude des PPN sont un taux de croissance élevé en l’absence de régulateurs de croissance des plantes qui influencent l’infection et le développement des nématodes, un rapport élevé de production de biomasse par unité de temps, et l’intégrité cellulaire et la longévité, qui déterminent une stabilité génétique et biochimique plus élevée⁶. En recourant à des racines transgéniques in vitro, les génotypes des NPP peuvent être maintenus indéfiniment dans des conditions de laboratoire, l’infection et le développement des NAP peuvent être facilement suivis, la variabilité génétique de l’hôte peut être réduite, la manipulation de la composition moléculaire de l’hôte peut être directement liée à la réponse des nématodes, et les changements structurels de l’hôte et du parasite peuvent être suivis avec plus de précision ^6,13. Pour les études sur les maladies de la pomme de terre, les cocultures de racines transgéniques in vitro permettent de réaliser des expériences indépendamment de la saison ou de la dormance des tubercules de pomme de terre.

Dans ce protocole, la méthodologie traditionnelle d’entretien des NPP et d’infection in vivo des plants de pommes de terre est détaillée. Pour l’analyse structurale des racines infectées, une méthodologie améliorée basée sur l’établissement de co-cultures in vitro de racines de pommes de terre transgéniques avec des NPP est également détaillée comme une alternative qui permet un contrôle plus élevé de la variabilité génétique de l’environnement et de l’hôte. Pour suivre l’infection et le développement des NPP dans le tissu racinaire, l’histochimie est utilisée pour faciliter l’observation des NPP sous microscopie optique. L’objectif général de ce protocole est d’optimiser l’étude des interactions PPN-hôte, en assurant des conditions d’expérimentation plus contrôlées et reproductibles tout en facilitant les analyses structurelles et développementales détaillées des nématodes dans le tissu racinaire.

Protocole

1. Infection des plants de pommes de terre cultivés en serre

REMARQUE : Les essais en serre sont réalisés avec des suspensions de NPP à des stades de vie mixtes ou des juvéniles de deuxième stade (J2), selon le cycle de vie spécifique du ravageur du NPP. Pour ce protocole, des suspensions de stades de vie mixtes du nématode des racines ( RLN) Pratylenchus penetrans ont été utilisées. Les NPP peuvent être élevés en laboratoire ou demandés à des laboratoires de référence certifiés.

1. Multiplication et entretien des nématodes des racines
   REMARQUE : Les disques de carottes stérilisés sont utilisés pour la multiplication et la maintenance des RLN¹⁴. Utilisez des carottes acquises dans le commerce (var. Nice) sans dommages visibles pour réduire la contamination microbienne. De préférence, ils doivent être exempts de pesticides pour éviter d’entraver le développement des RLN.
   1. Lavez la carotte à l’eau courante du robinet pour enlever les plus gros débris, puis avec une solution détergente ordinaire (1 goutte pour 40 ml d’eau) pour enlever les débris plus fins. Sécher avec des serviettes en papier de laboratoire.
   2. Sous asepsie, dans une hotte à flux vertical, insérez une brochette en métal stérilisé sur le dessus de la carotte (1 à 2 cm vers l’intérieur) afin qu’elle puisse être plus facilement tenue.
   3. À l’aide d’une bouteille de lavage avec une buse, mouillez la carotte avec de l’éthanol à 96 % (v/v). Épongez la pointe inférieure de la carotte dans un papier filtre stérilisé et portez-la soigneusement à la flamme.
      ATTENTION : Sachez que l’éthanol s’enflamme fortement, alors tenez-vous à distance.
   4. Épluchez la carotte de haut en bas à l’aide d’un éplucheur stérile, puis répétez l’étape précédente. Jetez les parties supérieure et inférieure (2 cm vers l’intérieur) et placez la partie centrale de la carotte dans une boîte de Pétri stérile (150 mm de diamètre). À l’aide d’une lame stérile et d’une pince à épiler, coupez soigneusement des sections de 1 cm d’épaisseur dans la partie de la carotte d’environ 2 cm de diamètre (figure 1).
   5. Transférez les sections dans des boîtes de Pétri stériles (60 mm de diamètre) et scellez la bordure avec un film transparent. À l’aide d’une lampe UV, stérilisez la surface des disques de carottes pendant 60 min de chaque côté.
   6. Conserver à 25 °C pendant 1 à 2 semaines dans l’obscurité et jeter tous les disques de carotte qui commencent à montrer des signes de contamination microbienne¹⁵.
      REMARQUE : Les signes visibles de contamination sont un brunissement excessif (pourriture), une accumulation de liquide dans le bord inférieur du disque de carotte ou une croissance fongique de mycélium à la surface.
   7. Les disques de carottes restants sont prêts à être infectés par des suspensions RLN. Commencez par faire une incision en forme de X au centre du disque de carotte à l’aide d’une lame stérile. Assurez-vous de ne couper qu’à mi-chemin.
   8. Inoculer le RLN en pipetant 50 μL d’une suspension contenant au moins 50 stades de vie mixtes au centre de la plaie en forme de X. Fermez la boîte de Pétri et scellez la bordure avec un film transparent pour éviter la dessiccation.
      1. Déterminer le nombre moyen de nématodes en suspension en comptant cinq aliquotes de 50 μL sous un stéréomicroscope binoculaire (40x) à température ambiante dans une lame concave. Régler la suspension des RLN à 1000 par mL en ajoutant de l’eau à la suspension ou en attendant que les nématodes se déposent (environ 60 min) et en abaissant le volume en transvasant l’eau de surface.
   9. Conservez les disques de carottes à 25 °C, dans l’obscurité, jusqu’à 3 mois et suivez-les chaque semaine sous un stéréomicroscope binoculaire pour détecter les signes de lésions nécrotiques, résultant de la croissance de la population de RLN.
      REMARQUE : Les disques de carottes parasités avec succès peuvent être conservés à 11 °C pour une utilisation ultérieure jusqu’à 2 mois, mais vérifiez régulièrement la contamination microbienne. Les disques de carottes parasités qui présentent des signes d’infection microbienne doivent être décontaminés par autoclave avant d’être jetés.
   10. Sous la hotte d’écoulement, extraire les RLN en transférant les disques de carotte présentant une nécrose tissulaire visible au site d’inoculation (figure 1) vers un tamis à mailles de 8 cm de diamètre et de 75 μm placé dans un bol en verre stérile. Laissez un petit espace de 1 cm entre le bas du tamis et la concavité du bol pour recueillir les RLN.
       REMARQUE : En l’absence d’un tamis acquis dans le commerce, on peut en fabriquer un à partir d’un tube en plastique de 8 cm de diamètre/d’un gobelet en plastique robuste et d’une gaze à mailles serrées. Utilisez des élastiques pour fixer la gaze au tube ou à la tasse en plastique.
   11. Versez une solution antibiotique dans le tamis jusqu’à ce que les disques de carottes soient recouverts et conservez-les pendant 12 h (toute la nuit) dans l’obscurité. Les RLN sortent des disques de carottes et se déposent au fond du bol. La solution d’antibiotiques doit être préparée extemporanément avec l’extraction en ajoutant 50 μg/mL chacun de kanamycine et de carbénicilline dans de l’eau distillée stérilisée¹⁶.
       REMARQUE : Les solutions mères d’antibiotiques sont préparées à 50 mg/mL en dissolvant 0,5 g de monosulfate de kanamycine ou 0,5 g de carbénicilline disodique dans 10 mL d’eau distillée stérilisée. Les solutions mères sont filtrées (maille de 0,22 μm) dans la hotte d’écoulement et peuvent être maintenues à -20 °C jusqu’à 1 an.
   12. Retirez le tamis, utilisez une pipette en verre stérilisé pour prélever les RLN du fond du bol dans un bloc de coloration en verre stérilisé (4 cm x 4 cm x 1 cm), et lavez en pipetant 1 mL de solution antibiotique. Attendez 30 à 40 min que les nématodes se déposent avant de recueillir la solution antibiotique utilisée. Répétez ce lavage 4 à 5 fois.
   13. Utilisez immédiatement la suspension aqueuse avec les RLN ou maintenez-la à 11 °C pendant une période de stockage plus longue (jusqu’à 2 mois).
2. Infection in vivo de plants de pommes de terre par des NPP
   REMARQUE : Pour cultiver des plants de pommes de terre sensibles (S. tuberosum var. Désirée), les plants de pommes de terre certifiés doivent être achetés auprès de négociants agricoles entre janvier et mars. Choisissez des plants de pommes de terre certifiés car ils sont vendus avec un passeport phytosanitaire, ce qui garantit qu’ils ne sont pas contaminés par des phytoparasites de quarantaine. Par mesure de précaution, une première étape de désinfection avec une solution d’eau de Javel à 10 % suivie d’un lavage à l’eau courante du robinet peut être effectuée pour assurer la désinfection de la surface du tubercule de pomme de terre. Les pommes de terre courantes commercialisées ne sont pas recommandées, car les traitements imposés pour réduire la germination et la vigueur peuvent interférer avec la croissance des pommes de terre et la réponse à l’infection.
   1. Choisissez des tubercules de pomme de terre de la même taille et jetez ceux qui présentent des trous, des meurtrissures ou des sections plus molles. Retirez délicatement toutes les pousses cultivées (1 mm) avant le semis pour synchroniser la germination.
      REMARQUE : Si nécessaire, conservez les pommes de terre de semence dans un endroit bien ventilé, sec et sombre avant de semer.
   2. Remplissez des pots de 5 L (22 cm x 18 cm) avec un mélange 1:1 de terre autoclavée et de sable fin grossier mélangé à 22,5 g d’engrais NPK à libération lente (12-12-12) et semez les pommes de terre à 9 cm sous la surface du sol.
      REMARQUE : La terre et le sable doivent être tamisés pour enlever les débris de plus de 2 mm, autoclavés 2x à 121 °C pendant 15 minutes et séchés à 100 °C pendant 1 à 2 jours, avec mélange fréquent. Aérez les 7 à 10 prochains jours en mélangeant fréquemment, avant utilisation.
   3. Gardez les pots dans une serre dans des conditions humides (50 % à 70 % d’humidité) et arrosez fréquemment (maintenez le sol à 70 % de sa capacité maximale de rétention d’eau), en évitant les températures extrêmes, jusqu’à ce que les pousses de pommes de terre commencent à émerger à la surface du sol.
   4. Après la levée des plantes, utilisez des suspensions de RLN fraîchement extraites pour infecter les racines de pommes de terre. Commencez par créer uniformément 4 à 6 trous (1 cm de large) autour de la plante jusqu’à la profondeur des graines.
   5. Pipeter uniformément une suspension de 8 mL de 30 000 RLN vivants à des stades de vie mixtes dans les trous, de sorte que l’inoculum ait un rapport de 4 RLN vivants par g de mélange de sol, et couvrir avec le mélange de terre. Pour les pots avec RLN, interrompre l’arrosage le jour de l’inoculation.
      REMARQUE : Les RLN sont comptés au stéréomicroscope (40x). Les nématodes morts sont non mobiles et ont une forme allongée, tandis que les nématodes vivants se déplacent généralement (forme non allongée). L’aiguillon physique est utilisé pour déterminer la mortalité.
   6. Conservez les pots pendant 2 mois dans les conditions décrites ci-dessus (Figure 2). Ensuite, déracinez les plants de pommes de terre et pesez les pousses et les racines séparément.
   7. Laver soigneusement le système racinaire avant de vérifier l’emplacement des sites d’attaque RLN à l’aide de techniques de coloration⁵.

2. Établissement de cocultures in vitro de racines transgéniques de pommes de terre avec des NMP

1. Fondation in vitro racines transgéniques de pomme de terre
   REMARQUE : Pour ce protocole, nous avons utilisé Rhizobium rhizogenes portant le gus gène rapporteur co-intégré dans le plasmide Ri et piloté par un double promoteur 35S (A4pRiA4 ::70GUS)¹⁷. Les bactéries peuvent être acquises auprès de sources commerciales ou demandées à des laboratoires de référence certifiés.
   1. Pour obtenir des bactéries en phase de croissance exponentielle, étaler la plaque R. rhizogenes dans une plaque de milieu solide Luria-Bertani (LB)¹⁸ et la conserver toute la nuit à 26 °C.
      REMARQUE : Le milieu LB peut être acquis dans le commerce ou préparé en laboratoire en ajoutant 10 g/L de peptone, 5 g/L d’extrait de levure, 10 g/L de NaCl et 15 g/L de gélose, puis en stérilisant à la vapeur pendant 15 min à 121 °C.
   2. À l’aide d’une boucle d’inoculation, prélever une colonie et inoculer 10 mL de bouillon liquide LB (milieu LB sans agar) dans une fiole stérile de 50 mL. Conserver toute la nuit dans l’obscurité à 26 °C sous agitation (180 tr/min).
   3. Mesurer l’absorbance de la culture liquide jusqu’à ce que A₆₀₀ atteigne 0,6. À ce stade, les bactéries sont en phase de croissance exponentielle et sont utilisées pour inoculer le matériel végétal.
   4. L’inoculation est effectuée dans des tubercules de pomme de terre frais aseptiques. Pour stériliser la surface des tubercules de pomme de terre, commencez par laver à l’eau courante du robinet pour enlever les plus gros débris, puis avec une solution détergente ordinaire (1 goutte par 40 ml d’eau), en agitant vigoureusement, pour enlever les débris les plus fins.
      REMARQUE : Choisir une variété de pomme de terre dont la sensibilité aux NEPP est connue. Pour ce protocole, nous avons utilisé S. tuberosum var. Désirée.
   5. Placez les tubercules dans un récipient, couvrez d’une solution d’eau de Javel du commerce (1:4, eau de Javel du robinet) et fermez. Mélangez pendant 15 min, jetez la solution d’eau de Javel et rincez 3 fois à l’eau du robinet stérilisée.
   6. Dans une hotte à flux, plongez les tubercules dans une solution d’éthanol (80 %, v/v) pendant 15 min avec une agitation vigoureuse, jetez l’éthanol et rincez 3 fois à l’eau du robinet stérilisée.
   7. À l’aide d’un scalpel stérile, retirez les parties périphériques des tubercules (environ 50 % du tubercule de la surface vers l’intérieur) et divisez la partie centrale interne en segments de 0,5 cm d’épaisseur¹⁹. Inoculer immédiatement avec la suspension bactérienne préparée à l’étape 2.1.3.
   8. Pour l’inoculation, diluer la suspension bactérienne en ajoutant 1 mL de suspension bactérienne à 9 mL de milieu Schenk et Hildebrandt²⁰ (SH) complété par 30 g/L de saccharose à pH = 5,6. Trempez la pointe d’un scalpel stérile dans la suspension diluée et enroulez la surface du segment de pomme de terre. Répétez cette étape 5 fois pour chaque segment de pomme de terre.
   9. Sécher les segments d’humidité excessive dans du papier filtre stérile pendant 1 min, les placer dans un milieu SH semi-solide (milieu SH avec 30 g/L de saccharose, 8 g/L de gélose, pH = 5,6) et les maintenir dans l’obscurité à 25 °C pour que la transfection plasmidique se produise.
   10. Après 3 jours, transférez les segments infectés dans des plaques de milieu SH semi-solide complété par 150 μg/mL de chacun des céfotaximes et de la carbénicilline de l’antibiotique. Conserver pendant plus de 3 mois avec un renouvellement moyen hebdomadaire pour assurer l’élimination des bactéries.
       REMARQUE : La solution mère de céfotaxime peut être préparée à 100 mg/mL en dissolvant 1 g de céfotaxime sodique dans 10 mL d’eau déminéralisée stérile et en filtrant (maille de 0,22 μm) sous la hotte. Les antibiotiques peuvent être conservés à -20 °C jusqu’à 1 an.
   11. Après 3 mois, la croissance des racines transgéniques est importante. Transférez les racines dans un milieu SH frais, semi-solide et sans antibiotiques en rassemblant une touffe de racines de 1 g à l’aide de la pointe d’une pince à épiler stérile et en la plaçant au centre du milieu de culture dans une nouvelle plaque (Figure 3).
       REMARQUE : Environ 1 mois après l’infection, de petites masses de croissance cellulaire apparaissent à la surface du segment de pomme de terre, à partir duquel les racines transgéniques commencent à se développer⁶. Assurez-vous de les garder en contact avec le milieu de culture, sinon ils pourraient se dessécher.
   12. Pour assurer la stabilité génétique et métabolique, conserver les racines transgéniques sous une routine mensuelle de sous-culture (comme décrit à l’étape 2.1.11.) à 25 °C dans l’obscurité pendant plus d’un an avant d’infecter avec des NPP.
       REMARQUE : Assurez-vous qu’au moins six réplicats sont conservés à chaque étape du protocole, car une contamination microbienne indésirable se produit souvent. Une fois établie, une seule plaque de coculture peut être utilisée comme inoculum pour plusieurs nouvelles cocultures ; Cependant, assurez-vous de conserver au moins six plaques répétées.
2. Etablissement de co-cultures in vitro de racines de pommes de terre transgéniques avec des NPP
   REMARQUE : Pour obtenir des co-cultures de racines transgéniques avec des NPP, le processus de stérilisation des nématodes est essentiel. Pour le présent protocole, nous avons utilisé des juvéniles de deuxième stade du nématode à galles de quarantaine Meloidogyne chitwoodi. L’inoculum de nématodes peut être obtenu auprès de laboratoires de référence certifiés sous forme de galles racinaires.
   1. À l’aide d’un stéréomicroscope binoculaire (20x), isolez les masses d’œufs de nématodes des galles racinaires à l’aide d’une pince à épiler stérile à pointes ultrafines. Placez les masses d’œufs dans une boîte de Pétri couverte avec 5 ml d’eau du robinet stérile et laissez les œufs éclore pendant 48 h. Réglez la suspension J2 à 100 nématodes par ml.
   2. Dans une hotte d’écoulement, pipeter 5 mL d’une suspension contenant 500 J2 dans un tamis stérile à mailles de 20 μm et laver avec de l’eau du robinet stérile.
   3. Plongez la moitié inférieure du tamis contenant les J2s dans une solution de peroxyde d’hydrogène à 20 % (H₂O₂) et mélangez manuellement en mouvements circulaires pendant 15 min.
   4. Lavez les J2 stériles en distribuant de l’eau du robinet stérile à travers le tamis. Répétez cette étape 3 fois. Lors du lavage final, inclinez le tamis de manière à ce que les nématodes s’accumulent à la bordure du tamis. Récupérer la suspension de nématodes stériles en pipetant 1 mL d’eau ultrapure stérile dans la bordure du tamis et l’entreposer à 11 °C ou l’utiliser immédiatement.
      REMARQUE : Le succès de la stérilisation peut être évalué en plaquant une aliquote de 100 μL de la suspension de nématode dans un milieu SH et en surveillant régulièrement, pendant 1 semaine, la contamination par rapport à la contamination.
   5. Dans la hotte, sous-culturer une touffe de 1 g de racines transgéniques de pomme de terre (comme décrit à l’étape 2.1.11.) sur des plaques SH avec 100 nématodes stériles (100 μL d’une suspension avec 1000 J2s par mL). Après 2 à 3 semaines, de petites galles commencent à apparaître dans les nouvelles racines.
   6. Suivez régulièrement la co-culture sous un microscope inversé (100x), et lorsque les masses d’œufs commencent à être perceptibles, sous-cultivez dans une nouvelle plaque de milieu SH semi-solide, en vous assurant que les galles sont prélevées avec la touffe de racines (Figure 4). Conservez les co-cultures sous une routine mensuelle de sous-culture à 25 °C dans l’obscurité.

3. Analyse structurelle de l’infection par les NPP

REMARQUE : Pour suivre les changements induits par les NPP dans la structure des tissus radiculaires, des techniques de coloration histochimique sont utilisées pour contraster les tissus ayant des compositions chimiques différentes. La coloration différentielle est réalisée dans des masses racinaires ou dans de fines sections de matériel racinaire fixe, où des colorants spécifiques réagissent avec le tissu cible en fonction de leur affinité chimique²¹. Pour le protocole actuel, nous avons utilisé de la fuchsine acide, ou réactif de Schiff acide périodique (PAS) combiné à des colorants O bleu de toluidine pour la coloration différentielle.

1. Distribution des nématodes parasites des plantes dans les racines colorées à la fuchsine acide
   REMARQUE : Pour suivre la distribution des PPN dans tout le système racinaire, la fuchsine acide est utilisée pour colorer le tissu musculaire du nématode dans une teinte rouge⁵.
   1. Commencez par laver le système racinaire sous l’eau courante du robinet pendant 5 min pour éliminer tous les débris de sol (racines de plantes in vivo ) ou les résidus du milieu de culture (racines transgéniques in vitro ). Utilisez vos doigts dans un mouvement circulaire pour aider à détacher le sol du système racinaire.
   2. Coupez le système racinaire en tronçons de 1 à 2 cm de long et placez-le dans un bécher de 150 ml. Distribuer 70 ml d’une solution d’hypochlorite de sodium (NaOCl) à 1,5 % et mélanger vigoureusement pendant 4 minutes pour éliminer les tissus racinaires. Ensuite, jetez la solution de NaOCl, rincez les racines à l’eau courante du robinet et faites-les tremper pendant 15 minutes dans de l’eau déminéralisée pour éliminer les résidus de NaOCl²².
      REMARQUE : L’eau de Javel contient un minimum de 5,25 % de NaOCl, alors ajoutez 20 ml d’eau de Javel à 50 ml d’eau pour obtenir une solution de NaOCl à 1,5 %. Pour les matériaux plus mous (par exemple, les tissus plus mous de jeunes racines ou de racines transgéniques cultivées in vitro ), utilisez une solution de NaOCl à 0,9 %, tandis que pour les matériaux plus durs (racines lignifiées plus anciennes), une solution de NaOCl à 2,0 % est utilisée.
   3. Égouttez les racines dégagées et placez-les sur un bécher en verre borosilicate avec 30 mL d’eau déminéralisée. Pipeter 1 mL de solution de coloration acide fuchsin, mélanger manuellement et faire bouillir pendant 30 s sur une plaque chauffante. Laissez refroidir le bécher en verre, égouttez la solution et lavez les racines tachées à l’eau du robinet.
      REMARQUE : La solution de coloration à l’acide fuchsin est obtenue en dissolvant 3,5 g de poudre de colorant fuchsin acide dans 250 ml d’acide acétique et en ajoutant 750 ml d’eau déminéralisée. La coloration est toujours suivie d’une étape de décoloration pour éliminer les taches en excès inutilisées et améliorer le contraste de l’échantillon.
   4. Décolorer en ajoutant 10 à 30 mL de glycérine acidifiée avec quelques gouttes de HCl (5N)¹³.
   5. Observez au stéréomicroscope ou au microscope inversé pour évaluer grossièrement où dans la structure racinaire les PPN attaquent préférentiellement (Figure 5 et Figure 6).
2. Évaluation de la morphologie des cellules racinaires à l’aide de l’acide périodique Schiff (PAS)/bleu de toluidine O
   REMARQUE : L’influence de l’infection par les NPP ou des dommages à la morphologie des cellules racinaires peut être évaluée au microscope en fixant, sectionnant et colorant différentiellement les racines de pommes de terre infectées.
   1. Dans un flacon d’échantillon fermé, fixer la racine fraîche avec du glutaraldéhyde à 2,5 %, préparée dans un tampon de phosphate de sodium 0,1 M, à un pH de 7,2, pendant 24 à 48 h, à température ambiante⁶.
      ATTENTION : Le glutaraldéhyde est toxique. Évitez l’inhalation et le contact. Utilisez une blouse de laboratoire et des gants de protection et travaillez dans une hotte. Les flacons d’échantillon doivent être fermés, sauf lors d’un rinçage ou d’une procédure sous vide. Éliminer le glutaraldéhyde conformément aux règles des procédures relatives aux déchets dangereux. Les étapes 3.2.1 à 3.2.5 sont effectuées dans une hotte pour éviter l’inhalation de réactifs.
      REMARQUE : Pour préparer 1 L de tampon de phosphate de sodium, pH 7,2, ajouter 68,4 mL de 1M Na₂HPO₄ (141,96 g dans 1 L de solution) à 31,6 mL de 1M NaH₂PO₄ (119,98 g dans 1 L de solution) et remplir jusqu’à 1 L en ajoutant 900 mL d’eau déminéralisée. Pour faciliter l’infiltration du fixateur, placez les flacons d’échantillon non bouchés avec du matériel racinaire sous un vide faible (26 mm Hg) pendant 2 min dans un dessiccateur relié à une pompe à vide.
   2. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, jeter la solution fixatrice et laver les racines fixées avec un tampon de phosphate de sodium (3x).
   3. Commencer à déshydrater progressivement le tissu racinaire fixé en remplaçant le tampon par une solution d’éthanol à 10 % (v/v) pendant 15 min. Ensuite, remplacez avec une solution d’éthanol à 20 % à l’aide d’une pipette en verre et gardez les racines enfoncées pendant 15 min. Poursuivez la succession graduelle des concentrations croissantes d’éthanol (30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % et 90 % pendant 15 minutes chacune) jusqu’à l’étape de l’éthanol pur, où les racines doivent être conservées pendant 1 h.
   4. Encastrer progressivement les racines déshydratées dans de la résine (méthacrylate de 2-hydroxyéthyle). À l’aide d’une pipette en verre, remplacer l’éthanol pur par une solution d’éthanol/résine 3:1 (v/v) et conserver pendant 24 h à 4 °C. Poursuivez avec des solutions d’éthanol/résine 1:1 et 1:3 (v/v), chacune avec une période d’incubation de 24 h à 4 °C. Ensuite, remplacer la solution 1:3 (v/v) par de la résine pure complétée par du peroxyde de dibenzoyle (1 %) comme initiateur de polymérisation.
   5. Placez les échantillons dans un bac à résine, ajoutez un mélange résine :diméthylsulfoxyde 15:1 (v/v) et maintenez à 60 °C sur une plaque chauffante pendant 48 h pour que la résine durcisse.
   6. Placez les échantillons imprégnés dans un microtome rotatif équipé d’un couteau en tungstène et coupez des sections de 2 à 5 μm sur des lames de verre, conformément aux instructions du fabricant.
   7. Commencer la coloration différentielle en immergeant les lames pendant 10 min dans un bocal en verre avec une solution de 2,4-dinitrophénylhydrazine à 15 % dans de l’acide acétique, à température ambiante. Ensuite, laver soigneusement à l’eau courante du robinet pendant 15 min et sécher au four à 60 °C (15 min).
   8. Ensuite, plongez les lames dans de l’acide périodique (1 %) pendant 10 min, puis lavez-les à l’eau courante du robinet pendant 5 minutes et laissez-les sécher dans un four à 60 °C (15 min).
   9. Immerger les lames dans le réactif de Schiff (composé de 1 % de pararosaniline et de 4 % de métabisulfite de sodium, dans de l’acide chlorhydrique 0,25 M), pendant 30 min. Ensuite, laver avec une solution de métabisulfite de sodium (0,5 %) dans de l’acide chlorhydrique (0,05 M), pendant 2 min. Répéter 3 fois. Enfin, laver à l’eau courante du robinet pendant 5 minutes et sécher à température ambiante.
   10. Pour le contraste, colorez en immergeant les lames dans du bleu de toluidine 0,05 % O pendant 15 min, en les lavant à l’eau courante du robinet pendant 15 min et en les faisant sécher dans un four à 60 °C (15 min).
   11. Observez au microscope (100x) équipé d’un matériel de capture d’images (Figure 7).

Résultats

Les disques de carotte peuvent être utilisés pour multiplier et maintenir plusieurs types de NPP migrateurs²³. Pour le RLN, cette technique est généralement utilisée pour conserver des collections de référence d’espèces ou d’isolats de nématodes. À l’aide de disques de carottes, on peut obtenir une augmentation moyenne de 100 fois des populations de nématodes sur une période de 3 mois (figure 1). Cependant, le nombre...

Discussion

L’étude des mécanismes d’infection et de développement des maladies chez les plantes attaquées par les NPP du sol est difficile car ces phytoparasites infectent généralement les tissus internes du système racinaire et induisent des symptômes non spécifiques dans les pousses. Malgré les conditions environnementales contrôlées de la serre, la germination des tubercules de pomme de terre et la croissance des plants de pomme de terre sont toujours favorisées au printemps et ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-Dinitrophenylhydrazine	Sigma-Aldrich	D199303
2-Hydroxyethyl methacrylate	Sigma-Aldrich	17348
Acetic acid	Sigma-Aldrich	695092
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129
Benzoyl peroxide	Sigma-Aldrich	B5907
borosilicate glass beaker	Sigma-Aldrich	Z231827
Carbenicillin disodium salt	Sigma-Aldrich	C3416
Cefotaxime sodium salt	Sigma-Aldrich	C7039
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301
Ethanol	Supelco	1.00983
Fertilizer	Compo Expert
Flower pot 5 L	VWR	470049-676
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	354400
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Kanamycin monosulfate	Sigma-Aldrich	BP861
LB Broth with agar	Sigma-Aldrich	L3147
MCE syringe filter	Millipore	SLGSR33SS
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Pararosaniline hydrochloride	Sigma-Aldrich	P3750
Periodic acid	Sigma-Aldrich	P0430
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
Schiff′s reagent	Sigma-Aldrich	1.09033
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	161519
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011
Soil / Substrate	Compo Sana
Stainless Steel Tweezers	Sigma-Aldrich	22435-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161