İndüklenen Yapısal Değişikliklerin Değerlendirilmesi için Patates Köklerinin Bitki Paraziti Nematodlarla İn vivo ve İn vitro Enfeksiyonu

Özet

Protokol, Solanum tuberosum köklerinin in vivo sera koşullarında bitki parazitik nematodları ve optik mikroskopi ile kök yapısının histokimyasal analizi için patates in vitro transgenik kökleri ile enfeksiyonunu açıklar.

Özet

Toprakta yaşayan bitki paraziti nematodları (PPN'ler), lezyonlara neden olan ve/veya bitki kök yapısını değiştiren, mahsul zindeliğinin ve verimliliğinin azalmasına neden olan önemli patates zararlılarıdır. PPN'lerin enfeksiyonu ve gelişiminin hücresel ve subselüler mekanizmaları üzerine yapılan araştırmalar, sera koşullarında tarla bitkilerine veya fidelere başvurabilir. Saha çalışmaları, doğal ortamları daha iyi temsil eder, ancak araştırma sonuçlarını büyük ölçüde etkileyebilecek çevresel koşulların öngörülemezliğine maruz kalır. Sera çalışmaları, çevresel değişkenler üzerinde daha yüksek kontrol ve kirleticilere veya patojenlere karşı daha yüksek güvenlik sağlar. Bununla birlikte, bazı konakçılarda, genetik çeşitlilik önemli bir değişkenlik faktörü haline gelir ve konak-parazit kompleks tepkisini etkiler. Daha az yer kaplayan, elde etmek için daha az zaman gerektiren ve kontaminasyondan veya konakçı genetik değişkenliğinden arınmış güvenilir bir alternatif olarak PPN'lerle transgenik köklerin in vitro ko-kültürlerini geliştirdik. Ko-kültürler, in vitro transgenik kökleri barındırmak için aseptik PPN'lerin eklenmesiyle elde edilir. Süresiz olarak korunabilirler, bu da onları referans PPN koleksiyonlarını saklamak için mükemmel bir destek haline getirir. Bu çalışmada, in vivo patates köklerinin kök lezyonu nematodu ile kontrollü enfeksiyonu ve patates transgenik köklerinin kök-ur nematodu ile in vitro ko-kültürlerinin oluşturulması için bir protokol detaylandırılmıştır. İn vitro ko-kültürler, doğal patates enfeksiyonu durumu için bir laboratuvar vekili sağladı ve mevsim veya iklim koşullarından bağımsız olarak nematod yaşam evreleri üretti. Ek olarak, yapısal analiz için kullanılan metodoloji, histokimya ve optik mikroskopi kullanılarak detaylandırılmıştır. Asit fuksin boyası, köklerdeki nematod saldırı bölgelerini takip etmek için kullanılırken, Periyodik asit-Schiff (PAS) ve toluidin mavisi O ile diferansiyel boyama, patates iç kök dokusundaki nematod yapılarını vurgular.

Giriş

Kök ve yumru bitkileri, dünyanın en önemli temel gıdaları^{arasında 4}. sırada yer almaktadır. Patates (Solanum tuberosum L.) en önemli kültür yumrularından biridir. Kökeni Güney Amerika'nın And Dağları'na dayanıyordu, ancak 16^{. yüzyılda} Avrupa'ya tanıtıldıktan sonra hızla düşük gelirli nüfus için en yaygın besin kaynağı haline geldi. Günümüzde patates, dünyanın kalori alımının %1,7'sini oluşturmaktadır¹. Mahsul üretimi, bitki paraziti nematodların (PPN'ler) %12'ye kadar yükselen ortalama verim kayıplarına neden olabileceği bitki zararlıları ve patojenlerinden büyük ölçüde ^etkilenir2. Bitki paraziti nematodlar, modern tarımda ekinlere en çok zarar veren hastalıklardan bazılarından sorumludur. Toprakta yaşayan PPN'ler, bitki köklerini etkiledikleri ve üretimi azaltarak ve/veya ürünlere zarar vererek mahsul verimliliğine müdahale ederek onları pazarlanamaz hale getirdikleri için çiftçilere ağır kayıplar verir³. Bu tehlikeli fitoparazitler, kök hücreleri delmek ve hücre içeriğini beslemek için stilelerini (iğne benzeri bir ağız parçası) kullanırlar. Bazı PPN'ler köklerin dışından beslenir, diğerleri köke girer ve doku hasarına (göçmen) neden olurken, diğerleri köklere girer ve hareketsiz hale gelir, beslenmeyi kolaylaştırmak için kök yapısını büyük ölçüde değiştirir⁴. Patatesi etkileyen başlıca PPN'ler patates kist nematodları, Globodera spp., kök-ur nematodları (RKN), Meloidogyne spp., kök lezyon nematodları, Pratylenchus spp., yalancı kök-ur nematodu Nacobbus aberrans ve patates çürüklüğü nematodu Ditylenchus yıkıcısıdır. Bu PPN'ler için, farklı beslenme alışkanlıkları konak kök dokularında farklı yapısal değişikliklere neden olur ^5,6. PPN enfeksiyonu mekanizmaları ve konakçı yanıtı üzerine araştırmalar genellikle referans PPN kültür koleksiyonlarını korumak veya büyük ölçekli deneyler yapmak için tarla veya sera denemeleri yoluyla gerçekleştirilir ^7,8. Doğal koşullar altında yapılan testler, çevresel varyasyon ve biyotik veya abiyotik stres faktörlerinden güçlü bir şekilde etkilenir. Sera biyo-tahlilleri, çevresel varyasyonun göreceli bir kontrolüne izin verirken ve abiyotik ve biyotik stresin etkisini sınırlarken, doğal bir duruma daha yakın bir alternatiftir. Bununla birlikte, konakçı genetik çeşitliliği, biyolojik değişkenliğin daha hassas bir şekilde kontrol edilmesini gerektiren denemeler için hala bir zorluk olabilir. Bu sınırlamalar, in vitro bitki doku kültürlerine başvurularak aşılabilir. Bunlar, PPN hastalık araştırmaları için birçok avantaja sahip çok yönlü laboratuvar sistemleridir. Toprakta yaşayan PPN'ler için, transgenik köklerin in vitro kültürleri, laboratuvar koşullarında araştırma için yararlı bir araçtır ^9,10.

Transgenik kökler veya tüylü kökler (HR), bitki materyalinin Rhizobium rhizogenes ile enfeksiyonundan sonra elde edilir (Riker ve ark. 1930) Young ve ark. 2001¹¹. Bu gram negatif bakteri, Ri plazmidinin konakçı genomuna transfeksiyonunu indükler ve bitki hormonu biyosentezinin düzenlenmesini değiştirerek kök dokusunun oluşumunu teşvik eder¹². Transgenik kökler, bir kültür ortamında asepsi altında süresiz olarak korunabilir. PPN'leri incelemek için HR kullanmanın avantajları, nematod enfeksiyonunu ve gelişimini etkileyen bitki büyüme düzenleyicilerinin yokluğunda yüksek bir büyüme oranı, birim zamanda yüksek bir biyokütle üretim oranı ve daha yüksek bir genetik ve biyokimyasal stabiliteyi belirleyen hücresel bütünlük ve uzun ömürlülüktür⁶. İn vitro transgenik köklere başvurularak, PPNs genotipleri laboratuvar koşullarında süresiz olarak korunabilir, enfeksiyon ve PPN gelişimi kolaylıkla takip edilebilir, konak genetik değişkenliği azaltılabilir, konak moleküler yapısının manipülasyonu doğrudan nematod yanıtı ile ilişkilendirilebilir ve konak ve parazit yapısal değişiklikleri daha doğru bir şekilde takip edilebilir ^6,13. Patatesin PPN hastalıkları üzerine yapılan çalışmalar için, in vitro transgenik kök ko-kültürleri, mevsim veya patates yumrusu uyku halinden bağımsız olarak deneylerin yapılmasına izin verir.

Bu protokolde, PPN'lerin geleneksel metodolojisi patates bitkilerinin bakımı ve in vivo enfeksiyonu detaylandırılmıştır. Enfekte köklerin yapısal analizi için, PPN'lerle transgenik patates köklerinin in vitro ko-kültürlerinin oluşturulmasına dayanan gelişmiş bir metodoloji, çevresel ve konakçı genetik değişkenliğin daha yüksek kontrolüne izin veren bir alternatif olarak da detaylandırılmıştır. Kök dokusunda PPN enfeksiyonunu ve gelişimini takip etmek için, optik mikroskopi altında PPN'lerin gözlemine yardımcı olmak için histokimya kullanılır. Bu protokolün genel amacı, kök dokusundaki nematodların ayrıntılı yapısal ve gelişimsel analizlerini kolaylaştırırken, deney için daha kontrollü ve tekrarlanabilir koşullar sağlayarak, PPN-konak etkileşimlerinin çalışmasını optimize etmektir.

Protokol

1. Serada yetiştirilen patates bitkilerinin enfeksiyonu

NOT: Sera denemeleri, PPN zararlısının spesifik yaşam döngüsüne bağlı olarak, karma yaşam evrelerinde veya ikinci aşama yavrularda (J2) PPN'lerin süspansiyonları ile gerçekleştirilir. Bu protokol için, kök lezyonu nematodu (RLN) Pratylenchus penetrans'ın karışık yaşam evrelerinin süspansiyonları kullanıldı. PPN'ler laboratuvarda yetiştirilebilir veya sertifikalı referans laboratuvarlarından talep edilebilir.

1. Kök lezyonu nematodlarının çoğaltılması ve bakımı
   NOT: RLN'lerin çoğaltılması ve bakımı için sterilize edilmiş havuç diskleri kullanılır¹⁴. Mikrobiyal kontaminasyonu azaltmak için ticari olarak elde edilen havuçları (var. Nice) görünür bir hasar olmadan kullanın. Tercihen, RLN gelişimini engellememek için pestisitlerden arınmış olmalıdırlar.
   1. Daha büyük kalıntıları temizlemek için havucu akan musluk suyunda yıkayın ve daha sonra daha ince kalıntıları temizlemek için ortak bir deterjan solüsyonuyla (40 mL suya 1 damla) yıkayın. Laboratuvar kağıt havlularıyla kurulayın.
   2. Asepsi altında, dikey bir akış başlığında, daha kolay tutulabilmesi için havucun üstüne (1 ila 2 cm içeriye doğru) sterilize edilmiş bir metal şiş yerleştirin.
   3. Ağızlı bir yıkama şişesi yardımıyla havucu %96 (h/h) etanol ile ıslatın. Havucun alt ucunu sterilize edilmiş bir filtre kağıdına bulayın ve dikkatlice ateşe alın.
      DİKKAT: Etanolün güçlü bir şekilde tutuştuğunu unutmayın, bu nedenle uzakta durun.
   4. Steril bir soyucu kullanarak havucu yukarıdan aşağıya doğru soyun ve ardından önceki adımı tekrarlayın. Üst ve alt kısımları (2 cm içeriye doğru) atın ve havucun orta kısmını steril bir Petri kabına (150 mm çapında) koyun. Steril bir bıçak ve cımbız kullanarak havucun yaklaşık 2 cm çapındaki kısmından 1 cm kalınlığında bölümler dikkatlice kesin (Şekil 1).
   5. Bölümleri steril Petri kaplarına (60 mm çapında) aktarın ve kenarlığı şeffaf bir filmle kapatın. Bir UV ışığı kullanarak, havuç disklerinin yüzeyini her iki tarafta 60 dakika sterilize edin.
   6. Karanlıkta 1-2 hafta 25 °C'de tutun ve mikrobiyal kontaminasyon belirtileri göstermeye başlayan havuç disklerini atın¹⁵.
      NOT: Görünür kontaminasyon belirtileri aşırı kahverengileşme (çürüme), havuç diskinin alt sınırında sıvı birikmesi veya yüzeyde mantar miselyum büyümesidir.
   7. Kalan havuç diskleri RLN süspansiyonları ile enfekte olmaya hazırdır. Steril bir bıçak kullanarak havuç diskinin merkezinde X şeklinde bir kesi yaparak başlayın. Sadece yarıya kadar derin kestiğinizden emin olun.
   8. X şeklindeki yaranın merkezinde en az 50 karışık yaşam aşaması içeren bir süspansiyonun 50 μL'sini pipetleyerek RLN'yi aşılayın. Petri kabını kapatın ve kurumasını önlemek için kenarlığı şeffaf bir filmle kapatın.
      1. İçbükey bir slaytta oda sıcaklığında bir binoküler stereomikroskop (50x) altında beş adet 40 μL'lik alikot sayarak süspansiyondaki ortalama nematod sayısını belirleyin. Süspansiyona su ekleyerek veya nematodların çökelmesini bekleyerek (yaklaşık 60 dakika) ve yüzey suyunu boşaltarak hacmi düşürerek karışık yaşam aşaması RLN'lerin süspansiyonunu mL başına 1000'e ayarlayın.
   9. Havuç disklerini 25 ° C'de, karanlıkta 3 aya kadar tutun ve RLN popülasyon artışının sonucu olan nekrotik lezyonların belirtileri için haftada bir binoküler stereomikroskop altında takip edin.
      NOT: Başarılı bir şekilde parazitlenmiş havuç diskleri, daha sonra 2 aya kadar kullanılmak üzere 11 °C'de saklanabilir, ancak mikrobiyal kontaminasyon açısından düzenli olarak kontrol edin. Mikrobiyal enfeksiyon belirtileri gösteren parazitli havuç diskleri, atılmadan önce otoklavlama ile dekontamine edilmelidir.
   10. Akış başlığının altında, aşılama bölgesinde (Şekil 1) görünür doku nekrozlu havuç disklerini steril bir cam kase içinde 8 cm çapında ve 75 μm gözenekli bir elek setine aktararak RLN'leri çıkarın. RLN'leri toplamak için eleğin tabanı ile kase içbükeyliği arasında 1 cm'lik küçük bir boşluk bırakın.
       NOT: Ticari olarak edinilmiş bir elek eksikliğinde, 8 cm çapında bir plastik tüpten / sağlam bir plastik kaptan ve sıkı bir ağ gazlı bezden yapılabilir. Gazlı bezi plastik tüpe veya kaba sabitlemek için lastik bantlar kullanın.
   11. Havuç diskleri kaplanana kadar elek içine bir antibiyotik solüsyonu dökün ve karanlıkta 12 saat (gece boyunca) tutun. RLN'ler havuç disklerinden çıkar ve kasenin dibine yerleşir. Antibiyotik çözeltisi, sterilize edilmiş damıtılmış suya¹⁶ 50 μg / mL kanamisin ve karbenisilin eklenerek ekstraksiyonla birlikte doğaçlama olarak hazırlanmalıdır.
       NOT: Antibiyotik stok çözeltileri, her biri 10 mL sterilize edilmiş damıtılmış su içinde 0.5 g kanamisin monosülfat veya 0.5 g karbenisilin disodyum çözülerek 50 mg / mL'de hazırlanır. Stok çözeltileri akış davlumbazında filtrelenir (0,22 μm gözenek) ve -20 °C'de 1 yıla kadar tutulabilir.
   12. Süzgeci çıkarın, RLN'leri kasenin altından sterilize edilmiş bir cam boyama bloğuna (4 cm x 4 cm x 1 cm) çekmek için sterilize edilmiş bir cam pipet kullanın ve 1 mL antibiyotik solüsyonu pipetleyerek yıkayın. Kullanılmış antibiyotik solüsyonunu toplamadan önce nematodların çökmesi için 30 ila 40 dakika bekleyin. Bu yıkamayı 4x-5x tekrarlayın.
   13. Sulu süspansiyonu RLN'lerle hemen kullanın veya daha uzun bir saklama süresi (2 aya kadar) için 11 °C'de tutun.
2. PPN'li patates bitkilerinin in vivo enfeksiyonu
   NOT: Hassas patates bitkileri (S. tuberosum var. Désirée) yetiştirmek için, Ocak ve Mart ayları arasında tarım bayilerinden sertifikalı tohumluk patatesler alınmalıdır. Sertifikalı tohumluk patatesleri seçin, çünkü bunlar bitki sağlığı pasaportu ile satılır ve karantina fitoparazitleri ile kontamine olmadıklarından emin olur. Önlem olarak, patates yumru yüzeyinin dezenfeksiyonunu sağlamak için% 10'luk bir çamaşır suyu çözeltisi ile dezenfeksiyonun ilk adımı ve ardından akan musluk suyunda yıkama gerçekleştirilebilir. Filizlenmeyi ve canlılığı azaltmak için uygulanan tedaviler patates büyümesini ve enfeksiyona tepkiyi engelleyebileceğinden, yaygın ticarileştirilmiş patatesler önerilmez.
   1. Aynı büyüklükteki patates yumrularını seçin ve delikli, çürüklü veya daha yumuşak bölümleri olanları atın. Filizlenmeyi senkronize etmek için ekimden önce büyüyen tüm filizleri (1 mm) nazikçe çıkarın.
      NOT: Gerekirse, tohumluk patatesleri ekimden önce iyi havalandırılmış, kuru ve karanlık bir yerde saklayın.
   2. 5 L'lik saksıyı (22 cm x 18 cm) 1:1 otoklavlanmış toprak ve ince kaba kum karışımı ile 22,5 g yavaş salınan NPK gübresi (12-12-12) ile doldurun ve patatesleri toprak yüzeyinin 9 cm altına ekin.
      NOT: Toprak ve kum, 2 mm'den büyük kalıntıları temizlemek için elenmeli, 121 ° C'de 15 dakika boyunca 2 kez otoklavlanmalı ve sık sık karıştırılarak 1 ila 2 gün boyunca 100 ° C'de kurutulmalıdır. Kullanmadan önce sık sık karıştırarak sonraki 7 – 10 günü havalandırın.
   3. Saksıları nemli koşullar altında (% 50 -% 70 nem) bir serada tutun ve sık sık su verin (toprağı maksimum su tutma kapasitesi% 70 tutun), toprak yüzeyinde patates bitkisi sürgünleri çıkmaya başlayana kadar aşırı sıcaklıklardan kaçının.
   4. Bitki ortaya çıktıktan sonra, patates köklerini enfekte etmek için taze ekstrakte edilmiş RLN süspansiyonları kullanın. Bitkinin etrafında tohum derinliğine eşit olarak dağıtılmış 4 ila 6 delik (1 cm genişliğinde) oluşturarak başlayın.
   5. 30.000 canlı karma yaşam evresi RLN'den oluşan 8 mL'lik bir süspansiyonu deliklere eşit şekilde pipetleyin, böylece aşı g toprak karışımı başına 4 canlı RLN oranında olur ve toprak karışımı ile örtün. RLN'li saksılar için, aşılama gününde sulamayı bırakın.
      NOT: RLN'ler stereomikroskop altında (40x) sayılır. Ölü nematodlar hareketsizdir ve uzatılmış bir şekle sahipken, canlı nematodlar genellikle hareketlidir (uzatılmamış şekil). Mortaliteyi tespit etmek için fiziksel dürtme kullanılır.
   6. Saksıları yukarıda açıklanan koşullar altında 2 ay boyunca saklayın (Şekil 2). Daha sonra patates bitkilerini kökünden sökün ve sürgünleri ve kökleri ayrı ayrı tartın.
   7. Boyama teknikleri ile RLN saldırı bölgelerinin yerini kontrol etmeden önce kök sistemini dikkatlice yıkayın⁵.

2. PPN'ler ile patates transgenik köklerinin in vitro ko-kültürlerinin kurulması

1. Kurulması in vitro Patates Transgenik Kökleri
   NOT: Bu protokol için şunları kullandık: Rhizobium rhizogenes taşıyan gus Ri plazmidinde birlikte entegre edilmiş ve bir çift 35S promotörü tarafından sürülen raportör geni (A4pRiA4::70GUS)¹⁷. Bakteriler ticari kaynaklardan elde edilebilir veya sertifikalı referans laboratuvarlardan talep edilebilir.
   1. Üstel büyüme aşamasında bakteri elde etmek için, plaka R. rhizogenes'i bir Luria-Bertani (LB)¹⁸ katı orta plakaya yayın ve gece boyunca 26 ° C'de tutun.
      NOT: LB besiyeri ticari olarak elde edilebilir veya 10 g/L pepton, 5 g/L maya özütü, 10 g/L NaCl ve 15 g/L agar eklenerek ve ardından 121 °C'de 15 dakika buharla sterilize edilerek laboratuvarda hazırlanabilir.
   2. Bir aşılama döngüsü ile bir koloni seçin ve steril 50 mL'lik bir şişede 10 mL sıvı LB suyunu (agarsız LB ortamı) aşılayın. Gece boyunca karanlıkta 26 °C'de çalkalama (180 rpm) altında tutun.
   3. A₆₀₀ 0.6'ya ulaşana kadar sıvı kültürün absorbansını ölçün. Bu aşamada, bakteriler üstel büyüme aşamasındadır ve bitki materyalini aşılamak için kullanılır.
   4. Aşılama, aseptik taze patates yumrularında gerçekleştirilir. Patates yumrularının yüzeyini sterilize etmek için, daha büyük kalıntıları temizlemek için akan musluk suyunda yıkayarak başlayın ve ardından daha ince kalıntıları çıkarmak için kuvvetli çalkalama ile ortak bir deterjan solüsyonu (40 mL su başına 1 damla) ile başlayın.
      NOT: Kullanılan PPN'lere karşı duyarlılığı bilinen bir patates çeşidi seçin. Bu protokol için S. tuberosum var. Désirée.
   5. Yumruları bir kaba koyun, ticari bir ağartma solüsyonu (1:4, musluk suyunda ticari ağartıcı) ile örtün ve kapatın. 15 dakika karıştırın, çamaşır suyu solüsyonunu atın ve 3 kez sterilize edilmiş musluk suyuyla durulayın.
   6. Bir akış davlumbazında, yumruları kuvvetli çalkalama ile 15 dakika boyunca bir etanol çözeltisine (%80, h/h) daldırın, etanolü atın ve 3 kez sterilize musluk suyuyla durulayın.
   7. Steril bir neşter kullanarak, yumruların periferik kısımlarını (yumruların yaklaşık% 50'si yüzeyden içe doğru) çıkarın ve iç merkezi parçayı 0,5 cm kalınlığında segmentlere¹⁹ ayırın. Adım 2.1.3'te hazırlanan bakteri süspansiyonu ile hemen aşılayın.
   8. Aşılama için, pH = 5.6'da 30 g / L sükroz ile desteklenmiş 9 mL Schenk ve Hildebrandt²⁰ (SH) ortamına 1 mL bakteriyel süspansiyon ekleyerek bakteriyel süspansiyonu seyreltin. Steril bir neşterin ucunu seyreltilmiş süspansiyona batırın ve patates segmentinin yüzeyini sarın. Her patates segmenti için bu adımı 5 kez tekrarlayın.
   9. Aşırı nem segmentlerini steril filtre kağıdında 1 dakika kurutun, yarı katı SH ortamına (30 g/L sükroz içeren SH ortamı, 8 g/L agar, pH = 5.6) yerleştirin ve plazmit transfeksiyonunun gerçekleşmesi için 25 °C'de karanlıkta tutun.
   10. 3 gün sonra, enfekte olmuş segmentleri, antibiyotiğin sefotaksim ve karbenisilininin her birinden 150 μg / mL ile takviye edilmiş yarı katı SH ortamı plakalarına aktarın. Bakterilerin ortadan kaldırılmasını sağlamak için haftalık orta yenileme ile 3 aydan fazla saklayın.
       NOT: Sefotaksim stok çözeltisi, 1 g sefotaksim sodyumun 10 mL steril demineralize su içinde çözülmesi ve akış başlığı altında süzülmesi (0.22 μm ağ) ile 100 mg / mL'de hazırlanabilir. Antibiyotikler -20 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir.
   11. 3 ay sonra, transgenik kök büyümesi geniştir. Steril bir cımbızın uçlarıyla 1 g'lık bir kök yığını toplayarak ve yeni bir plaka içinde kültür ortamının merkezine yerleştirerek kökleri antibiyotiksiz taze, yarı katı bir SH ortamına aktarın (Şekil 3).
       NOT: Enfeksiyondan yaklaşık 1 ay sonra, transgenik köklerin gelişmeye başladığı patates segmentinin yüzeyinde küçük hücre büyümesi kütleleri görülür⁶. Onları kültür ortamıyla temas halinde tuttuğunuzdan emin olun, aksi takdirde kuruyabilirler.
   12. Genetik ve metabolik stabiliteyi sağlamak için, transgenik kökleri PPN'lerle enfekte olmadan önce 1 yıldan fazla bir süre boyunca karanlıkta 25 ° C'de aylık bir alt kültür rutini altında (adım 2.1.11'de açıklandığı gibi) tutun.
       NOT: İstenmeyen mikrobiyal kontaminasyon sıklıkla meydana geldiğinden, protokolün her adımında en az altı kopyanın tutulduğundan emin olun. Bir kez kurulduktan sonra, tek bir ko-kültür plakası, birkaç yeni ko-kültür için bir aşı olarak kullanılabilir; Ancak, en az altı kopya plakası bulundurduğunuzdan emin olun.
2. PPN'ler ile transgenik patates köklerinin in vitro ko-kültürlerinin kurulması
   NOT: Transgenik köklerin PPN'lerle ko-kültürlerini elde etmek için nematod sterilizasyon işlemi kritik öneme sahiptir. Bu protokol için karantina kök-ur nematodu Meloidogyne chitwoodi'nin ikinci aşama yavruları kullanıldı. Nematod aşısı, sertifikalı referans laboratuvarlarından kök safraları şeklinde elde edilebilir.
   1. Binoküler stereomikroskop (20x) altında, nematod yumurta kütlelerini steril ultra ince uçlu cımbızla kök safralarından izole edin. Yumurta kütlelerini 5 mL steril musluk suyu ile kapalı bir Petri kabına koyun ve yumurtaların 48 saat çatlamasına izin verin. J2 süspansiyonunu mL başına 100 nematod'a ayarlayın.
   2. Bir akış davlumbazında, 500 J2 içeren 5 mL süspansiyonu steril 20 μm gözenekli steril bir eleğe pipetleyin ve steril musluk suyuyla yıkayın.
   3. J2'leri içeren eleğin alt yarısını %20 hidrojen peroksit (H₂O₂) çözeltisine daldırın ve 15 dakika boyunca dairesel hareketlerle manuel olarak karıştırın.
   4. Steril J2'leri elekten steril musluk suyu dağıtarak yıkayın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın. Son yıkamada, eleği eğin, böylece nematodlar elek sınırında toplanır. Elek kenarına 1 mL steril ultra saf su pipetleyerek steril nematod süspansiyonunu geri kazanın ve 11 °C'de saklayın veya hemen kullanın.
      NOT: Sterilizasyonun başarısı, nematod süspansiyonunun 100 μL'lik bir alikotunun SH ortamında kaplanması ve kontaminasyon açısından 1 hafta boyunca düzenli olarak izlenmesiyle değerlendirilebilir.
   5. Akış davlumbazında, 1 g'lık bir patates transgenik kök yığınını (adım 2.1.11'de açıklandığı gibi) 100 steril nematod (mL başına 1000 J2s ile 100 μL süspansiyon) içeren SH plakalarına alt kültürleyin. 2 ila 3 hafta sonra yeni köklerde küçük safralar oluşmaya başlar.
   6. Ko-kültürü düzenli olarak ters çevrilmiş bir mikroskop altında (100x) takip edin ve yumurta kütleleri fark edilmeye başladığında, safraların kök kümesiyle birlikte alındığından emin olarak yeni bir yarı katı SH orta plakaya alt kültür uygulayın (Şekil 4). Karanlıkta 25 °C'de ortak kültürleri aylık bir alt kültür rutini altında tutun.

3. PPN enfeksiyonunun yapısal analizi

NOT: PPN'lerin kök doku yapısında neden olduğu değişiklikleri takip etmek için, farklı kimyasal bileşimlere sahip dokuları karşılaştırmak için histokimyasal boyama teknikleri kullanılır. Diferansiyel boyama, belirli boyaların kimyasal afinitelerine göre hedef doku ile reaksiyona girdiği kök kütlelerinde veya sabit kök materyalinin ince kesitlerinde gerçekleştirilir²¹. Mevcut protokol için, diferansiyel boyama için toluidin mavisi O boyaları ile birleştirilmiş asit fuksin veya periyodik asit-Schiff reaktifi (PAS) kullandık.

1. Asit fuksin ile boyanmış köklerde bitki paraziti nematodların dağılımı
   NOT: PPN'lerin kök sistemi boyunca dağılımını takip etmek için, nematod kas dokusunu kırmızı bir tonda boyamak için asit fuksin kullanılır⁵.
   1. Toprak kalıntılarını (in vivo bitki kökleri) veya kültür ortamının kalıntılarını (in vitro transgenik kökler) temizlemek için kök sistemini 5 dakika akan musluk suyu altında yıkayarak başlayın. Toprağı kök sisteminden ayırmaya yardımcı olmak için parmaklarınızı dairesel hareketlerle kullanın.
   2. Kök sistemini 1 ila 2 cm uzunluğunda bölümler halinde kesin ve 150 mL'lik bir beherin içine yerleştirin. 70 mL% 1.5 sodyum hipoklorit (NaOCl) çözeltisi dağıtın ve kök dokularını temizlemek için 4 dakika kuvvetlice karıştırın. Daha sonra NaOCl solüsyonunu atın, kökleri akan musluk suyunda durulayın ve kalan NaOCl^22'yi çıkarmak için 15 dakika demineralize suda bekletin.
      NOT: Klorlu ağartıcı minimum %5.25 NaOCl içerir, bu nedenle %1.5'lik bir NaOCl çözeltisi elde etmek için 50 mL suya 20 mL klorlu ağartıcı ekleyin. Daha yumuşak materyal için (ör., genç köklerin veya in vitro olarak yetiştirilmiş transgenik köklerin daha yumuşak dokusu) %0.9 NaOCl çözeltisi kullanılırken, daha sert materyal için (daha yaşlı odunsu kökler) %2.0 NaOCl çözeltisi kullanılır.
   3. Temizlenmiş kökleri boşaltın ve 30 mL demineralize su ile borosilikat bir cam kabın üzerine koyun. 1 mL asit fuksin leke solüsyonu pipetleyin, elle karıştırın ve sıcak bir plakada 30 saniye kaynatın. Cam kabı soğumaya bırakın, solüsyonu boşaltın ve lekeli kökleri akan musluk suyunda yıkayın.
      NOT: Asit fuksin leke çözeltisi, 3.5 g asit fuksin boya tozunun 250 mL asetik asit içinde çözülmesi ve 750 mL demineralize su eklenmesiyle yapılır. Boyamayı, kullanılmayan fazla lekeleri çıkarmak ve numune kontrastını artırmak için her zaman bir leke giderme adımı takip eder.
   4. Birkaç damla HCl (5N)¹³ ile asitleştirilmiş 10-30 mL gliserin ekleyerek lekeyi çıkarın.
   5. PPN'lerin kök yapısında tercihen nereye saldırdığını kabaca değerlendirmek için stereomikroskop veya ters mikroskop altında gözlemleyin (Şekil 5 ve Şekil 6).
2. Periyodik asit-Schiff (PAS)/toluidin mavisi O ile kök hücre morfolojisinin değerlendirilmesi
   NOT: PPN enfeksiyonunun veya kök hücre morfolojisine verdiği hasarın etkisi, önce enfekte olmuş patates köklerinin sabitlenmesi, kesitlere ayrılması ve diferansiyel şekilde boyanmasıyla mikroskop altında değerlendirilebilir.
   1. Kapalı bir numune şişesinde, oda sıcaklığında 6 24-48 saat boyunca pH 7.2'de 0.1 M sodyum fosfat tamponunda hazırlanan% 2.5 glutaraldehit ile taze kök materyalini^sabitleyin.
      DİKKAT: Gluteraldehit toksiktir. Solumaktan ve temastan kaçının. Koruyucu laboratuvar önlüğü ve eldiven kullanın ve çeker ocakta çalışın. Numune şişeleri, durulama veya vakum prosedürleri dışında kapatılmalıdır. Glutaraldehiti Tehlikeli Atık Prosedürleri kurallarına göre atın. 3.2.1 ila 3.2.5 arasındaki adımlar, reaktiflerin solunmasını önlemek için çeker ocakta gerçekleştirilir.
      NOT: 1 L sodyum fosfat tamponu, pH 7.2 hazırlamak için, 31.6 mL 1M NaH₂PO_4'e (1 L çözeltide 119.98 g) 68.4 mL 1M Na₂HPO₄ (1 L çözeltide 141.96 g) ekleyin ve 900 mL demineralize su ekleyerek 1 L'ye kadar doldurun. Fiksatifin sızmasına yardımcı olmak için, kök materyali ile kapaksız numune şişelerini 26 dakika boyunca düşük bir vakum altında (2 mm Hg) bir vakum pompasına bağlı bir kurutucuya yerleştirin.
   2. Bir cam Pasteur pipeti ile fiksatif solüsyonu atın ve fikslenmiş kökleri sodyum fosfat tamponu (3x) ile yıkayın.
   3. Tamponu 15 dakika boyunca% 10 etanol çözeltisi (h / h) ile değiştirerek sabitlenmiş kök dokusunu kademeli olarak kurutmaya başlayın. Daha sonra, bir cam pipet kullanarak% 20'lik bir etanol çözeltisi ile değiştirin ve kökleri 15 dakika gömülü tutun. Köklerin 1 saat boyunca tutulması gereken saf etanol adımına kadar artan etanol konsantrasyonlarının (%30, %40, %50, %60, %70, %80 ve %90) kademeli olarak art arda devam etmesi gerekir.
   4. Susuz kalmış kökleri yavaş yavaş reçineye (2-hidroksietil metakrilat) gömün. Bir cam pipet ile saf etanolü 3:1 (h/h) etanol/reçine çözeltisiyle değiştirin ve 4 °C'de 24 saat bekletin. Bunu, her biri 4 ° C'de 24 saatlik bir inkübasyon süresine sahip 1: 1 ve 1: 3 (h / h) etanol / reçine çözeltileri ile takip edin. Daha sonra 1: 3 (h / h) çözeltisini, polimerizasyon başlatıcı olarak dibenzoil peroksit (% 1) ile desteklenmiş saf reçine ile değiştirin.
   5. Numuneleri bir reçine kalıp tepsisine koyun, bir reçine: dimetil sülfoksit 15: 1 (v / v) karışımı ekleyin ve reçinenin sertleşmesi için sıcak bir plaka üzerinde 60 ° C'de 48 saat tutun.
   6. Emprenye edilmiş numuneleri bir tungsten bıçakla donatılmış döner bir mikrotoma yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre cam slaytlar üzerine 2-5 μm'lik bölümler kesin.
   7. Slaytları oda sıcaklığında asetik asit içinde% 15 2,4-dinitrofenilhidrazin çözeltisi içeren bir cam boyama kavanozuna 10 dakika daldırarak diferansiyel boyamaya başlayın. Daha sonra akan musluk suyu altında 15 dakika dikkatlice yıkayın ve 60 °C'de (15 dakika) bir fırında kurutun.
   8. Ardından, slaytları 10 dakika boyunca periyodik aside (% 1) batırın ve ardından 5 dakika boyunca akan musluk suyu altında yıkayın ve 60 ° C'de (15 dakika) bir fırında kurumaya bırakın.
   9. Slaytları 30 dakika boyunca Schiff'in Reaktifine (0,25 M hidroklorik asit içinde %1 pararosanilin ve %4 sodyum metabisülfitten oluşur) daldırın. Daha sonra, hidroklorik asit (0,05 M) içinde bir sodyum metabisülfit çözeltisi (% 0,5) ile 2 dakika yıkayın. Son olarak akan musluk suyunda 5 dakika yıkayın ve oda sıcaklığında kurutun.
   10. Buna karşılık, slaytları 15 dakika boyunca %0,05 toluidin mavisi O'ya batırarak, akan musluk suyunda 15 dakika yıkayarak ve 60 °C'de (15 dakika) bir fırında kurutarak lekeleyin.
   11. Görüntü yakalama donanımı ile donatılmış bir mikroskop (100x) altında gözlemleyin (Şekil 7).

Sonuçlar

Havuç diskleri, çeşitli göçmen PPN türlerini çoğaltmak ve korumak için kullanılabilir²³. RLN için, bu teknik genellikle nematod türlerinin veya izolatların referans koleksiyonlarını korumak için kullanılır. Havuç diskleri kullanılarak 3 aylık bir süre içinde nematod popülasyonlarında ortalama 100 kat artış elde edilebilir (Şekil 1). Bununla birlikte, nematod sayıları, esas olarak nematod genetik çeşitli...

Tartışmalar

Toprakta yaşayan PPN'ler tarafından saldırıya uğrayan bitkilerde enfeksiyon ve hastalık gelişim mekanizmalarının incelenmesi zordur, çünkü bu fitoparazitler genellikle kök sisteminin iç dokularını enfekte eder ve sürgünlerde spesifik olmayan semptomlara neden olur. Seranın kontrollü çevre koşullarına rağmen, patates yumrularının filizlenmesi ve patates bitkilerinin büyümesi ilkbahar ve yaz aylarında hala tercih edilmekte ve bu da deney süresini yılda bir me...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-Dinitrophenylhydrazine	Sigma-Aldrich	D199303
2-Hydroxyethyl methacrylate	Sigma-Aldrich	17348
Acetic acid	Sigma-Aldrich	695092
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129
Benzoyl peroxide	Sigma-Aldrich	B5907
borosilicate glass beaker	Sigma-Aldrich	Z231827
Carbenicillin disodium salt	Sigma-Aldrich	C3416
Cefotaxime sodium salt	Sigma-Aldrich	C7039
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301
Ethanol	Supelco	1.00983
Fertilizer	Compo Expert
Flower pot 5 L	VWR	470049-676
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	354400
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Kanamycin monosulfate	Sigma-Aldrich	BP861
LB Broth with agar	Sigma-Aldrich	L3147
MCE syringe filter	Millipore	SLGSR33SS
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Pararosaniline hydrochloride	Sigma-Aldrich	P3750
Periodic acid	Sigma-Aldrich	P0430
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
Schiff′s reagent	Sigma-Aldrich	1.09033
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	161519
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011
Soil / Substrate	Compo Sana
Stainless Steel Tweezers	Sigma-Aldrich	22435-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161