Заражение корней картофеля паразитическими нематодами in vivo и in vitro для оценки индуцированных структурных изменений

Резюме

В протоколе описано заражение корней Solanum tuberosum паразитическими нематодами растений в тепличных условиях in vivo и трансгенных корней картофеля in vitro для гистохимического анализа структуры корней с помощью оптической микроскопии.

Аннотация

Почвенные паразитические нематоды растений (ППН) являются серьезными вредителями картофеля, которые вызывают поражения и/или изменяют корневую структуру растений, что приводит к снижению приспособленности и продуктивности урожая. Исследования клеточных и субклеточных механизмов заражения и развития PPN могут проводиться с использованием полевых растений или рассады в тепличных условиях. Полевые исследования более репрезентативны для природной среды, но подвержены непредсказуемости условий окружающей среды, которые могут сильно повлиять на результаты исследований. Исследования в теплицах позволяют лучше контролировать переменные окружающей среды и повысить безопасность против загрязняющих веществ или патогенов. Однако у некоторых хозяев генетическое разнообразие становится важным фактором изменчивости и влияет на комплексную реакцию хозяин-паразит. Мы разработали in vitro кокультуры трансгенных корней с PPN в качестве надежной альтернативы, которая занимает меньше места, требует меньше времени для получения и не подвержена загрязнению или генетической изменчивости хозяина. Кокультуры получают путем введения асептических ППН в трансгенные корни in vitro . Они могут поддерживаться бесконечно, что делает их отличным подспорьем для хранения коллекций эталонных PPN. В настоящей работе подробно описан протокол контролируемого заражения корней картофеля in vivo корневой нематодой и создания in vitro кокультур трансгенных корней картофеля с корневой узловой нематодой. Сокультуры in vitro обеспечивали лабораторный показатель естественной инфекции картофеля и образовывали стадии жизни нематод независимо от сезона или климатических условий. Кроме того, методология, используемая для структурного анализа, детализирована с помощью гистохимии и оптической микроскопии. Кислотный краситель фуксин используется для отслеживания мест атаки нематод на корнях, в то время как дифференциальное окрашивание периодической кислотой-Шиффом (PAS) и толуидиновым синим O выделяет структуры нематод во внутренней ткани корня картофеля.

Введение

Корнеплоды и клубнеплоды занимают^{4-е место} среди самых важных продуктов питания в мире. Картофель (Solanum tuberosum L.) является одним из важнейших культивируемых клубней. Он берет свое начало в горах Анд в Южной Америке, но после того, как был завезен в Европу в 16^веке, быстро стал самым распространенным источником пищи для населения с более низким доходом. Сегодня картофель составляет 1,7% от^{мирового потребления} калорий1. Растениеводство сильно страдает от вредителей и патогенов растений, из которых паразитические нематоды растений (ППН) могут вызывать средние потери урожая, которые увеличиваются до 12%². Паразитические нематоды на растениях являются причиной некоторых из наиболее разрушительных болезней сельскохозяйственных культур в современном сельском хозяйстве. Почвенные ППН наносят большие убытки фермерам, поскольку они воздействуют на корни растений и снижают урожайность, снижая производство и/или нанося вред продуктам, делая их непригодными для продажи³. Эти опасные фитопаразиты используют свой стилет (игольчатый ротовой аппарат) для прокола клеток корня и питаются их содержимым. Некоторые PPN питаются извне корней, другие проникают в корень и вызывают повреждение тканей (мигрируют), в то время как третьи проникают в корни и становятся малоподвижными, сильно изменяя структуру корней для облегчения питания⁴. Основными ППН, поражающими картофель, являются картофельные цистообразующие нематоды, Globodera spp., галловые нематоды (RKN), Meloidogyne spp., корневые нематоды поражения, Pratylenchus spp., ложноузловатая нематода Nacobbus aberrans и картофельная гнилостная нематода Ditylenchus destructor. Для этих PPN различные пищевые привычки вызывают различные структурные изменения в тканях корня хозяина ^5,6. Исследования механизмов инфицирования PPN и реакции хозяина часто проводятся в полевых или тепличных испытаниях для поддержания коллекций эталонных культур PPN или для проведения крупномасштабных экспериментов ^7,8. Тестирование в естественных условиях сильно зависит от изменений окружающей среды, а также биотических или абиотических стрессовых факторов. Тепличные биотесты являются более близкой альтернативой естественным условиям, позволяя при этом относительно контролировать изменения окружающей среды и ограничивая влияние абиотического и биотического стресса. Тем не менее, генетическое разнообразие хозяина все еще может быть проблемой для испытаний, требующих более тонкого контроля биологической изменчивости. Эти ограничения можно преодолеть, прибегнув к культурам тканей растений in vitro. Это универсальные лабораторные системы, обладающие многими преимуществами для исследования заболеваний ППН. Для почвенных ППН, культур трансгенных корней in vitro являются полезным инструментом для исследований в лабораторных условиях ^9,10.

Трансгенные корни, или волосистые корни (HR), образуются после заражения растительного материала Rhizobium rhizogenes (Riker et al. 1930) Young et al. 2001¹¹. Эта грамотрицательная бактерия индуцирует трансфекцию своей Ri-плазмиды в геном хозяина и изменяет регуляцию биосинтеза растительных гормонов, способствуя образованию корневой^ткани12. Трансгенные корни могут сохраняться в течение неограниченного времени под асептикой в культуральной среде. Преимуществами использования HR для изучения PPN являются высокая скорость роста при отсутствии регуляторов роста растений, влияющих на заражение и развитие нематод, высокий коэффициент производства биомассы в единицу времени, а также клеточная целостность и долголетие, определяющие более высокую генетическую и биохимическую стабильность⁶. Прибегая к трансгенным корням in vitro, генотипы PPN могут поддерживаться в лабораторных условиях в течение неограниченного времени, можно легко отслеживать инфекцию и развитие PPN, можно снизить генетическую изменчивость хозяина, манипуляции с молекулярным составом хозяина могут быть напрямую связаны с реакцией нематоды, а структурные изменения хозяина и паразита могут быть более точно прослежены ^6,13. Для исследований болезней ППН картофеля трансгенные сокультуры корней in vitro позволяют проводить эксперименты независимо от сезона или покоя клубней картофеля.

В данном протоколе подробно описана традиционная методика поддержания ППН и заражения растений картофеля in vivo . Для структурного анализа инфицированных корней также подробно описана усовершенствованная методология, основанная на создании in vitro сокультур трансгенных корней картофеля с PPN, в качестве альтернативы, которая позволяет лучше контролировать окружающую среду и генетическую изменчивость хозяина. Для отслеживания инфекции и развития ППН в тканях корня используется гистохимия, помогающая в наблюдении ППН с помощью оптической микроскопии. Общая цель данного протокола заключается в оптимизации изучения взаимодействий PPN и хозяина, обеспечении более контролируемых и воспроизводимых условий для экспериментов и одновременном облегчении детального структурного анализа и анализа развития нематод в ткани корня.

протокол

1. Заражение растений картофеля, выращенных в теплицах

ПРИМЕЧАНИЕ: Тепличные испытания проводятся с суспензиями PPN на смешанных стадиях жизни или на второй стадии молоди (J2), в зависимости от конкретного жизненного цикла вредителя PPN. Для этого протокола использовали суспензии смешанных стадий жизни корневой нематоды поражения (РЛН) Pratylenchus penetrans . PPN могут быть выращены в лаборатории или запрошены в сертифицированных референс-лабораториях.

1. Размножение и поддержание корневых поражений нематод
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизованные морковные диски используются для размножения и поддержания RLN¹⁴. Используйте коммерчески приобретенную морковь (var. Nice) без видимых повреждений, чтобы уменьшить микробное загрязнение. Предпочтительно, чтобы они не содержали пестицидов, чтобы не препятствовать развитию RLN.
   1. Промойте морковь в проточной водопроводной воде, чтобы удалить более крупный мусор, а затем обычным раствором моющего средства (1 капля на 40 мл воды), чтобы удалить более мелкие загрязнения. Высушите лабораторными бумажными полотенцами.
   2. Под асептикой, в вытяжку с вертикальным потоком, вставьте стерилизованную металлическую шпажку на верхнюю часть моркови (от 1 до 2 см внутрь), чтобы ее было легче держать.
   3. С помощью промывочной бутылки с насадкой намочите морковь 96% (v/v) этанолом. Промокните нижний кончик моркови в стерилизованной фильтровальной бумаге и осторожно поднесите ее к пламени.
      ВНИМАНИЕ: Имейте в виду, что этанол сильно воспламеняется, поэтому стойте на расстоянии.
   4. Очистите морковь сверху вниз с помощью стерильной овощечистки, а затем повторите предыдущий шаг. Выбросьте верхнюю и нижнюю части (на 2 см внутрь) и установите среднюю часть моркови в стерильную чашку Петри (диаметром 150 мм). С помощью стерильного лезвия и пинцета аккуратно отрежьте отрезки толщиной 1 см от части моркови диаметром примерно 2 см (Рисунок 1).
   5. Переложите срезы в стерильные чашки Петри (диаметр 60 мм) и заклейте границу прозрачной пленкой. С помощью ультрафиолетового излучения простерилизовать поверхность морковных дисков в течение 60 минут с каждой стороны.
   6. Хранить при температуре 25 °C в течение 1-2 недель в темноте и выбросить все морковные диски, на которых начинают проявляться признаки микробного загрязнения¹⁵.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Видимыми признаками загрязнения являются чрезмерное потемнение (гниение), скопление жидкости в нижней границе морковного диска или рост грибкового мицелия на поверхности.
   7. Оставшиеся морковные диски готовы к заражению суспензиями RLN. Начните с того, что сделайте Х-образный надрез в центре морковного диска с помощью стерильного лезвия. Обязательно режьте только наполовину вглубь.
   8. Инокулировать RLN путем пипетирования 50 мкл суспензии, содержащей не менее 50 смешанных жизненных стадий, в центре Х-образной раны. Закройте чашку Петри и заклейте границу прозрачной пленкой, чтобы избежать высыхания.
      1. Определить среднее количество нематод в суспензии путем подсчета пяти аликвот по 50 мкл под бинокулярным стереомикроскопом (40x) при комнатной температуре в вогнутом предметном стекле. Установите суспензию смешанных РЛН на стадии жизни на 1000 на мл, добавив воду в суспензию или дождавшись, пока нематоды осядут (примерно 60 мин), и уменьшите объем путем сцеживания поверхностных вод.
   9. Храните морковные диски при температуре 25 °C, в темноте, до 3 месяцев и еженедельно наблюдайте под бинокулярным стереомикроскопом на предмет признаков некротических поражений, являющихся результатом роста популяции RLN.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешно зараженные морковные диски можно хранить при температуре 11 °C для последующего использования до 2 месяцев, но регулярно проверяйте их на микробное загрязнение. Паразитированные морковные диски с признаками микробной инфекции должны быть обеззаражены путем автоклавирования перед утилизацией.
   10. Извлеките RLN под проточный колпак путем переноса морковных дисков с видимым некрозом тканей в месте инокуляции (рис. 1) на сито диаметром 8 см и ячеистым размером 75 мкм, установленное в стерильной стеклянной миске. Оставьте небольшой зазор в 1 см между дном сита и вогнутостью чаши для сбора RLN.
       ПРИМЕЧАНИЕ: При отсутствии коммерчески приобретенного сита, его можно изготовить из пластиковой трубки диаметром 8 см / прочного пластикового стаканчика и плотной сетчатой марли. С помощью резиновых лент закрепите марлю на пластиковой трубке или чашке.
   11. Налейте в сито раствор антибиотика, пока морковные диски не покроются, и выдержите 12 часов (на ночь) в темноте. RLN выходят из морковных дисков и оседают на дне миски. Раствор антибиотиков следует готовить непосредственно с экстракцией путем добавления по 50 мкг/мл канамицина и карбенициллина в стерилизованную дистиллированную воду¹⁶.
       Исходные растворы антибиотиков готовят из расчета 50 мг/мл путем растворения 0,5 г канамицина моносульфата или 0,5 г карбенициллина динатрия в 10 мл стерилизованной дистиллированной воды. Исходные растворы фильтруются (0,22 мкм меш) в проточном колпаке и могут храниться при температуре -20 °C до 1 года.
   12. Снимите сито, с помощью стерилизованной стеклянной пипетки наберите RLN со дна миски в стерилизованный стеклянный краситель (4 см x 4 см x 1 см) и промойте пипетированием 1 мл раствора антибиотика. Подождите от 30 до 40 минут, пока нематоды осядут, прежде чем собирать использованный раствор антибиотика. Повторите эту стирку 4-5 раз.
   13. Используйте водную суспензию вместе с RLN немедленно или храните ее при температуре 11 °C в течение более длительного срока хранения (до 2 месяцев).
2. Заражение растений картофеля ППН in vivo
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для выращивания восприимчивых растений картофеля (S. tuberosum var. Désirée) сертифицированный семенной картофель должен быть приобретен у агродилеров в период с января по март. Выбирайте сертифицированный семенной картофель, потому что он продается с фитосанитарным паспортом, гарантирующим, что он не заражен карантинными фитопаразитами. В качестве меры предосторожности можно провести начальный этап дезинфекции 10% раствором отбеливателя с последующей промывкой в проточной воде из-под крана, чтобы обеспечить дезинфекцию поверхности клубней картофеля. Обычный коммерческий картофель не рекомендуется, так как обработка, применяемая для снижения прорастания и силы, может помешать росту картофеля и реакции на инфекцию.
   1. Выбирайте клубни картофеля одинакового размера и выбрасывайте те, у которых есть дыры, помятости или более мягкие срезы. Аккуратно удалите все подросшие ростки (1 мм) перед посевом, чтобы синхронизировать прорастание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости храните семенной картофель в хорошо проветриваемом, сухом и темном месте перед посевом.
   2. Заполните горшки объемом 5 л (22 см x 18 см) смесью автоклавной почвы и мелкого крупнозернистого песка в соотношении 1:1, смешанной с 22,5 г удобрения NPK с медленным высвобождением (12-12-12) и посейте картофель на глубине 9 см от поверхности почвы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Почву и песок следует просеять для удаления мусора размером более 2 мм, автоклавировать 2x при 121 °C в течение 15 минут и высушить при 100 °C в течение 1-2 дней, с частым перемешиванием. Проветривайте в течение следующих 7-10 дней, часто перемешивая, перед использованием.
   3. Держите горшки в теплице во влажных условиях (влажность 50%-70%) и часто поливайте (поддерживайте максимальную водоудерживающую способность почвы 70%), избегая перепадов температур, пока на поверхности почвы не начнут появляться ростки картофельных растений.
   4. После появления всходов растений используйте свежеизвлеченные суспензии RLN для заражения корней картофеля. Начните с создания равномерно распределенных от 4 до 6 отверстий (шириной 1 см) вокруг растения на глубину семени.
   5. Равномерно внесите в отверстия 8 мл суспензии 30 000 живых РЛН смешанной стадии жизни так, чтобы инокулюм был в соотношении 4 живых РЛН на г почвенной смеси, и накройте почвенной смесью. Для горшков с RLN воздержитесь от полива в день прививки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: РЛН подсчитываются под стереомикроскопом (40x). Мертвые нематоды неподвижны и имеют вытянутую форму, в то время как живые нематоды обычно подвижны (невытянутая форма). Физическое подталкивание используется для установления смертности.
   6. Держите горшки в течение 2 месяцев в условиях, описанных выше (рисунок 2). После этого вырвите с корнем растения картофеля и взвесьте побеги и корни отдельно.
   7. Тщательно промойте корневую систему перед проверкой местоположения мест атаки RLN с помощью методов окрашивания⁵.

2. Создание in vitro сокультур трансгенных корней картофеля с ППН

1. Установление in vitro трансгенные корни картофеля
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола мы использовали Rhizobium rhizogenes Переноска gus репортерный ген, коинтегрированный в плазмиду Ri и управляемый двойным промотором 35S (A4pRiA4::70GUS)¹⁷. Бактерии могут быть получены из коммерческих источников или запрошены в сертифицированных референс-лабораториях.
   1. Чтобы получить бактерии в фазе экспоненциального роста, разложите планшет R. rhizogenes в твердой средней пластине Лурии-Бертани (LB)¹⁸ и выдержите в течение ночи при температуре 26 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среду LB можно приобрести в коммерческих целях или приготовить в лаборатории путем добавления 10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl и 15 г/л агара, а затем стерилизации паром в течение 15 мин при 121 °C.
   2. С помощью петли посева выберите колонию и введите 10 мл жидкого бульона LB (среда LB без агара) в стерильную колбу объемом 50 мл. Оставить на ночь в темноте при температуре 26 °C при перемешивании (180 об/мин).
   3. Измеряйте абсорбцию жидкой культуры до тех пор, пока A₆₀₀ не достигнет 0,6. На этой стадии бактерии находятся в фазе экспоненциального роста и используются для инокуляции растительного материала.
   4. Инокуляцию проводят в асептические клубни свежего картофеля. Чтобы простерилизовать поверхность клубней картофеля, начните с промывки в проточной водопроводной воде для удаления более крупного мусора, а затем с помощью обычного раствора моющего средства (1 капля на 40 мл воды) при энергичном перемешивании, чтобы удалить более мелкие остатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите сорт картофеля с известной восприимчивостью к используемым ППН. Для этого протокола мы использовали S. tuberosum var. Désirée.
   5. Поместите клубни в контейнер, залейте раствором товарного известителя (1:4, коммерческий отбеливатель в водопроводной воде) и закройте. Перемешайте в течение 15 минут, утилизируйте раствор отбеливателя и 3 раза промойте стерилизованной водой из-под крана.
   6. В проточной колпаке погрузите клубни в раствор этанола (80%, v/v) на 15 минут с энергичным перемешиванием, утилизируйте этанол и промойте 3 раза стерилизованной водой из-под крана.
   7. С помощью стерильного скальпеля удалите периферийные участки клубней (примерно 50% клубня от поверхности внутрь), а внутренний центральный кусочек разделите на¹⁹ сегментов толщиной 0,5 см. Немедленно введите бактериальную суспензию, приготовленную на шаге 2.1.3.
   8. Для посева бактериальную суспензию разбавляют, добавляя 1 мл бактериальной суспензии к 9 мл среды Schenk and Hildebrandt²⁰ (SH) с добавлением 30 г/л сахарозы при pH = 5,6. Окуните кончик стерильного скальпеля в разведенную суспензию и обмотайте поверхность картофельного сегмента. Повторите этот шаг 5 раз для каждого сегмента картофеля.
   9. Сегменты избыточной влажности высушить в стерильной фильтровальной бумаге в течение 1 мин, поместить в полутвердую среду SH (среда SH с сахарозой 30 г/л, агаром 8 г/л, pH = 5,6) и держать в темноте при температуре 25 °C для проведения трансфекции плазмид.
   10. Через 3 дня перенесите инфицированные сегменты в планшеты с полутвердой средой SH с добавлением по 150 мкг/мл цефотаксима и карбенициллина каждого антибиотика. Хранить более 3 месяцев с еженедельным обновлением среды для обеспечения элиминации бактерий.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковый раствор цефотаксима можно приготовить при концентрации 100 мг/мл путем растворения 1 г цефотаксима натрия в 10 мл стерильной деминерализованной воды и фильтрации (0,22 мкм меш) под проточным колпаком. Антибиотики можно хранить при температуре -20 °C до 1 года.
   11. Через 3 месяца рост трансгенных корней становится обширным. Переложите корни в свежую полутвердую среду SH без антибиотиков, собрав кончиками стерильного пинцета комок корня массой 1 г и поместив его в центр питательной среды в новой тарелке (рис. 3).
       Примечание: Примерно через 1 месяц после заражения на поверхности картофельного сегмента появляются небольшие массы клеточного роста, откуда^{начинают развиваться} трансгенные корни. Обязательно держите их в контакте с питательной средой, иначе они могут высохнуть.
   12. Чтобы обеспечить генетическую и метаболическую стабильность, храните трансгенные корни в рамках ежемесячного режима субкультуры (как описано в шаге 2.1.11.) при температуре 25 °C в темноте в течение более 1 года перед инфекцией PPN.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что на каждом этапе протокола сохраняется не менее шести повторов, поскольку часто происходит нежелательное микробное загрязнение. После создания одна сокультуральная пластина может быть использована в качестве инокулята для нескольких новых сокультур; Тем не менее, обязательно сохраните не менее шести репликационных пластин.
2. Создание in vitro кокультур трансгенных корней картофеля с PPN
   Примечание: Для получения кокультур трансгенных корней с PPN процесс стерилизации нематод имеет решающее значение. Для настоящего протокола использовали молодь второй стадии карантинной галловой нематоды Meloidogyne chitwoodi. Инокулюмент нематоды можно получить в сертифицированных референс-лабораториях в виде корневых галлов.
   1. Под бинокулярным стереомикроскопом (20х) изолировать яичные массы нематоды из галлов корней стерильным ультратонким пинцетом. Поместите яичные массы в закрытую чашку Петри с 5 мл стерильной водопроводной воды и дайте яйцам вылупиться в течение 48 часов. Установите суспензию J2 на 100 нематод на мл.
   2. В проточный колпак нанесите 5 мл суспензии, содержащей 500 Дж2, в стерильное стерильное сито размером 20 мкм и промойте стерильной водопроводной водой.
   3. Погрузите нижнюю половину сита, содержащего J2, в 20 % раствор перекиси водорода (H₂O₂) и перемешайте вручную круговыми движениями в течение 15 минут.
   4. Промойте стерильные J2, пропустив стерильную воду из-под крана через сито. Повторите этот шаг 3 раза. При окончательной промывке наклоните сито так, чтобы нематоды собрались на границе сита. Восстановите стерильную суспензию нематоды путем пипетирования 1 мл стерильной сверхчистой воды на границе сита и храните при температуре 11 °C или используйте немедленно.
      Примечание: Успех стерилизации можно оценить, поместив 100 мкл аликвоты суспензии нематоды в среду SH и регулярно контролируя загрязнение в течение 1 недели.
   5. В проточном колпаке субкультурируют 1 г пучка трансгенных корней картофеля (как описано в шаге 2.1.11.) на SH-планшетах со 100 стерильными нематодами (100 мкл суспензии с 1000 J2s на мл). Через 2 – 3 недели в новых корнях начинают появляться мелкие галлы.
   6. Регулярно следите за сокультурой под перевернутым микроскопом (100x), и когда массы яиц начнут становиться заметными, подкультивируйте в новую полутвердую среднюю пластину SH, убедившись, что галлы взяты вместе с комком корня (рис. 4). Сокультуры должны проходить ежемесячный режим субкультуры при температуре 25 °C в темноте.

3. Структурный анализ инфекции ППН

ПРИМЕЧАНИЕ: Для отслеживания вызванных ППН изменений в структуре тканей корня используются методы гистохимического окрашивания для контрастирования тканей с различным химическим составом. Дифференциальное окрашивание проводится в корневых массах или в тонких срезах неподвижного корневого материала, где специфические красители реагируют с целевой тканью в соответствии с их химическим сродством²¹. Для настоящего протокола мы использовали кислотный фуксин или периодический кислотный реагент Шиффа (PAS) в сочетании с толуидиновыми синими О-красителями для дифференциального окрашивания.

1. Распространение паразитических нематод растений в корнях, окрашенных кислым фуксином
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проследить за распределением PPN по корневой системе, кислотный фуксин используется для окрашивания мышечной ткани нематоды в красный оттенок⁵.
   1. Начните с промывания корневой системы под проточной водой из-под крана в течение 5 минут, чтобы удалить любые остатки почвы (корни растений in vivo ) или остатки питательной среды (трансгенные корни in vitro ). Используйте пальцы круговыми движениями, чтобы помочь отделить почву от корневой системы.
   2. Разрежьте корневую систему на участки длиной от 1 до 2 см и поместите ее внутрь стакана объемом 150 мл. Дозируйте 70 мл 1,5 % раствора гипохлорита натрия (NaOCl) и энергично перемешивайте в течение 4 минут, чтобы очистить ткани корня. После этого утилизируйте раствор NaOCl, промойте корни в проточной водопроводной воде и замочите на 15 минут в деминерализованной воде, чтобы удалить остатки NaOCl²².
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хлорный отбеливатель содержит минимум 5,25% NaOCl, поэтому добавьте 20 мл хлорного отбеливателя в 50 мл воды, чтобы получить 1,5% раствор NaOCl. Для более мягкого материала (например, более мягких тканей молодых корней или трансгенных корней, выращенных in vitro ) используют 0,9% раствор NaOCl, в то время как для более твердого материала (старые одревесневшие корни) используют 2,0% раствор NaOCl.
   3. Слейте воду с очищенных корней и установите их на стакан из боросиликатного стекла с 30 мл деминерализованной воды. Пипеткой пипетку 1 мл раствора красителя фуксина, перемешать вручную и кипятить 30 с на горячей плите. Дайте стеклянному стакану остыть, слейте раствор и промойте испачканные корни в проточной воде из-под крана.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для окрашивания кислотой фуксина получают путем растворения 3,5 г порошка красителя фуксина в 250 мл уксусной кислоты и добавления 750 мл деминерализованной воды. За окрашиванием всегда следует этап удаления неиспользованных лишних пятен и повышения контрастности образца.
   4. Удалите пятна, добавив 10-30 мл глицерина, подкисленного несколькими каплями HCl (5N)¹³.
   5. Наблюдайте под стереомикроскопом или инвертированным микроскопом, чтобы примерно оценить, где в структуре корня PPN атакуют преимущественно (рис. 5 и рис. 6).
2. Оценка морфологии клеток корня с периодической кислотой-Шиффом (PAS)/толуидиновым синим O
   Примечание: Влияние инфекции PPN или повреждение морфологии корневых клеток можно оценить под микроскопом путем предварительной фиксации, разрезания и дифференциального окрашивания инфицированных корней картофеля.
   1. В закрытом флаконе с образцом зафиксировать свежий корневой материал с 2,5% глутаральдегидом, приготовленным в 0,1 М натрийфосфатном буфере, при рН 7,2, в течение 24-48 ч, при комнатной температуре⁶.
      ВНИМАНИЕ: Глутаральдегид токсичен. Избегайте вдыхания и контакта. Используйте защитный лабораторный халат и перчатки и работайте в вытяжном шкафу. Флаконы с образцами должны быть закрыты, за исключением случаев промывки или вакуумных процедур. Утилизируйте глутаральдегид в соответствии с правилами процедуры обращения с опасными отходами. Шаги с 3.2.1 по 3.2.5 выполняют в вытяжном шкафу во избежание вдыхания реагентов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления 1 л буфера фосфата натрия pH 7,2 добавьте 68,4 мл 1M Na₂HPO₄ (141,96 г в 1 л раствора) в 31,6 мл 1M₂PO₄ (119,98 г в 1 л раствора) и заполните до 1 л, добавив 900 мл деминерализованной воды. Чтобы облегчить инфильтрацию фиксатора, поместите незакрытые пробирки с корневым материалом в низкий вакуум (26 мм рт.ст.) на 2 минуты в эксикатор, подключенный к вакуумному насосу.
   2. С помощью стеклянной пастеровской пипетки сбросить фиксирующий раствор и промыть зафиксированные корни фосфатно-натриевым буфером (3x).
   3. Начните постепенное обезвоживание зафиксированной корневой ткани, заменяя буфер 10 % раствором этанола (v/v) в течение 15 минут. После этого замените 20% раствором этанола с помощью стеклянной пипетки и оставьте корни на 15 минут. Продолжайте поэтапную последовательность повышения концентрации этанола (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% и 90% в течение 15 мин каждая) до стадии чистого этанола, где корни должны храниться в течение 1 ч.
   4. Постепенно заделывайте обезвоженные корни в смолу (2-гидроксиэтилметакрилат). С помощью стеклянной пипетки замените чистый этанол раствором этанола/смолы в соотношении 3:1 (v/v) и выдержите в течение 24 часов при температуре 4 °C. Затем нанесите растворы этанола/смолы в соотношении 1:1 и 1:3 (v/v), каждый из которых имеет 24-часовой инкубационный период при 4 °C. После этого замените раствор 1:3 (v/v) чистой смолой с добавлением пероксида дибензоила (1%) в качестве инициатора полимеризации.
   5. Поместите образцы в формовочный лоток для смолы, добавьте смесь смолы:диметилсульфоксида 15:1 (v/v) и выдержите при температуре 60 °C на горячей плите в течение 48 часов, чтобы смола затвердела.
   6. Поместите пропитанные образцы во вращающийся микротом, оснащенный вольфрамовым ножом, и нарежьте срезы размером 2-5 мкм на предметные стекла в соответствии с инструкциями производителя.
   7. Дифференциальное окрашивание начинают с погружения предметных стекол на 10 мин в стеклянную банку для окрашивания с 15% раствором 2,4-динитрофенилгидразина в уксусной кислоте, при комнатной температуре. После этого тщательно промойте под проточной водой из-под крана в течение 15 минут и высушите в духовке при температуре 60 °C (15 минут).
   8. Затем погрузите предметные стекла в периодическую кислоту (1%) на 10 минут, а затем промойте под проточной водой из-под крана на 5 минут и оставьте сушиться в духовке при температуре 60 °C (15 минут).
   9. Погрузите предметные стекла в реагент Шиффа (состоящий из 1% парарозанилина и 4% метабисульфита натрия в 0,25 М соляной кислоте) на 30 минут. После этого промыть раствором метабисульфита натрия (0,5%) в соляной кислоте (0,05 М), в течение 2 мин. Повторить 3 раза. Наконец, промойте в проточной воде из-под крана в течение 5 минут и высушите при комнатной температуре.
   10. Для контраста окрашивание производится путем погружения предметных стекол в 0,05% толуидина синего O на 15 минут, мытья в проточной воде из-под крана в течение 15 минут и сушки в духовке при температуре 60 °C (15 минут).
   11. Наблюдайте под микроскопом (100x), оснащенным оборудованием для захвата изображений (рис. 7).

Результаты

Морковные диски могут использоваться для размножения и поддержания нескольких видов мигрирующих ППН²³. Для RLN этот метод обычно используется для поддержания эталонных коллекций видов нематод или изолятов. Используя морковные диски, можно получить в сред...

Обсуждение

Изучение механизмов инфекции и развития болезней у растений, пораженных почвенными ППН, затруднено, поскольку эти фитопаразиты обычно поражают внутренние ткани корневой системы и вызывают неспецифические симптомы у побегов. Несмотря на контролируемые условия окру?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-Dinitrophenylhydrazine	Sigma-Aldrich	D199303
2-Hydroxyethyl methacrylate	Sigma-Aldrich	17348
Acetic acid	Sigma-Aldrich	695092
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129
Benzoyl peroxide	Sigma-Aldrich	B5907
borosilicate glass beaker	Sigma-Aldrich	Z231827
Carbenicillin disodium salt	Sigma-Aldrich	C3416
Cefotaxime sodium salt	Sigma-Aldrich	C7039
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301
Ethanol	Supelco	1.00983
Fertilizer	Compo Expert
Flower pot 5 L	VWR	470049-676
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	354400
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Kanamycin monosulfate	Sigma-Aldrich	BP861
LB Broth with agar	Sigma-Aldrich	L3147
MCE syringe filter	Millipore	SLGSR33SS
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Pararosaniline hydrochloride	Sigma-Aldrich	P3750
Periodic acid	Sigma-Aldrich	P0430
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
Schiff′s reagent	Sigma-Aldrich	1.09033
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	161519
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011
Soil / Substrate	Compo Sana
Stainless Steel Tweezers	Sigma-Aldrich	22435-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161