A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يتم تقديم طريقة قابلة للتكرار لتوليد أنسجة عضلة القلب ثلاثية الأبعاد تجمع بين سقالات بولي كابرولاكتون (PCL) والكتابة الكهربائية الذائبة (MEW) وسقالات بولي كابرولاكتون (PCL) والهيدروجيل الفيبرين مع الخلايا العضلية القلبية والخلايا الليفية المشتقة من hiPSC. توفر هذه التقنية تحكما دقيقا في بنية السقالة ويمكن تطبيقها في اختبار الأدوية قبل السريرية ونمذجة أمراض القلب.
يحمل تطوير أنسجة القلب البشرية الوظيفية وعدا كبيرا بتطوير التطبيقات في فحص الأدوية ونمذجة الأمراض والطب التجديدي. يصف هذا البروتوكول التصنيع التدريجي لأنسجة عضلة القلب ثلاثية الأبعاد مع تقليد متقدم لبنية القلب الأصلية من خلال الجمع بين سقالات بولي كابرولاكتون (PCL) ذات الكتابة الكهربائية الذائبة (MEW) مع الهلاميات المائية الفيبرين والخلايا القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC). تتضمن العملية تضمين مزيج من خلايا عضلة القلب (hiPSC-CMs) والخلايا الليفية القلبية (hiPSC-CFs) داخل مصفوفة الفيبرين لإنشاء أنسجة صغيرة ، مع الدعم الهيكلي الذي توفره السقالات التي تم إنشاؤها بواسطة MEW. يتم تصنيع هذه السقالات الليفية على نطاق الصغر إلى النانو ، مما يسمح بالتحكم الدقيق في بنية الألياف ، والتي تلعب دورا رئيسيا في تنظيم توزيع الخلايا ومحاذاتها. وفي الوقت نفسه ، تعزز مصفوفة الفيبرين بقاء الخلية وتحاكي البيئة خارج الخلية. يكشف توصيف الأنسجة المتولدة عن الأورام القشرية جيدة التنظيم داخل hiPSC-CMs ، إلى جانب نشاط انقباض مستقر. تظهر الأنسجة ضربة عفوية ثابتة في وقت مبكر يصل إلى يومين بعد البذر ، مع وظائف مستدامة بمرور الوقت. يعزز الجمع بين hiPSC-CFs مع hiPSC-CMs السلامة الهيكلية للأنسجة مع دعم بقاء الخلية على المدى الطويل. يوفر هذا النهج طريقة قابلة للتكرار وقابلة للتكيف وقابلة للتطوير لإنشاء نماذج أنسجة القلب المقلدة الحيوية ، مما يوفر منصة متعددة الاستخدامات لاختبار الأدوية قبل السريرية ، والدراسات الميكانيكية لأمراض القلب ، والعلاجات التجديدية المحتملة.
يحمل تصنيع الأنسجة البشرية الوظيفية المصممة بأمراض القلب وعدا كبيرا للتطبيقات عالية التأثير. تمتد هذه من تطوير نمذجة السمية القلبية للأدوية وأمراض القلب البشرية إلى توليد الأنسجة العلاجية ذات الأحجامذات الصلة 1. على الرغم من أن السنوات ال 15 الماضية شهدت تطورات كبيرة في هذا المجال ، إلا أن تصنيع عضلة القلب البشرية عالية المحاكاة يتم إحباطه حاليا بسبب الصعوبات في إعادة إنتاج التنظيم الهيكلي والميكانيكي المعقد لنظيره الطبيعي2.
على الجانب البيولوجي ، فتحت تقنية إعادة برمجة الخلايا الثورية إمكانية تطوير خلايا علاجية خاصة بالمريض. حاليا ، الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) هي المصدر الوحيد لخلايا عضلة القلب البشرية في سياق شخصي. يمكن الحصول على عائد مرتفع من خلايا عضلة القلب باتباع بروتوكولات التمايز القوية3،4. تتمثل إحدى المشكلات الرئيسية في درجة النضج حيث تعرض خلايا عضلة القلب المشتقة من hiPSC البشرية (hiPSC-CMs) المستخدمة حاليا نمطا ظاهريا غير ناضج في ظل ظروف التمايز ثنائية الأبعاد التقليدية5. يرتبط هذا بحقيقة أن التنظيم الهيكلي لأنسجة القلب معقد للغاية ، ويختلف تماما عن الثقافات التقليدية ثنائية الأبعاد. أيضا ، يتكون عضلة القلب من خلايا قلبية وعائية مختلفة ، بما في ذلك الخلايا غير العضلية مثل الخلايا الليفية القلبية ، والعضلات الملساء ، والخلايا البطانية ، مرتبة بشكل منظم من خلال بنية ثلاثية الأبعاد محددة ، مما يسمح بضخ الدم بكفاءة6،7. وبالتالي ، هناك حاجة إلى أنسجة قلبية بشرية مصغرة عالية التنظيم تتكون من جميع أنواع الخلايا الرئيسية لتوليد أنسجة محاكاة حيوية ذات صلة من الناحية الفسيولوجية.
يمكن أن يؤدي تطبيق مناهج التصنيع الحيوي الجديدة إلى كسر هذا الجمود. من بين هؤلاء ، الكتابة بالذوبان الكهربائي (MEW) ، وهي تقنية طباعة ثلاثية الأبعاد متقدمة قادرة على توفير دقة ودقة عالية. في MEW ، يتم استخدام مجال كهربائي لترسيب بوليمر منصهر على شكل ألياف في نطاق حجم الخلية ، وهو ترتيب أصغر من الطباعة ثلاثية الأبعاد لنمذجة الترسيب المنصهر التقليدية (FDM) ، مما ينتج عنه هياكل سقالة محددةللغاية 8،9. لقد ثبت أن MEW قادرة على ترجمة مركب في تصميم السيليكو إلى مصفوفة مطبوعة وضبط الخصائص الفيزيائية في 3D لتتناسب مع تلك الموجودة في أنسجة القلب10. باستخدام تقنية MEW ، من الممكن طباعة شبكات بوليمرية بأشكال وهياكل مختلفة ، جنبا إلى جنب مع الهلاميات المائية الصديقة للخلايا الرخوة ، تولد أنسجة مركبة تحاكي البيئة الميكانيكية الدقيقة والكلية لعضلة القلب الأصلية للبالغين11،12. لقد ثبت أن تعديل تصميم سقالة MEW 3D يغير الوظيفة الناتجة (عابرات الكالسيوم)10 ، مما يؤسس للأسباب لفهم العلاقة بين الشكل والوظيفة على هذا النظام الواعد ثلاثي الأبعاد.
هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل لتصنيع الأنسجة القلبية البشرية المصغرة المقلصة من hiPSC-CMs والخلايا الليفية القلبية البشرية المشتقة من iPSC (hiPSC-CFs) وتركيبها داخل هيدروجيل الفيبرين المقوى بهياكل مطبوعة ثلاثية الأبعاد MEW. تم استخدام إضافة الخلايا الليفية على نطاق واسع في أنظمة مختلفة ثلاثية الأبعاد لتعزيز بقاء hiPSC-CMs والحفاظ على بنية الأنسجة ، ولكن لم يتم استكشاف استخدامها في أنظمة 3D-MEW13. توفر التكنولوجيا الموضحة هنا منصة متعددة الاستخدامات للباحثين تهدف إلى تطوير نماذج دقيقة لأنسجة القلب مع تطبيقات مثل فهم آليات المرض وعلم السموم قبل السريرية وفحص الأدوية. هذا النموذج مناسب لتقييم السمية القلبية للأدوية الراسخة مثل أنثراسيكلين (على سبيل المثال ، دوكسوروبيسين) ، ومثبطات التيروزين كيناز ، والعلاجات الناشئة مثل الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR-T) ، والتي ارتبطت بخلل وظيفي في القلب14. علاوة على ذلك ، يحمل النموذج إمكانات كبيرة في تطوير الطب التجديدي من خلال تمكين اختبار المواد الحيوية والأحبار الحيوية والعلاجات القائمة على الخلايا التي تهدف إلى تحسين وظائف القلب واستعادة أنسجة عضلة القلب في حالات مثل احتشاء عضلة القلب.
تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.
1. إعداد الوسائط والكائف
2. ثقافة iPSC البشرية والمرور
ملاحظة: تم تنفيذ الإجراءات المذكورة هنا مع العديد من خطوط hiPSC ، بما في ذلك UCSFi001-A (ذكر ، هدية لطيفة من البروفيسور بروس كونكلين ، معاهد ديفيد جيه جلادستون) ، ESi044-A (ذكر) ، ESi007-A (أنثى) و ESi044-C (أنثى) و ESi107-A (خط مريض بالإناث من الداء النشواني القلبي) مع تعديلات طفيفة تتعلق بوسط ثقافة hiPSC ، وتخفيف المرور وتركيز CHIR. يحتوي البروتوكول الخاص به على التفاصيل الخاصة باستخدام UCSFi001-A. يتم إجراء جميع حضانات زراعة الخلايا في هذا البروتوكول عند ظروف رطوبة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و 96٪.
3. تمايز خلايا عضلة القلب البشري
ملاحظة: بالنسبة لتوليد خلايا عضلة القلب من hiPSCs (hiPSC-CMs) ، يعتمد البروتوكول الموصوف على منهجية التمايز أحادية الطبقة التي استخدمها Lian et al.3،15 و Burridge et al.4. مع الصيانة الكافية ، يمكن تمييز hiPSC على 30 ممر متتالي بكفاءة تمايز عالية. يتم الكشف عن علامات السلوك غير الطبيعي عن طريق التمايز التلقائي أو الفشل المتتالي لأكثر من 4 تمايزات. يوصى بإجراء ضوابط منتظمة ، بما في ذلك اختبار الميكوبلازما.
4. تمايز الخلايا الليفية القلبية البشرية
ملاحظة: للحصول على الخلايا الليفية القلبية البشرية (hiPSC-CFs) من hiPSCs ، يعتمد البروتوكول التالي على المنهجية المكونة من مرحلتين التي استخدمها Zhang et al.16. تتمثل الخطوة الأولى في الحصول على الخلايا النخابية (hiPSC-EpiCs) عن طريق إعادة تنشيط مسار إشارات Wnt بعد تحريض الأديم المتوسط القلبي. بعد ذلك ، تتعرض hiPSC-EpiCs لمثبطات نمو الأوعية الدموية و FGF2 للحصول على الخلايا الليفية القلبية في 18 يوما.
5. تصنيع سقالات الكتابة بالذوبان الكهربائي (MEW)
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول بوليمر متجانس بولي ε-كابرولاكتون (PCL) من الدرجة الطبية لطباعة السقالات الليفية ، باستخدام طابعة MEW مصممة خصيصا لهذا الغرض من قبل جامعة كوينزلاند للتكنولوجيا10.
6. توليد وصيانة أنسجة الفيبرين المصغرة
ملاحظة: يعتمد توليد الأنسجة المصغرة ثلاثية الأبعاد لعضلة القلب البشرية على تغليف خلايا القلب المشتقة من hiPSC داخل الهلاميات المائية الفيبرينية جنبا إلى جنب مع سقالات MEW التي توفر الدعم الليفي. تم تكييف البروتوكول التالي من مناهج التصميم الهندسي التي استخدمها Breckwoldt et al.17 و Ronaldson-Bouchard et al.18.
7. التحليل المنهجي لإمكانات التمايز القلبي لوظائف الأنسجة المصغرة وسرطان الدم المصغر
توصيف خلايا القلب المشتقة من hiPSC ثنائية الأبعاد
من أجل توليد أنسجة قلبية متعددة الأنماط ، يتم تمييز hiPSC-CMs و hiPSC-CFs بشكل مستقل وتمييزها في المختبر. مع التحسين المناسب والصيانة الصارمة ، سيؤدي البروتوكول التالي إلى عائد hiPSC-CMs يزيد عن 80٪ في اليوم التاسع من الت?...
لإنشاء نموذج نسيج قلبي مصغر مركب ثلاثي الأبعاد يكرر الخصائص الأصلية لعضلة القلب البشرية ، يجب مراعاة العديد من العوامل الأساسية. يمكن تجميعها في ثلاث نقاط رئيسية: (1) تحسين إنتاجية ونقاء الخلايا لتصنيع الأنسجة ، (2) طباعة السقالة الليفية لتقليد البيئة الميكانيكية ثلاثية ?...
لا يوجد تضارب في المصالح بين المؤلفين.
تم تمويل هذا البحث من قبل برنامج البحث والابتكار H2020 بموجب اتفاقيات المنح رقم 874827 (BRAV). وزارة العلوم والجامعات (إسبانيا) من خلال مشاريع PLEC2021-008127 (CARDIOPRINT) و PID2022-142562OB-I00 (VOLVAD) و PID2022-142807OA-I00 (INVESTTRA) بتمويل من MICIU / AEI / 10.13039 / 501100011033 والاتحاد الأوروبي NextGenerationEU / PRTR ؛ Gobierno de Navarra Proyectos Estratégicos IMPRIMED (0011-1411-2021-000096) و BIOHEART (0011-1411-2022-000071) ؛ Gobierno de Navarra Proyectos Colaborativos BIOGEN (PC020-021-022) و Gobierno de Navarra Salud GN32 / 2023. تم إنشاء الشكل 1 أ والشكل 2 أ والشكل 4 أ باستخدام BioRender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
µ-Slide 8 Well chamber coverslip (IbiTreat) | IBIDI | 80826 | |
0.1% Gelatin Solution (Embryomax) | Merck Millipore | ES-006-B | |
10% formalin | Sigma Aldrich | HT501128 | |
12-well plates | Costar/Corning | 3513 | |
6-well plates | Costar/Corning | 3506 | |
Advanced DMEM 1x (ADMEM) | Gibco | 12491015 | |
Aprotinin from bovine lung | Sigma Aldrich | A1153 | |
B-27 SUPLEMENT, PLUS INSULIN (50x) | Life Technologies | A317504044 | |
B27 SUPPLEMENT, MINUS INSULIN (50x) | Life Technologies | A1895601 | |
Biopsy punch (6mm diameter) | Medical | BP-60F | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A9647 | |
CHIR-99021 | AXON MEDCHEM | AXON1386 | |
Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
Culture flask 175 cm | Greiner Bio-One | 660175 | |
Culture flask 75 cm | Falcon | 353136 | |
Cytometer | Beckman Coulter | CytoFlex | |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21202 | |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21207 | |
DPBS (Mg2+, Ca2+ free) | Gibco | A314190094 | |
EDTA 0.5M pH 8.0 | Life Technologies | AM9260G | |
ESSENTIAL 8 MEDIUM KIT | Life Technologies | A1517001 | |
FGF2 (Recombinant Human FGF-basic 154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
Fibrinogen from bovine plasma | Sigma Aldrich | F8630 | |
Fibroblast Growth Medium 3 KIT (FGM3) | PromoCell | C-23130 | |
Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
Lactate (Sodium L-lactate) | Sigma Aldrich | 71718 | |
Matrigel Growth Factor Reduced (MGFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354230 | |
MEW 23-G needle | Nordson | 7018302 | |
MEW printer | QUT, Queensland University of Technology | ||
MEW syringe | Nordson | 7012072 | |
Mouse Anti-Cardiac Troponin T Monoclonal Antibody | Invitrogen | MA5-12960 | |
Mouse Anti-DDR2 monoclonal antibody | Sigma Aldrich | SAB5300116 | |
Mouse Anti-α-actinin (sarcomeric) Monoclonal Antibody | Sigma Aldrich | A7811 | |
PENICILLIN - STREPTOMYCIN | Life Technologies | 15140122 | |
Poly ε-caprolactone (PCL), medical grade | Corbion | PURASORB® PC 12 | |
Rabbit Anti-Vimentin Recombinant Monoclonal Antibody [EPR3776] - Cytoskeleton Marker | Abcam | Ab29547 | |
Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | |
ROCK inhibitor Y-27632 (10mg) | Fisher Scientific | HB2297 | |
RPMI 1640 (L-glutamine) | Gibco | 21875034 | |
RPMI 1640 (no phenol red) | Gibco | 32404014 | |
RPMI no glucose | Gibco | 11879020 | |
SB431542 | SELLECK CHEMICALS | S1067 | |
Spectrophotometer | BMG Labtech | SPECTROstar Nano | |
Thrombin (human alpha thrombin, Factor IIa) | Enzyme Research Lab | HT 1002a | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
TrypLE Express | Life Technologies | 12604021 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | |
Wnt-C59 | AXON MEDCHEM | AXON2287 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved