זיהום in vivo ו-In vitro של שורשי תפוחי אדמה בנמטודות טפיליות צמחיות להערכת שינויים מבניים מושרים

Summary

הפרוטוקול מתאר זיהום של שורשי Solanum tuberosum בנמטודות טפיליות של צמחים בתנאי חממה in vivo ושורשים טרנסגניים של תפוחי אדמה במבחנה לניתוח היסטוכימי של מבנה השורשים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית.

Abstract

נמטודות טפיליות של צמחים השוכנים בקרקע (PPNs) הן מזיקים חשובים לתפוחי אדמה הגורמים לנגעים ו/או משנים את מבנה שורשי הצמח, מה שמוביל לירידה בכושר היבול ובפרודוקטיביות. מחקר על המנגנונים התאיים והתת-תאיים של זיהום והתפתחות PPN יכול לפנות לצמחי שדה או שתילים בתנאי חממה. מחקרי שדה מייצגים יותר סביבות טבעיות אך נתונים לתנאים סביבתיים בלתי צפויים שיכולים להשפיע מאוד על תוצאות המחקר. מחקרי חממה מאפשרים שליטה גבוהה יותר על משתנים סביבתיים ובטיחות גבוהה יותר מפני מזהמים או פתוגנים. עם זאת, בחלק מהפונדקאים, המגוון הגנטי הופך לגורם חשוב של שונות ומשפיע על התגובה המורכבת של הפונדקאי-טפיל. פיתחנו תרביות מבחנה של שורשים טרנסגניים עם PPNs כחלופה אמינה שתופסת פחות מקום, דורשת פחות זמן להשגה, ונקייה מזיהום או משונות גנטית של המארח. תרבויות משותפות מתקבלות על ידי החדרת PPNs אספטיים לשורשים טרנסגניים במבחנה . ניתן לתחזק אותם ללא הגבלת זמן, מה שהופך אותם לתמיכה מצוינת בשמירת אוספים של PPNs ייחוס. בעבודה הנוכחית, מפורט פרוטוקול לזיהום מבוקר של שורשי תפוחי אדמה in vivo עם נמטודת נגע השורש ולהקמת תרביות משותפות במבחנה של שורשים טרנסגניים של תפוחי אדמה עם נמטודת קשר השורש. התרבויות המשותפות במבחנה סיפקו פרוקסי מעבדתי למצב הזיהום הטבעי של תפוחי האדמה ויצרו שלבי חיים של נמטודות ללא קשר לעונה או לתנאי האקלים. בנוסף, המתודולוגיה המשמשת לניתוח מבני מפורטת באמצעות היסטוכימיה ומיקרוסקופיה אופטית. צבע פוקסין החומצה משמש למעקב אחר אתרי התקפת נמטודות על שורשים, בעוד צביעה דיפרנציאלית עם חומצה תקופתית-שיף (PAS) וכחול טולואידין O מדגישה מבני נמטודות ברקמת השורש הפנימית של תפוחי האדמה.

Introduction

גידולי שורש ופקעות מדורגים^{במקום הרביעי} בין מזונות היסוד החשובים ביותר בעולם. תפוח אדמה (Solanum tuberosum L.) הוא אחת הפקעות המעובדות החשובות ביותר. מקורו בהרי האנדים בדרום אמריקה, אך לאחר שהובא לאירופה במאה^ה-16 הפך במהירות למקור המזון הנפוץ ביותר עבור אוכלוסייה בעלת הכנסה נמוכה יותר. כיום, תפוחי אדמה מהווים 1.7% מצריכת הקלוריות בעולם¹. ייצור היבולים מושפע מאוד ממזיקים ופתוגנים צמחיים, מתוכם נמטודות טפיליות צמחיות (PPNs) עלולות לגרום לאובדן יבול ממוצע שעולה עד 12%². נמטודות טפיליות של צמחים אחראיות לכמה מהמחלות המזיקות ביותר ליבולים בחקלאות המודרנית. PPNs שוכני קרקע מטילים הפסדים כבדים לחקלאים מכיוון שהם משפיעים על שורשי הצמחים ומפריעים לפריון היבול על ידי הפחתת הייצור ו/או פגיעה במוצרים, מה שהופך אותם לבלתי סחירים³. הפיטופרזיטים המסוכנים האלה משתמשים בסטילט שלהם (חלק פה דמוי מחט) כדי לנקב תאי שורש ולהזין את תכולת התאים. חלק מה-PPN ניזונים מחוץ לשורשים, אחרים נכנסים לשורש וגורמים לנזק לרקמות (נודד), בעוד שאחרים נכנסים לשורשים והופכים לישיבה, ומשנים מאוד את מבנה השורש כדי להקל^{על הזנה}. ה-PPNs העיקריים המשפיעים על תפוחי האדמה הם נמטודות ציסטה של תפוחי אדמה, Globodera spp., נמטודות קשרי שורש (RKN), Meloidogyne spp., נמטודות נגע שורש, Pratylenchus spp., נמטודת קשר שורש כוזבת Nacobbus aberrans, ונמטודת ריקבון תפוחי האדמה Ditylenchus destructor. עבור PPNs אלה, הרגלי אכילה שונים גורמים לשינויים מבניים שונים ברקמות השורש המארח ^5,6. מחקר על מנגנוני זיהום PPN ותגובת המארח מבוצע לעתים קרובות באמצעות ניסויי שדה או חממה כדי לשמור על אוספי תרביות PPN ייחוס או לבצע ניסויים בקנה מידה גדול ^7,8. בדיקה בתנאים טבעיים מושפעת מאוד משונות סביבתית ומגורמי לחץ ביוטיים או אביוטיים. בדיקות ביולוגיות של חממה הן אלטרנטיבה קרובה יותר למצב טבעי תוך מתן שליטה יחסית בשונות הסביבתית והגבלת ההשפעה של לחץ אביוטי וביוטי. עם זאת, המגוון הגנטי של המארח עדיין יכול להוות אתגר לניסויים הדורשים שליטה עדינה יותר בשונות הביולוגית. ניתן להתגבר על מגבלות אלו על ידי שימוש בתרביות רקמת צמחים במבחנה. אלו הן מערכות מעבדה רב-תכליתיות עם יתרונות רבים לחקר מחלת PPNs. עבור PPNs שוכני אדמה, תרביות מבחנה של שורשים טרנסגניים הן כלי שימושי למחקר בתנאי מעבדה ^9,10.

שורשים טרנסגניים, או שורשים שעירים (HR), מתקבלים לאחר הדבקה של חומר צמחי בריזוביום ריזוגנס (Riker et al. 1930) Young et al. 2001¹¹. חיידק גרם שלילי זה גורם להעברה של פלסמיד ה-Ri שלו לגנום המארח ומשנה את הוויסות של ביוסינתזה של הורמונים צמחיים, ומקדם את היווצרות רקמת השורש¹². ניתן לשמור על שורשים טרנסגניים ללא הגבלת זמן תחת אספסיס במדיום תרבותי. היתרונות של שימוש ב-HR לחקר PPNs הם קצב גידול גבוה בהיעדר מווסתי גדילה של צמחים המשפיעים על זיהום והתפתחות נמטודות, יחס גבוה של ייצור ביומסה ליחידת זמן, ושלמות תאית ואריכות ימים, הקובעים יציבות גנטית וביוכימית גבוהה יותר⁶. על ידי שימוש בשורשים טרנסגניים במבחנה, ניתן לשמור על גנוטיפים של PPNs ללא הגבלת זמן בתנאי מעבדה, לעקוב בקלות אחר זיהום והתפתחות PPNs, להפחית את השונות הגנטית של המארח, ניתן לקשר ישירות מניפולציה של ההרכב המולקולרי של המארח לתגובת הנמטודה, וניתן לעקוב בצורה מדויקת יותר אחר שינויים מבניים של מארח וטפיל ^6,13. למחקרים על מחלות PPN של תפוחי אדמה, תרביות שורש טרנסגניות במבחנה מאפשרות ביצוע ניסויים ללא תלות בעונה או בתרדמת פקעת תפוחי אדמה.

בפרוטוקול זה מפורטת המתודולוגיה המסורתית של תחזוקת PPNs וזיהום in vivo של צמחי תפוחי אדמה. לניתוח מבני של שורשים נגועים, מפורטת גם מתודולוגיה משופרת המבוססת על הקמת תרביות משותפות במבחנה של שורשי תפוחי אדמה טרנסגניים עם PPNs כחלופה המאפשרת שליטה גבוהה יותר בשונות הגנטית הסביבתית והמארח. כדי לעקוב אחר זיהום והתפתחות PPNs ברקמת השורש, נעשה שימוש בהיסטוכימיה כדי לסייע בתצפית PPNs במיקרוסקופיה אופטית. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לייעל את המחקר של אינטראקציות PPN-מארח, להבטיח תנאים מבוקרים וניתנים לשחזור יותר לניסויים תוך הקלה על ניתוחים מבניים והתפתחותיים מפורטים של נמטודות ברקמת השורש.

Protocol

1. זיהום של צמחי תפוחי אדמה שגדלו בחממה

הערה: ניסויי חממה מבוצעים עם השעיות של PPNs בשלבי חיים מעורבים או צעירים בשלב שני (J2), בהתאם למחזור החיים הספציפי של מזיק ה-PPN. עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש בתרחיפים של שלבי חיים מעורבים של נמטודת נגע השורש (RLN) Pratylenchus penetrans . ניתן לגדל PPN במעבדה או לבקש ממעבדות ייחוס מוסמכות.

1. כפל ותחזוקה של נמטודות נגע שורש
   הערה: דיסקי גזר מעוקרים משמשים להכפלה ותחזוקה של RLNs¹⁴. השתמש בגזר שנרכש באופן מסחרי (var. Nice) ללא נזק נראה לעין כדי להפחית את הזיהום המיקרוביאלי. רצוי שהם יהיו נקיים מחומרי הדברה כדי למנוע עיכוב בהתפתחות RLN.
   1. שטפו את הגזר במי ברז זורמים כדי להסיר פסולת גדולה יותר, ולאחר מכן, עם תמיסת ניקוי נפוצה (טיפה אחת לכל 40 מ"ל מים) כדי להסיר פסולת עדינה יותר. יבש עם מגבות נייר מעבדה.
   2. מתחת לאפסיס, במכסה המנוע האנכי, הכנס שיפוד מתכת מעוקר בחלק העליון של הגזר (1 עד 2 ס"מ פנימה) כך שניתן יהיה להחזיק אותו ביתר קלות.
   3. בעזרת בקבוק כביסה עם זרבובית, הרטיבו את הגזר באתנול 96% (v/v). כתם את הקצה התחתון של הגזר בנייר פילטר מעוקר וקח אותו בזהירות ללהבה.
      זהירות: שימו לב שאתנול נדלק חזק, אז עמדו במרחק.
   4. מקלפים את הגזר מלמעלה למטה בעזרת קולפן סטרילי ואז חוזרים על השלב הקודם. השליכו את החלקים העליונים והתחתונים (2 ס"מ פנימה) והניחו את החלק האמצעי של הגזר בצלחת פטרי סטרילית (קוטר 150 מ"מ). בעזרת להב סטרילי ופינצטה, חותכים בזהירות חלקים בעובי 1 ס"מ מהחלק בקוטר של כ-2 ס"מ של הגזר (איור 1).
   5. העבירו את החלקים לצלחות פטרי סטריליות (קוטר 60 מ"מ) ואטמו את הגבול בסרט שקוף. בעזרת אור UV, עקרו את פני דיסקי הגזר למשך 60 דקות מכל צד.
   6. שמור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שבועות בחושך והשליך את כל דיסקי הגזר שמתחילים להראות סימנים של זיהום מיקרוביאלי¹⁵.
      הערה: סימנים גלויים לזיהום הם השחמה מוגזמת (ריקבון), הצטברות נוזלים בגבול התחתון של דיסק הגזר או צמיחת תפטיר פטרייתי על פני השטח.
   7. דיסקי הגזר הנותרים מוכנים להידבק במתלי RLN. התחל בביצוע חתך בצורת X במרכז דיסק הגזר באמצעות להב סטרילי. הקפידו לחתוך רק באמצע הדרך.
   8. חיסון ה-RLN על ידי פיפטינג של 50 מיקרוליטר של תרחיף המכיל לפחות 50 שלבי חיים מעורבים במרכז הפצע בצורת X. סוגרים את צלחת הפטרי ואטומים את הגבול בניילון שקוף כדי למנוע התייבשות.
      1. קבע את המספר הממוצע של נמטודות בתרחיף על ידי ספירת חמש אליקוטות של 50 מיקרוליטר תחת סטריאומיקרוסקופ דו-עיני (40x) בטמפרטורת החדר בשקופית קעורה. הגדר את ההשעיה של RLNs מעורבים בשלב החיים ל-1000 למ"ל על ידי הוספת מים לתרחיף או המתנה לנמטודות להתיישבות (כ-60 דקות) והורדת הנפח על ידי סילוק המים העיליים.
   9. שמור את דיסקי הגזר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, בחושך, עד 3 חודשים ועקוב מדי שבוע תחת סטריאומיקרוסקופ דו-עיני לאיתור סימנים לנגעים נמקיים, כתוצאה מגידול אוכלוסיית RLN.
      הערה: ניתן לאחסן דיסקי גזר טפיליים בהצלחה ב-11 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר עד חודשיים, אך בדוק באופן קבוע אם יש זיהום מיקרוביאלי. דיסקיות גזר טפיליות המראים סימנים של זיהום מיקרוביאלי חייבות להיות מטוהרות על ידי חיטוי לפני השלכתן.
   10. מתחת למכסה המנוע, חלץ RLNs על ידי העברת דיסקי גזר עם נמק רקמה גלוי באתר החיסון (איור 1) לקוטר 8 ס"מ ומסננת רשת של 75 מיקרומטר המונחת בקערת זכוכית סטרילית. השאירו מרווח קטן של 1 ס"מ בין תחתית המסננת לקעור הקערה כדי לאסוף את ה- RLNs.
       הערה: בהיעדר מסננת שנרכשה מסחרית, ניתן ליצור מצינור פלסטיק בקוטר 8 ס"מ / פלסטיק יציבה וגזה רשת הדוקה. השתמש בגומיות כדי להדק את הגזה לצינור הפלסטיק או לכוס.
   11. יוצקים תמיסת אנטיביוטיקה למסננת עד שדיסקי הגזר מכוסים ושומרים למשך 12 שעות (לילה) בחושך. ה-RLNs יוצאים מדיסקיות הגזר ומתיישבים בתחתית הקערה. יש להכין את תמיסת האנטיביוטיקה באופן זמני עם המיצוי על ידי הוספת 50 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד של קנמיצין וקרבניצילין במים מזוקקים מעוקרים¹⁶.
       הערה: תמיסות מלאי אנטיביוטיקה מוכנות ב-50 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 0.5 גרם קנמיצין מונוסולפט או 0.5 גרם קרבניצילין דיסודיום כל אחד ב-10 מ"ל מים מזוקקים מעוקרים. תמיסות מלאי מסוננות (רשת μm 0.22) במכסה הזרימה וניתן לשמור אותן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שנה.
   12. הסר את המסננת, השתמש בפיפטה מזכוכית מעוקרת כדי לשאוב את ה-RLNs מתחתית הקערה לתוך גוש כתמים מזכוכית מעוקרת (4 ס"מ על 4 ס"מ על 1 ס"מ), ושטוף על ידי פיפטינג של 1 מ"ל של תמיסת אנטיביוטיקה. המתן 30 עד 40 דקות עד שהנמטודות ישקעו לפני איסוף תמיסת האנטיביוטיקה המשומשת. חזור על הכביסה הזו 4x-5x.
   13. השתמש מיד בתרחיף המימי עם ה-RLNs או שמור אותו ב-11 מעלות צלזיוס לתקופת אחסון ארוכה יותר (עד חודשיים).
2. זיהום in vivo של צמחי תפוחי אדמה עם PPNs
   הערה: כדי לגדל צמחי תפוחי אדמה רגישים (S. tuberosum var. Désirée), יש לרכוש תפוחי אדמה זרעים מוסמכים מסוחרי חקלאות בין ינואר למרץ. בחר תפוחי אדמה זרעים מוסמכים מכיוון שהם נמכרים עם דרכון פיטוסניטרי, מה שמבטיח שהם אינם מזוהמים בפיטופרזיטים בהסגר. כאמצעי זהירות, ניתן לבצע שלב ראשוני של חיטוי בתמיסת אקונומיקה של 10% ואחריו שטיפה במי ברז זורמים כדי להבטיח חיטוי של משטח פקעת תפוחי האדמה. תפוחי אדמה ממוסחרים נפוצים אינם מומלצים מכיוון שהטיפולים המוטלים להפחתת הנביטה והמרץ עלולים להפריע לצמיחת תפוחי האדמה ולתגובה לזיהום.
   1. בחר פקעות תפוחי אדמה בגודל זהה והשליך את אלה עם חורים, חבורות או חלקים רכים יותר. הסר בעדינות את כל הנבטים הגדלים (1 מ"מ) לפני הזריעה כדי לסנכרן את הנביטה.
      הערה: במידת הצורך, יש לאחסן את תפוחי האדמה במקום מאוורר היטב, יבש וחשוך לפני הזריעה.
   2. ממלאים סירים של 5 ליטר (22 ס"מ על 18 ס"מ) בתערובת 1:1 של אדמה חיטוי וחול גס דק מעורבב עם 22.5 גרם דשן NPK בשחרור איטי (12-12-12) וזורעים את תפוחי האדמה בגובה 9 ס"מ מתחת לפני האדמה.
      הערה: יש לנפות אדמה וחול כדי להסיר פסולת גדולה מ-2 מ"מ, לבצע חיטוי פעמיים ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולייבש ב-100 מעלות צלזיוס למשך יום עד יומיים, עם ערבוב תכוף. יש לאוורר במשך 7-10 הימים הבאים על ידי ערבוב תכוף, לפני השימוש.
   3. שמור את העציצים בחממה בתנאים לחים (50%-70% לחות) ומים לעתים קרובות (שמור על האדמה ב-70% יכולת החזקת מים מקסימלית), הימנע מקיצוניות בטמפרטורה, עד שיורה של צמח תפוחי אדמה מתחיל לצוץ על פני האדמה.
   4. לאחר הופעת הצמח, השתמש בתרחיפים RLN טריים כדי להדביק את שורשי תפוחי האדמה. התחל ביצירת 4 עד 6 חורים (ברוחב 1 ס"מ) המפוזרים באופן שווה סביב הצמח לעומק הזרע.
   5. פיפטה באופן שווה תרחיף של 8 מ"ל של 30,000 RLNs חיים בשלב החיים המעורבים לתוך החורים, כך שהחיסון יהיה ביחס של 4 RLNs חיים לכל גרם של תערובת אדמה, ולכסות בתערובת אדמה. עבור העציצים עם RLNs, מנע השקיה ביום החיסון.
      הערה: RLNs נספרים תחת סטריאומיקרוסקופ (פי 40). נמטודות מתות אינן זזות ובעלות צורה מורחבת, בעוד שנמטודות חיות בדרך כלל נעות (צורה לא מורחבת). הדחיפה הפיזית משמשת כדי לברר את התמותה.
   6. שמור את הסירים למשך חודשיים בתנאים שתוארו לעיל (איור 2). לאחר מכן, עקרו את צמחי תפוחי האדמה ושקלו את הקלעים והשורשים בנפרד.
   7. שטפו בזהירות את מערכת השורשים לפני בדיקת המיקום של אתרי התקפת RLN באמצעות טכניקות צביעה⁵.

2. הקמת תרבויות משותפות במבחנה של שורשים טרנסגניים של תפוחי אדמה עם PPNs

1. הקמת in vitro שורשים טרנסגניים של תפוחי אדמה
   הערה: עבור פרוטוקול זה, השתמשנו ב- Rhizobium rhizogenes נושא את gus גן מדווח משולב בפלסמיד Ri ומונע על ידי מקדם כפול 35S (A4pRiA4::70GUS)¹⁷. ניתן לרכוש חיידקים ממקורות מסחריים או לבקש ממעבדות ייחוס מוסמכות.
   1. כדי להשיג חיידקים בשלב הגידול האקספוננציאלי, מורחים צלחת R. rhizogenes בצלחת בינונית מוצקה של Luria-Bertani (LB)¹⁸ ושומרים למשך הלילה ב-26 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לרכוש מדיום LB באופן מסחרי או להכין אותו במעבדה על ידי הוספת 10 גרם/ליטר פפטון, 5 גרם/ליטר תמצית שמרים, 10 גרם/ליטר NaCl ו-15 גרם/ליטר אגר ולאחר מכן עיקור בקיטור למשך 15 דקות ב-121 מעלות צלזיוס.
   2. בעזרת לולאת חיסון, בחר מושבה וחסן 10 מ"ל מרק LB נוזלי (מדיום LB ללא אגר) בבקבוק סטרילי של 50 מ"ל. יש לשמור למשך הלילה בחושך בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס תחת ערבוב (180 סל"ד).
   3. מדוד את ספיגת התרבות הנוזלית עד ש- A₆₀₀ מגיע ל -0.6. בשלב זה, החיידקים נמצאים בשלב הגידול האקספוננציאלי ומשמשים לחיסון החומר הצמחי.
   4. החיסון מתבצע בפקעות תפוחי אדמה טריות אספטיות. כדי לעקר את פני פקעות תפוחי האדמה, התחל בשטיפה במי ברז זורמים כדי להסיר פסולת גדולה יותר, ולאחר מכן עם תמיסת ניקוי נפוצה (טיפה אחת לכל 40 מ"ל מים), עם תסיסה נמרצת, כדי להסיר את הפסולת העדינה יותר.
      הערה: בחר זן תפוחי אדמה עם רגישות ידועה ל-PPN בשימוש. עבור פרוטוקול זה, השתמשנו ב-S. tuberosum var. Désirée.
   5. מניחים את הפקעות במיכל, מכסים בתמיסת אקונומיקה מסחרית (1:4, אקונומיקה מסחרית במי ברז) וסוגרים. יש לערבב במשך 15 דקות, להשליך את תמיסת האקונומיקה ולשטוף 3 פעמים במי ברז מעוקרים.
   6. במכסה המנוע, טבלו את הפקעות בתמיסת אתנול (80%, v/v) למשך 15 דקות בתסיסה נמרצת, השליכו את האתנול ושטפו 3x במי ברז מעוקרים.
   7. בעזרת אזמל סטרילי, הסר את החלקים ההיקפיים של הפקעות (כ-50% מהפקעת מהמשטח פנימה), וחתך את החלק המרכזי הפנימי למקטעים בעובי 0.5 ס"מ¹⁹. יש לחסן מיד עם תרחיף החיידקים שהוכן בשלב 2.1.3.
   8. לחיסון, יש לדלל את תרחיף החיידקים על ידי הוספת 1 מ"ל של תרחיף חיידקי ל-9 מ"ל של מדיום שנק והילדברנדט²⁰ (SH) בתוספת 30 גרם/ליטר סוכרוז ב-pH = 5.6. טובלים את קצה האזמל הסטרילי בתרחיף המדולל ופוצעים את פני פלח תפוחי האדמה. חזור על שלב זה פי 5 עבור כל פלח תפוחי אדמה.
   9. יבש את מקטעי הלחות העודפת בנייר סינון סטרילי למשך דקה אחת, הנח אותם במדיום SH מוצק למחצה (מדיום SH עם 30 גרם/ליטר סוכרוז, 8 גרם/ליטר אגר, pH = 5.6) ושמור בחושך ב-25 מעלות צלזיוס כדי שתתרחש טרנספקציה של פלסמיד.
   10. לאחר 3 ימים, העבירו את המקטעים הנגועים לצלחות של מדיום SH מוצק למחצה בתוספת 150 מיקרוגרם/מ"ל של כל אחד מהספוטקסים והקרבניצילין של האנטיביוטיקה. יש לשמור מעל 3 חודשים עם חידוש בינוני שבועי כדי להבטיח את חיסול החיידקים.
       הערה: ניתן להכין תמיסת מלאי Cefotaxime ב-100 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 1 גרם נתרן cefotaxime ב-10 מ"ל של מים דה-מינרליים סטריליים וסינון (רשת 0.22 מיקרומטר) מתחת למכסה המנוע. ניתן לשמור אנטיביוטיקה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שנה.
   11. לאחר 3 חודשים, צמיחת שורשים טרנסגנית היא נרחבת. העבירו את השורשים למדיום SH טרי ומוצק למחצה ללא אנטיביוטיקה על ידי איסוף גוש שורש של 1 גרם עם קצות פינצטה סטרילית והנחתו במרכז מדיום התרבית בצלחת חדשה (איור 3).
       הערה: כחודש לאחר ההדבקה, מופיעות מסות קטנות של צמיחת תאים על פני השטח של פלח תפוחי האדמה, משם מתחילים להתפתח השורשים הטרנסגניים⁶. הקפד לשמור אותם בקשר עם מדיום התרבות אחרת הם עלולים להתייבש.
   12. כדי להבטיח יציבות גנטית ומטבולית, שמור על שורשים טרנסגניים תחת שגרת תת-תרבית חודשית (כמתואר בשלב 2.1.11.) ב-25 מעלות צלזיוס בחושך במשך למעלה משנה לפני הדבקה ב-PPNs.
       הערה: ודא שלפחות שישה שכפולים נשמרים בכל שלב של הפרוטוקול מכיוון שלעתים קרובות מתרחש זיהום מיקרוביאלי לא רצוי. לאחר הקמתה, צלחת תרבית משותפת אחת יכולה לשמש כחיסון למספר תרבויות משותפות חדשות; עם זאת, הקפד לשמור לפחות שש צלחות משוכפלות.
2. הקמת תרביות מבחנה של שורשי תפוחי אדמה מהונדסים עם PPNs
   הערה: כדי להשיג תרביות משותפות של שורשים טרנסגניים עם PPNs, תהליך עיקור הנמטודות הוא קריטי. עבור הפרוטוקול הנוכחי השתמשנו בצעירים בשלב השני של נמטודת קשר השורש בהסגר Meloidogyne chitwoodi. ניתן להשיג חיסון נמטודה ממעבדות עיון מוסמכות בצורה של עפצי שורש.
   1. תחת סטריאומיקרוסקופ דו-עיני (20x), בודדו מסות ביצי נמטודה מעפצי השורש בעזרת פינצטה סטרילית עדינה במיוחד. מניחים המוני ביצים בצלחת פטרי מכוסה עם 5 מ"ל מי ברז סטריליים ונותנים לביצים לבקוע במשך 48 שעות. הגדר את מתלה J2 ל-100 נמטודות למ"ל.
   2. במכסה המנוע, פיפטה 5 מ"ל של מתלה המכיל 500 J2 למסננת סטרילית של רשת 20 מיקרומטר ושטוף במי ברז סטריליים.
   3. טבלו את המחצית התחתונה של המסננת המכילה את ה-J2s בתמיסה של 20% מי חמצן (H₂O₂), וערבבו ידנית בתנועה סיבובית למשך 15 דקות.
   4. שטפו את ה-J2s הסטריליים על ידי הוצאת מי ברז סטריליים דרך המסננת. חזור על שלב זה 3 פעמים. בכביסה הסופית, הטה את המסננת כך שהנמטודות יתאספו בגבול המסננת. שחזר את תרחיף הנמטודה הסטרילית על ידי פיפטינג של 1 מ"ל מים סטריליים אולטרה-טהורים בגבול המסננת, ואחסן בטמפרטורה של 11 מעלות צלזיוס או השתמש מיד.
      הערה: ניתן להעריך את הצלחת העיקור על ידי ציפוי של 100 מיקרוליטר של תרחיף הנמטודה במדיום SH וניטור קבוע, במשך שבוע, לזיהום.
   5. במכסה הזרם, תת-תרבית גוש של 1 גרם של שורשים טרנסגניים של תפוחי אדמה (כמתואר בשלב 2.1.11.) על לוחות SH עם 100 נמטודות סטריליות (100 מיקרוליטר של תרחיף עם 1000 J2s למ"ל). לאחר שבועיים עד שלושה מתחילים להופיע עפצים קטנים בשורשים החדשים.
   6. עקבו אחר התרבות המשותפת באופן קבוע תחת מיקרוסקופ הפוך (פי 100), וכאשר מסת הביצים מתחילות להיות מורגשות, תת-תרבית לצלחת בינונית SH מוצקה למחצה חדשה, וודאו שהעפצים נלקחים עם גוש השורש (איור 4). שמרו על תרבויות משותפות תחת שגרת תת-תרבויות חודשית בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך.

3. ניתוח מבני של זיהום PPNs

הערה: כדי לעקוב אחר שינויים שנגרמו על ידי PPNs במבנה רקמת השורש, נעשה שימוש בטכניקות צביעה היסטוכימיות כדי להנגיד רקמות עם הרכבים כימיים שונים. צביעה דיפרנציאלית מתבצעת במסות שורשים או בקטעים דקים של חומר שורש קבוע, כאשר צבעים ספציפיים מגיבים עם רקמת המטרה בהתאם לזיקתם הכימית²¹. עבור הפרוטוקול הנוכחי, השתמשנו בפוקסין חומצי, או מגיב חומצה תקופתי (PAS) בשילוב עם צבעי O כחולים טולואידין לצביעה דיפרנציאלית.

1. התפלגות נמטודות טפיליות צמחיות בשורשים מוכתמים בפוקסין חומצי
   הערה: כדי לעקוב אחר התפלגות ה-PPN בכל מערכת השורשים, משתמשים בפוקסין חומצי כדי לצבוע את רקמת שריר הנמטודה בגוון אדום⁵.
   1. התחל בשטיפת מערכת השורשים מתחת למי ברז זורמים למשך 5 דקות כדי להסיר כל פסולת אדמה (שורשי צמחים in vivo ) או שאריות של מדיום התרבות (שורשים טרנסגניים במבחנה ). השתמש באצבעותיך בתנועה סיבובית כדי לסייע בניתוק האדמה ממערכת השורשים.
   2. חותכים את מערכת השורשים לחלקים באורך 1 עד 2 ס"מ ומניחים אותה בתוך של 150 מ"ל. יש להוציא 70 מ"ל של תמיסת נתרן היפוכלוריט (NaOCl) של 1.5% ולערבב במרץ במשך 4 דקות לניקוי רקמות השורש. לאחר מכן, השליכו את תמיסת ה-NaOCl, שטפו את השורשים במי ברז זורמים והשרו למשך 15 דקות במים דה-מינרליים כדי להסיר שאריות^{NaOCl 22}.
      הערה: אקונומיקה כלור מכילה מינימום של 5.25% NaOCl, לכן הוסף 20 מ"ל אקונומיקה כלור ל-50 מ"ל מים כדי לקבל תמיסת NaOCl של 1.5%. עבור חומר רך יותר (למשל, רקמה רכה יותר של שורשים צעירים או של שורשים טרנסגניים שגדלו במבחנה ) השתמש בתמיסת NaOCl של 0.9%, בעוד שעבור חומר קשה יותר (שורשים ישנים יותר) נעשה שימוש בתמיסת NaOCl של 2.0%.
   3. מסננים את השורשים המנוקים ומניחים אותם על זכוכית בורוסיליקט עם 30 מ"ל מים דה-מינרליים. פיפטה 1 מ"ל תמיסת כתם פוקסין חומצה, מערבבים ידנית ומרתיחים 30 שניות על פלטה חמה. תנו לכוס הזכוכית להתקרר, נקזו את התמיסה ושטפו את השורשים המוכתמים במי ברז זורמים.
      הערה: תמיסת כתם פוקסין חומצה מיוצרת על ידי המסת 3.5 גרם אבקת צבע פוקסין חומצה ב-250 מ"ל חומצה אצטית והוספת 750 מ"ל מים דה-מינרליים. לאחר הצביעה תמיד מגיע שלב מניעה כדי להסיר כתמים עודפים שאינם בשימוש ולשפר את ניגודיות הדגימה.
   4. הימנעו על ידי הוספת 10-30 מ"ל גליצרין מחומצן עם כמה טיפות של HCl (5N)¹³.
   5. התבונן תחת הסטריאומיקרוסקופ או המיקרוסקופ ההפוך כדי להעריך בערך היכן במבנה השורש ה-PPNs תוקפים באופן מועדף (איור 5 ואיור 6).
2. הערכת מורפולוגיה של תאי שורש עם חומצה תקופתית-שיף (PAS)/כחול טולואידין O
   הערה: ניתן להעריך את ההשפעה של זיהום PPNs או נזק למורפולוגיה של תאי שורש תחת המיקרוסקופ על ידי קיבוע, חתך וצביעה דיפרנציאלית של שורשי תפוחי אדמה נגועים.
   1. בבקבוקון דגימה סגור, תקן חומר שורש טרי עם 2.5% גלוטרלדהיד, שהוכן במאגר נתרן פוספט 0.1 M, ב-pH 7.2, למשך 24-48 שעות, בטמפרטורת החדר⁶.
      אזהרה: גלוטרלדהיד רעיל. הימנע משאיפה ומגע. השתמש במעיל מעבדה מגן וכפפות ועבוד במכסה אדים. יש לסגור בקבוקונים לדוגמה אלא אם כן בשטיפה או בהליכי ואקום. השלך גלוטרלדהיד בהתאם לכללי נהלי פסולת מסוכנת. שלבים 3.2.1 עד 3.2.5 מבוצעים במכסה אדים כדי למנוע שאיפת ריאגנטים.
      הערה: להכנת 1 ליטר של מאגר נתרן פוספט, pH 7.2, הוסף 68.4 מ"ל של 1M Na₂HPO₄ (141.96 גרם בתמיסה של 1 ליטר) ל-31.6 מ"ל של 1M NaH₂PO₄ (119.98 גרם בתמיסה של 1 ליטר) ומלא עד 1 ליטר על ידי הוספת 900 מ"ל מים דה-מינרליים. כדי לסייע בחדירה של הקיבוע, הנח את בקבוקוני הדגימה הלא מכוסים עם חומר שורש מתחת לוואקום נמוך (26 מ"מ כספית) למשך 2 דקות בחומר ייבוש המחובר למשאבת ואקום.
   2. בעזרת פיפטת פסטר מזכוכית, השליכו את התמיסה המקובעת ושטפו שורשים קבועים עם מאגר נתרן פוספט (פי 3).
   3. התחל לייבש בהדרגה את רקמת השורש המקובעת על ידי החלפת המאגר בתמיסת אתנול של 10% (v/v) למשך 15 דקות. לאחר מכן, החליפו בתמיסת אתנול של 20% באמצעות פיפטת זכוכית, ושמרו על השורשים מוטבעים למשך 15 דקות. המשך ברצף המדורג של הגדלת ריכוזי האתנול (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ו-90% למשך 15 דקות כל אחד) עד לשלב האתנול הטהור, שם יש לשמור את השורשים למשך שעה.
   4. הטמיעו את השורשים המיובשים בהדרגה בשרף (2-הידרוקסיאתיל מתאקרילט). בעזרת פיפטת זכוכית, החלף את האתנול הטהור בתמיסת אתנול/שרף 3:1 (v/v) ושמור למשך 24 שעות ב-4 מעלות צלזיוס. עקוב אחר זה עם תמיסות אתנול/שרף 1:1 ו-1:3 (v/v), כל אחת עם תקופת דגירה של 24 שעות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן החלף את תמיסת ה-1:3 (v/v) בשרף טהור בתוספת דיבנזואיל פרוקסיד (1%) כיוזם פילמור.
   5. הניחו את הדגימות במגש תבנית שרף, הוסיפו תערובת שרף: דימתיל סולפוקסיד 15:1 (v/v), ושמרו בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס על פלטה חמה למשך 48 שעות כדי שהשרף יתקשה.
   6. הניחו את הדגימות הספוגות במיקרוטום סיבובי המצויד בסכין טונגסטן ופרסו חלקים של 2-5 מיקרומטר על שקופיות זכוכית, לפי הוראות היצרן.
   7. התחל את הצביעה הדיפרנציאלית על ידי טבילת השקופיות למשך 10 דקות בצנצנת צביעה מזכוכית עם תמיסת 15% 2,4-dinitrophenylhydrazine בחומצה אצטית, בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש לשטוף בזהירות מתחת למי ברז זורמים למשך 15 דקות ולייבש בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס (15 דקות).
   8. לאחר מכן, טבלו את המגלשות בחומצה תקופתית (1%) למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטפו תחת מי ברז זורמים למשך 5 דקות והשאירו לייבוש בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס (15 דקות).
   9. טבלו את השקופיות במגיב של שיף (המורכב מ-1% פרוסאנילין ו-4% נתרן מטאביסולפיט, בחומצה הידרוכלורית של 0.25 M), למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו עם תמיסת נתרן מטאביסולפיט (0.5%) בחומצה הידרוכלורית (0.05 מ'), למשך 2 דקות. לבסוף שוטפים במי ברז זורמים למשך 5 דקות, ומייבשים בטמפרטורת החדר.
   10. לעומת זאת, יש לצבוע על ידי טבילת השקופיות ב-0.05% טולואידין כחול O למשך 15 דקות, שטיפה במי ברז זורמים למשך 15 דקות וייבוש בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס (15 דקות).
   11. התבוננו תחת מיקרוסקופ (100x) המצויד בחומרת לכידת תמונה (איור 7).

תוצאות

ניתן להשתמש בדיסקי גזר כדי להכפיל ולתחזק מספר סוגים של PPNs נודדים²³. עבור RLN, טכניקה זו משמשת בדרך כלל לשמירה על אוספי ייחוס של מיני נמטודות או מבודדים. באמצעות דיסקיות גזר ניתן להשיג גידול ממוצע של פי 100 באוכלוסיות הנמטודות בתקופה של 3 חודשים (איור 1

Discussion

חקר מנגנוני הזיהום והתפתחות המחלות בצמחים המותקפים על ידי PPNs שוכני קרקע הוא קשה מכיוון שפיטוטפילים אלה בדרך כלל מדביקים את הרקמות הפנימיות של מערכת השורשים וגורמים לתסמינים לא ספציפיים ביורה. למרות התנאים הסביבתיים המבוקרים של החממה, הנבטת פקעות תפוחי אדמה וגידול צמחי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-Dinitrophenylhydrazine	Sigma-Aldrich	D199303
2-Hydroxyethyl methacrylate	Sigma-Aldrich	17348
Acetic acid	Sigma-Aldrich	695092
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129
Benzoyl peroxide	Sigma-Aldrich	B5907
borosilicate glass beaker	Sigma-Aldrich	Z231827
Carbenicillin disodium salt	Sigma-Aldrich	C3416
Cefotaxime sodium salt	Sigma-Aldrich	C7039
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301
Ethanol	Supelco	1.00983
Fertilizer	Compo Expert
Flower pot 5 L	VWR	470049-676
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	354400
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Kanamycin monosulfate	Sigma-Aldrich	BP861
LB Broth with agar	Sigma-Aldrich	L3147
MCE syringe filter	Millipore	SLGSR33SS
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Pararosaniline hydrochloride	Sigma-Aldrich	P3750
Periodic acid	Sigma-Aldrich	P0430
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
Schiff′s reagent	Sigma-Aldrich	1.09033
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	161519
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011
Soil / Substrate	Compo Sana
Stainless Steel Tweezers	Sigma-Aldrich	22435-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161