马铃薯根系植物寄生线虫的体内和体外感染用于评估诱导结构变化

摘要

该方案描述了在体内温室条件下用植物寄生线虫感染马铃薯根和马铃薯体外转基因根，用于通过光学显微镜对根结构进行组织化学分析。

摘要

土生植物寄生线虫 （PPN） 是重要的马铃薯害虫，可引起病变和/或改变植物根系结构，导致作物适应性和生产力降低。对 PPNs 感染和发育的细胞和亚细胞机制的研究可以求助于温室条件下的田间植物或幼苗。实地研究更能代表自然环境，但受到环境条件的不可预测性的影响，这会严重影响研究结果。温室研究可以更好地控制环境变量，并提高对污染物或病原体的安全性。然而，在一些宿主中，遗传多样性成为变异的重要因素，并影响宿主-寄生虫复合物反应。我们已经开发了转基因根与 PPN 的 体外 共培养物，作为一种可靠的替代方案，占用空间更小，获得时间更短，并且不受污染或宿主遗传变异的影响。通过引入无菌 PPN 以寄存 体外 转基因根来获得共培养物。它们可以无限期地维护，这使它们成为保留引用 PPN 集合的出色支持。在本工作中，详细介绍了一种方案，用于用根损伤线 虫控制体内 马铃薯根的感染，以及建立马铃薯转基因根与根结线虫的 体外 共培养。 体外 共培养物为马铃薯自然感染条件和产生的线虫生命阶段提供了实验室代理，而与季节或气候条件无关。此外，使用组织化学和光学显微镜详细介绍了用于结构分析的方法。酸性品红染料用于跟踪根上的线虫攻击部位，而使用高碘酸-希夫 （PAS） 和甲苯胺蓝 O 的差异染色突出了马铃薯内部根组织中的线虫结构。

引言

块根和块茎作物在世界上最重要的主食中排名^第 4。马铃薯 （Solanum tuberosum L.） 是最重要的栽培块茎之一。它起源于南美洲的安第斯山脉，但在 16^世纪被引入欧洲后，很快成为低收入人群最常见的食物来源。今天，马铃薯占世界热量摄入量的 1.7%¹。作物生产受到植物病虫害和病原体的严重影响，其中植物寄生线虫 （PPN） 可导致平均产量损失高达 12%²。植物寄生线虫是现代农业中对农作物造成一些最具破坏性的疾病的原因。土壤中的 PPN 会给农民带来重大损失，因为它们会影响植物根系，并通过减少生产和/或损害产品来干扰作物生产力，使其无法销售³。这些危险的植物寄生虫使用它们的探针（针状口器）刺穿根细胞并以细胞内容物为食。一些 PPN 从根外部取食，另一些进入根并导致组织损伤（迁移），而另一些进入根部并变得久坐不动，严重改变根结构以促进摄食⁴。影响马铃薯的主要PPN是马铃薯孢囊线虫、Globodera spp.、根结线虫（RKN）、Meloidogyne spp.、根病线虫、Pratylenchus spp.、假根结线虫Nacobbus aberrans和马铃薯腐病线虫Ditylenchus destructor。对于这些 PPN，不同的摄食习惯会诱导宿主根组织发生不同的结构变化 ^5,6。对 PPN 感染机制和宿主反应的研究通常通过田间或温室试验进行，以维护参考 PPN 培养物收藏或进行大规模实验 ^7,8。在自然条件下进行测试受环境变化和生物或非生物胁迫因素的强烈影响。温室生物测定是更接近自然条件的替代方案，同时允许相对控制环境变化并限制非生物和生物胁迫的影响。然而，对于需要更精细地控制生物变异性的试验来说，宿主遗传多样性仍然是一个挑战。这些限制可以通过求助于体外植物组织培养来克服。这些是多功能实验室系统，在 PPN 疾病研究中具有许多优势。对于土壤中的 PPN，转基因根的体外培养是在实验室条件下进行研究的有用工具 ^9,10。

转基因根或毛状根 （HR） 是在用根瘤菌感染植物材料后获得的（Riker 等人，1930 年） Young 等人，2001^{年 11} 月。这种革兰氏阴性菌诱导其 Ri 质粒转染到宿主基因组中，并改变植物激素生物合成的调节，促进根组织的形成¹²。转基因根可以在培养基中的无菌作用下无限期地保持。使用 HR 研究 PPN 的优势在于在没有影响线虫感染和发育的植物生长调节因子的情况下生长速率高、单位时间内生物量产量的高比率以及细胞完整性和寿命，这决定了更高的遗传和生化稳定性⁶。通过采用体外转基因根，可以在实验室条件下无限期地维持 PPNs 基因型，可以很容易地跟踪感染和 PPNs 的发展，可以减少宿主遗传变异，宿主分子组成的作可以直接与线虫反应相关，并且可以更准确地跟踪宿主和寄生虫的结构变化 ^6,13。对于马铃薯 PPN 病害的研究，体外转基因根共培养允许独立于季节或马铃薯块茎休眠进行实验。

在该协议中，详细介绍了马铃薯植株 PPN 维持和 体内 感染的传统方法。对于受感染根的结构分析，还详细介绍了一种基于建立转基因马铃薯根与 PPNs 的 体外 共培养物的改进方法，作为一种替代方案，可以更好地控制环境和宿主遗传变异。为了跟踪根组织中的 PPNs 感染和发育，采用组织化学来帮助在光学显微镜下观察 PPN。该方案的总体目标是优化 PPN-宿主相互作用的研究，确保更可控和可重复的实验条件，同时促进对根组织中线虫的详细结构和发育分析。

研究方案

1. 温室种植的马铃薯植株的感染

注：温室试验是在混合生命阶段或第二阶段幼虫 （J2） 中悬浮 PPN 进行，具体取决于 PPN 害虫的具体生命周期。对于该方案，使用了根部病变线虫 （RLN） Pratylenchus penetrans 的混合生命阶段的悬浮液。PPN 可以在实验室中饲养，也可以从经过认证的参考实验室索取。

1. 根病线虫的增殖和维持
   注意：消毒的胡萝卜盘用于 RLN 的倍增和维持¹⁴.使用商业收购的胡萝卜（Nice变种），没有明显的损害，以减少微生物污染。最好是它们应该不含杀虫剂，以避免阻碍 RLN 的发展。
   1. 在流动的自来水中清洗胡萝卜以去除较大的碎屑，然后用普通洗涤剂溶液（每 40 mL 水 1 滴）去除较细的碎屑。用实验室纸巾擦干。
   2. 在无菌下，在垂直流罩中，将消毒过的金属串插入胡萝卜顶部（向内 1 至 2 厘米），以便更容易握住。
   3. 在带喷嘴的洗衣瓶的帮助下，用 96% （v/v） 乙醇润湿胡萝卜。用消毒过的滤纸吸干胡萝卜的底部尖端，然后小心地将其带到火焰中。
      注意： 请注意，乙醇会强烈燃烧，因此请保持一定距离。
   4. 使用无菌削皮器从上到下将胡萝卜去皮，然后重复上一步。丢弃顶部和底部（向内 2 厘米），并将胡萝卜的中间部分放入无菌培养皿（直径 150 毫米）中。使用无菌刀片和镊子，小心地从胡萝卜直径约 2 厘米的部分切下 1 厘米厚的切片（图 1）。
   5. 将切片转移到无菌培养皿（直径 60 毫米）中，并用透明薄膜密封边界。使用紫外线，对胡萝卜盘表面每侧消毒 60 分钟。
   6. 在 25 °C 下避光保存 1-2 周，并丢弃任何开始出现微生物污染迹象的胡萝卜盘¹⁵。
      注意：污染的明显迹象是过度褐变（腐烂）、胡萝卜盘下缘积液或表面真菌菌丝体生长。
   7. 剩余的胡萝卜盘已准备好用 RLN 悬浮液感染。首先使用无菌刀片在胡萝卜盘的中心做一个 X 形切口。确保只切一半深。
   8. 通过在 X 形伤口中心移液 50 μL 含有至少 50 个混合生命阶段的悬浮液来接种 RLN。关闭培养皿并用透明薄膜密封边界以避免干燥。
      1. 通过在室温下双目立体显微镜 （40x） 下在凹形载玻片中计数 5 个 50 μL 等分试样，确定悬浮液中线虫的平均数量。通过向悬浮液中加水或等待线虫沉淀（约 60 分钟）并通过倾析地表水来降低体积，将混合生命阶段 RLN 的悬浮液设置为 1000/mL。
   9. 将胡萝卜盘保持在 25 °C，在黑暗中长达 3 个月，并每周在双目立体显微镜下观察 RLN 种群增长导致的坏死病变迹象。
      注意：成功寄生的胡萝卜盘可以在 11 °C 下储存以备后用长达 2 个月，但要定期检查是否有微生物污染。显示微生物感染迹象的寄生胡萝卜盘在丢弃前必须通过高压灭菌进行净化。
   10. 在流动罩下，通过在接种部位（图 1）将具有可见组织坏死的胡萝卜盘转移到设置在无菌玻璃碗中的 8 cm 直径和 75 μm 网筛中来提取 RLN。在筛子底部和碗凹面之间留出 1 cm 的小间隙以收集 RLN。
       注意：在没有商业购买的筛子的情况下，可以用直径为 8 厘米的塑料管/坚固的塑料杯和紧密的网状纱布制作一个筛子。使用橡皮筋将纱布固定在塑料管或杯子上。
   11. 将抗生素溶液倒入筛子中，直到胡萝卜盘被覆盖，并在黑暗中保存 12 小时（过夜）。RLN 从胡萝卜盘中流出，沉淀在碗的底部。应在无菌蒸馏水中加入卡那霉素和羧苄青霉素各 50 μg/mL，在提取时临时制备抗生素溶液¹⁶。
       注：通过将 0.5 g 卡那霉素一硫酸盐或 0.5 g 羧苄青霉素二钠分别溶解在 10 mL 无菌蒸馏水中，制备 50 mg/mL 的抗生素储备溶液。储备溶液在流动罩中过滤（0.22 μm 网孔），可在 -20 °C 下保存长达 1 年。
   12. 取下筛子，使用消毒的玻璃移液管将 RLN 从碗底部吸入消毒的玻璃染色块 （4 cm x 4 cm x 1 cm） 中，然后用移液管 1 mL 抗生素溶液洗涤。等待 30 到 40 分钟让线虫沉淀，然后再收集用过的抗生素溶液。重复此洗涤 4 次至 5 次。
   13. 立即将水性悬浮液与 RLN 一起使用，或将其在 11 °C 下保存更长的储存期（长达 2 个月）。
2. 马铃薯植株的 PPN 体内感染
   注：要种植易感的马铃薯植株（S. tuberosum var. Désirée），应在 1 月至 3 月期间从农产品经销商处获得经过认证的种薯。选择经过认证的种薯，因为它们在出售时附有植物检疫护照，确保它们没有受到检疫植物寄生虫的污染。作为预防措施，可以先用 10% 的漂白剂溶液进行消毒，然后在流动的自来水中清洗，以确保对马铃薯块茎表面进行消毒。不推荐使用常见的商品化马铃薯，因为为减少发芽和活力而实施的处理可能会干扰马铃薯的生长和对感染的反应。
   1. 选择相同大小的马铃薯块茎，丢弃那些有孔、瘀伤或较软部分的马铃薯块茎。播种前轻轻去除所有生长的芽 （1 毫米），以同步发芽。
      注意：如果需要，在播种前将种薯存放在通风良好、干燥和黑暗的地方。
   2. 用 22：1 的高压灭菌土壤和细粗沙与 22.5 克缓释 NPK 肥料 （12-12-12） 混合的混合物填充 5 升花盆（22 厘米 x 12 厘米），然后将马铃薯播种在土壤表面以下 9 厘米处。
      注：应筛分土壤和沙子以去除大于 2 mm 的碎屑，在 121 °C 下高压灭菌 2 次，持续 15 分钟，然后在 100 °C 下干燥 1 至 2 天，经常混合。使用前，通过经常混合在接下来的 7 – 10 天内充气。
   3. 将花盆放在温室中，在潮湿条件下（湿度为 50%-70%）并经常浇水（将土壤保持在最大持水能力的 70%），避免极端温度，直到马铃薯植物的嫩芽开始在土壤表面冒出。
   4. 植物出苗后，使用新鲜提取的 RLN 悬浮液感染马铃薯根部。首先在植物周围均匀分布的 4 到 6 个孔（1 厘米宽）到种子深度。
   5. 将 8 mL 的 30,000 个活的混合生命阶段 RLN 的悬浮液均匀移液到孔中，使接种物以每克土壤混合物 4 个活 RLN 的比例接种，并用土壤混合物覆盖。对于带有 RLN 的花盆，请在接种当天停止浇水。
      注意：RLN 在立体显微镜 （40x） 下计数。死线虫是不运动的，具有延伸的形状，而活的线虫通常是移动的（非延伸形状）。使用物理刺激来确定死亡率。
   6. 在上述条件下将花盆保存 2 个月（图 2）。之后，将马铃薯植株连根拔起，分别称量芽和根。
   7. 在通过染色技术检查 RLN 攻击位点的位置之前，请仔细清洗根系⁵.

2. 马铃薯转基因根与 PPNs 体外共培养的建立

1. 建立 in vitro 马铃薯转基因根
   注意：对于此协议，我们使用了 Rhizobium rhizogenes 携带 gus 报告基因共整合于 Ri 质粒中，并由双 35S 启动子 （A4pRiA4：：70GUS） 驱动¹⁷.细菌可以从商业来源获得，也可以从经过认证的参考实验室索取。
   1. 为了获得指数生长期的细菌，将板中的根 瘤菌 铺在 Luria-Bertani （LB） ¹⁸ 固体培养基板中，并在 26 °C 下保存过夜。
      注：LB 培养基可以通过加入 10 g/L 蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L NaCl 和 15 g/L 琼脂，然后在 121 °C 下蒸汽灭菌 15 分钟在实验室中获得或在实验室制备。
   2. 使用接种环，挑选一个菌落，并在无菌 50 mL 烧瓶中接种 10 mL 液体 LB 肉汤（不含琼脂的 LB 培养基）。在 26 °C 下在搅拌 （180 rpm） 下避光保存过夜。
   3. 测量液体培养物的吸光度，直到 A₆₀₀ 达到 0.6。在这个阶段，细菌处于指数生长阶段，用于接种植物材料。
   4. 在无菌新鲜马铃薯块茎中进行接种。要对马铃薯块茎的表面进行消毒，首先用流动的自来水清洗以去除较大的碎屑，然后用普通洗涤剂溶液（每 40 mL 水 1 滴）在剧烈搅拌下去除较细的碎屑。
      注：选择已知对正在使用的 PPN 敏感的马铃薯品种。对于该协议，我们使用 了 S. tuberosum var. Désirée。
   5. 将块茎放入容器中，用市售漂白剂溶液（1：4，市售漂白剂在自来水中）覆盖并关闭。混合 15 分钟，处理掉漂白剂溶液，然后用消毒的自来水冲洗 3 次。
   6. 在流动罩中，将块茎浸入乙醇溶液 （80%， v/v） 中 15 分钟，剧烈搅拌，处理乙醇并用消毒的自来水冲洗 3 次。
   7. 使用无菌手术刀，去除块茎的外围部分（约占块茎表面向内的 50%），并将内部中心块切成 0.5 厘米厚的段¹⁹。立即用步骤 2.1.3 中制备的细菌悬浮液接种。
   8. 对于接种，通过将 1 mL 细菌悬浮液添加到 9 mL 补充有 30 g/L 蔗糖（pH = 5.6）的 Schenk 和 Hildebrandt²⁰ （SH） 培养基中来稀释细菌悬浮液。将无菌手术刀的尖端浸入稀释的悬浮液中，然后缠绕马铃薯段的表面。对每个马铃薯段重复此步骤 5 次。
   9. 在无菌滤纸中干燥水分段 1 分钟，将它们置于半固体 SH 培养基（含 30 g/L 蔗糖、8 g/L 琼脂，pH = 5.6 的 SH 培养基）中，并在 25 °C 的黑暗中保持以进行质粒转染。
   10. 3 天后，将感染的片段转移到补充有 150 μg/mL 抗生素头孢噻肟和羧苄青霉素的半固体 SH 培养基板中。保存 3 个月以上，每周更新培养基，以确保消除细菌。
       注：通过将 1 g 头孢噻肟钠溶解在 10 mL 无菌软化水中并在流罩下过滤（0.22 μm 目），可以制备 100 mg/mL 的头孢噻肟储备溶液。抗生素可在 -20 °C 下保存长达 1 年。
   11. 3 个月后，转基因根系生长广泛。通过用无菌镊子的尖端收集 1 g 根团块并将其放置在新板中培养基的中心，将根转移到不含抗生素的新鲜半固体 SH 培养基中（图 3）。
       注意：感染后约 1 个月，马铃薯段表面出现小块细胞生长，转基因根从那里开始发育⁶。请务必让它们与培养基接触，否则它们可能会变干。
   12. 为确保遗传和代谢稳定性，在感染 PPN 之前，将转基因根保持在 25 °C 的黑暗中每月传代培养程序（如步骤 2.1.11 所述）超过 1 年。
       注意：确保在方案的每个步骤中至少保留六个重复，因为经常会发生不需要的微生物污染。一旦建立，单个共培养板可用作几种新共培养物的接种物;但是，请务必保留至少 6 个重复板。
2. 使用 PPN 建立转基因马铃薯根的 体外 共培养物
   注意：为了获得转基因根与 PPN 的共培养物，线虫灭菌过程至关重要。对于目前的方案，我们使用了检疫根结线虫 Meloidogyne chitwoodi 的第二阶段幼鱼。线虫接种物可以从经过认证的参考实验室以根瘿的形式获得。
   1. 在双目立体显微镜 （20x） 下，用无菌超细尖镊子从根瘿中分离线虫卵团。将蛋块放入装有 5 mL 无菌自来水的有盖培养皿中，让鸡蛋孵化 48 小时。将 J2 悬浮液设置为 100 个线虫/mL。
   2. 在流动罩中，将 5 mL 含有 500 J 2 的悬浮液移液到无菌 20 μm 网眼无菌筛中，并用无菌自来水洗涤。
   3. 将含有 J2 的筛子的下半部分浸入 20% 过氧化氢 （H₂O₂） 溶液中，并以圆周运动手动混合 15 分钟。
   4. 通过筛子分配无菌自来水来清洗无菌 J2。重复此步骤 3 次。在最后一次洗涤中，倾斜筛子，使线虫聚集在筛子边缘。通过在筛子边缘吸取 1 mL 无菌超纯水来回收无菌线虫悬浮液，并在 11 °C 下储存或立即使用。
      注：通过将 100 μL 等分试样的线虫悬浮液接种在 SH 培养基中，并定期监测 1 周的污染情况，可以评估灭菌是否成功。
   5. 在流动罩中，将 1 g 马铃薯转基因根块（如步骤 2.1.11 中所述）传代培养到含有 100 个无菌线虫（100 μL 悬浮液，每毫升 1000 个 J 2 ）的 SH 平板上。2 到 3 周后，小瘿开始出现在新的牙根中。
   6. 在倒置显微镜 （100x） 下定期进行共培养，当卵团开始明显时，将瘿传代培养到新的半固体 SH 培养基板中，确保与根团一起带走瘿（图 4）。在黑暗中，将共培养物保持在每月一次的传代培养程序下。

3. PPNs 感染的结构分析

注意：为了跟踪 PPN 诱导的根组织结构变化，使用组织化学染色技术来对比具有不同化学成分的组织。在根块或固定根材料的薄片中进行差异染色，其中特异性染料根据其化学亲和力与靶组织反应²¹。对于本方案，我们使用酸性品红或高碘酸 - 希夫试剂 （PAS） 与甲苯胺蓝 O 染料联合进行差异染色。

1. 植物寄生线虫在酸性品红染色的根中的分布
   注意：为了跟踪 PPN 在整个根系中的分布，使用酸性品红将线虫肌肉组织染成红色⁵。
   1. 首先在流动的自来水中清洗根系 5 分钟，以去除任何土壤碎屑（体内 植物根）或培养基的残留物（体外 转基因根）。用手指打圈，以帮助将土壤从根系中分离出来。
   2. 将根系切成 1 至 2 厘米长的切片，并将其放入 150 mL 烧杯中。分配 70 mL 1.5% 次氯酸钠 （NaOCl） 溶液，并剧烈混合 4 分钟以清除根组织。然后，处理 NaOCl 溶液，用流动的自来水冲洗根部，并在软化水中浸泡 15 分钟以去除残留的^{NaOCl 22}。
      注：氯漂白剂含有至少 5.25% 的 NaOCl，因此将 20 mL 氯漂白剂加入 50 mL 水中，以获得 1.5% 的 NaOCl 溶液。对于较软的材料（例如，幼根或 体外 生长的转基因根的较软组织）使用 0.9% NaOCl 溶液，而对于较硬的材料（较旧的木质化根）使用 2.0% NaOCl 溶液。
   3. 沥干清除的根部，将它们放在装有 30 mL 软化水的硼硅酸盐玻璃烧杯上。吸取 1 mL 酸性品红染色液，手动混合并在热板上煮沸 30 秒。让玻璃烧杯冷却，沥干溶液，然后用流动的自来水清洗染色的根部。
      注：酸性品红染色液是通过将 3.5 g 酸性品红染料粉末溶解在 250 mL 乙酸中并加入 750 mL 软化水制成的。染色后始终进行脱色步骤，以去除未使用的多余染色剂并提高样品对比度。
   4. 加入 10-30 mL 甘油，加入几滴 HCl （5N） 酸化甘油，脱色¹³。
   5. 在立体显微镜或倒置显微镜下观察，以粗略评估 PPN 在根结构中优先攻击的位置（图 5 和 图 6）。
2. 用高碘酸-希夫 （PAS）/甲苯胺蓝 O 评估根细胞形态
   注：PPNs 感染或对根细胞形态的损害可以在显微镜下通过首先固定、切片和鉴别染色感染的马铃薯根来评估。
   1. 在封闭的样品瓶中，用 2.5% 戊二醛固定新鲜根材料，在 pH 值为 7.2 的 0.1 M 磷酸钠缓冲液中制备，在室温⁶ 下放置 24-48 小时。
      注意：戊二醛有毒。避免吸入和接触。使用实验服和手套，并在通风橱中工作。样品瓶应关闭，除非在冲洗或真空程序中。按照危险废物程序规则处理戊二醛。步骤 3.2.1 至 3.2.5 在通风橱中进行，以避免吸入试剂。
      注：要制备 1 L 磷酸钠缓冲液，pH 值为 7.2，将 68.4 mL 1M Na₂HPO₄ （141.96 g 溶于 1 L 溶液中）加入 31.6 mL 1M NaH₂PO₄ （119.98 g 溶于 1 L 溶液中），并加入 900 mL 软化水填充至 1 L。为了帮助固定剂渗透，将带有根材料的未加盖样品瓶置于低真空 （26 mm Hg） 下，在连接到真空泵的干燥器中 2 分钟。
   2. 用玻璃巴斯德移液管丢弃固定液，并用磷酸钠缓冲液 （3x） 洗涤固定的根。
   3. 用 10 % 乙醇溶液 （v/v） 替换缓冲液 15 分钟，开始逐渐脱水固定的根组织。然后，使用玻璃移液管与 20% 乙醇溶液交换，并保持根部包埋 15 分钟。继续逐步增加乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%、80% 和 90%，每次 15 分钟），直到纯乙醇步骤，其中根应保留 1 小时。
   4. 将脱水的根逐渐嵌入树脂（2-甲基丙烯酸羟乙酯）中。用玻璃移液管，用 3：1 （v/v） 乙醇/树脂溶液代替纯乙醇，并在 4 °C 下保持 24 小时。 随后加入 1：1 和 1：3 （v/v） 乙醇/树脂溶液，每种溶液在 4 °C 下孵育 24 小时。 然后，用补充有过氧化二苯甲酰 （1%） 作为聚合引发剂的纯树脂替换 1：3 （v/v） 溶液。
   5. 将样品放在树脂模具托盘中，加入树脂：二甲基亚砜 15：1 （v/v） 混合物，并在热板上在 60 °C 下保持 48 小时以使树脂硬化。
   6. 根据制造商的说明，将浸渍样品放在配备有钨刀的轮转切片机中，并将 2-5 μm 切片切片到载玻片上。
   7. 通过在室温下将载玻片浸入装有 15% 2,4-二硝基苯肼乙酸溶液的玻璃染色罐中 10 分钟来开始差异染色。然后，在流动的自来水下小心洗涤 15 分钟，然后在 60 °C 的烘箱中干燥（15 分钟）。
   8. 随后，将载玻片浸入高碘酸 （1%） 中 10 分钟，然后在流动的自来水下洗涤 5 分钟，然后在 60 °C 的烘箱中晾干（15 分钟）。
   9. 将载玻片浸入 Schiff′s 试剂（由 1% 副玫瑰苯胺和 4% 焦亚硫酸钠组成，溶于 0.25 M 盐酸中）中 30 分钟。然后，用焦亚硫酸钠溶液 （0.5%） 在盐酸 （0.05 M） 中洗涤 2 分钟。重复 3 次。最后在流动的自来水中洗涤 5 分钟，并在室温下干燥。
   10. 为了形成对比，通过将载玻片浸入 0.05% 甲苯胺蓝 O 中 15 分钟，在流动的自来水中洗涤 15 分钟，然后在 60 °C 的烘箱中干燥（15 分钟）来染色。
   11. 在配备图像捕获硬件的显微镜 （100x） 下观察（图 7）。

结果

胡萝卜盘可用于繁殖和维持几种类型的迁移 PPNs²³。对于 RLN，该技术通常用于维护线虫物种或分离株的参考集合。使用胡萝卜盘，线虫种群在 3 个月内平均增加 100 倍（图 1）。然而，线虫数量差异很大（在 30 倍到 200 倍之间），主要是由于线虫遗传多样性和/或胡萝卜营养成分的变化。此外，尽管采取了多种预防措施来减少微生物?...

讨论

研究受土壤 PPN 攻击的植物的感染和疾病发展机制是困难的，因为这些植物寄生虫通常会感染根系的内部组织并在芽中诱导非特异性症状。尽管温室的环境条件受到控制，但发芽的马铃薯块茎和马铃薯植株的生长在春季和夏季仍然受到青睐，将可用的实验期缩短到每年一个季节。此外，相当多的花盆没有出现马铃薯植物。RLN 的生命周期相对较长，大约需要 2 到 3 个月才能...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-Dinitrophenylhydrazine	Sigma-Aldrich	D199303
2-Hydroxyethyl methacrylate	Sigma-Aldrich	17348
Acetic acid	Sigma-Aldrich	695092
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129
Benzoyl peroxide	Sigma-Aldrich	B5907
borosilicate glass beaker	Sigma-Aldrich	Z231827
Carbenicillin disodium salt	Sigma-Aldrich	C3416
Cefotaxime sodium salt	Sigma-Aldrich	C7039
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301
Ethanol	Supelco	1.00983
Fertilizer	Compo Expert
Flower pot 5 L	VWR	470049-676
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	354400
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Kanamycin monosulfate	Sigma-Aldrich	BP861
LB Broth with agar	Sigma-Aldrich	L3147
MCE syringe filter	Millipore	SLGSR33SS
PARAFILM M sealing film	BRAND	HS234526B-1EA
Pararosaniline hydrochloride	Sigma-Aldrich	P3750
Periodic acid	Sigma-Aldrich	P0430
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003
Scalpel blade no. 24	Romed Holland	BLADE24
Schenk & Hildebrandt Basal salt medium	Duchefa Biochemie	S0225
Schenk & Hildebrandt vitamin mixture	Duchefa Biochemie	S0411
Schiff′s reagent	Sigma-Aldrich	1.09033
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	161519
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011
Soil / Substrate	Compo Sana
Stainless Steel Tweezers	Sigma-Aldrich	22435-U
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161