Geração de tecido miocárdico humano 3D usando escrita eletrogiratória por fusão de andaimes de policaprolactona e células cardíacas derivadas de hiPSC

Resumo

Um método reprodutível é apresentado para gerar tecidos miocárdicos 3D combinando scaffolds de escrita eletrospinning (MEW), policaprolactona (PCL) e hidrogéis de fibrina com cardiomiócitos e fibroblastos derivados de hiPSC. Essa técnica oferece controle preciso sobre a arquitetura do andaime e pode ser aplicada em testes pré-clínicos de medicamentos e modelagem de doenças cardíacas.

Resumo

O desenvolvimento de tecidos cardíacos humanos funcionais é uma promessa significativa para o avanço de aplicações em triagem de medicamentos, modelagem de doenças e medicina regenerativa. Este protocolo descreve a fabricação gradual de tecidos miocárdicos 3D com mimetismo avançado da estrutura cardíaca nativa, combinando andaimes de escrita eletrogiratória por fusão (MEW), policaprolactona (PCL) com hidrogéis de fibrina e células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) O processo envolve a incorporação de uma mistura de cardiomiócitos (hiPSC-CMs) e fibroblastos cardíacos (hiPSC-CFs) dentro de uma matriz de fibrina para criar mini-tecidos, com suporte estrutural fornecido por andaimes gerados por MEW. Esses andaimes fibrilares são fabricados em micro a nanoescala, permitindo um controle preciso sobre a arquitetura da fibra, que desempenha um papel fundamental na organização da distribuição e alinhamento celular. Enquanto isso, a matriz de fibrina promove a viabilidade celular e imita o ambiente extracelular. A caracterização dos tecidos gerados revela sarcômeros bem organizados dentro dos hiPSC-CMs, juntamente com atividade contrátil estável. Os tecidos demonstram batimentos espontâneos consistentes logo dois dias após a semeadura, com funcionalidade sustentada ao longo do tempo. A combinação de hiPSC-CFs com hiPSC-CMs aumenta a integridade estrutural dos tecidos, ao mesmo tempo em que apoia a viabilidade celular a longo prazo. Essa abordagem oferece um método reprodutível, adaptável e escalável para a criação de modelos biomiméticos de tecido cardíaco, fornecendo uma plataforma versátil para testes pré-clínicos de medicamentos, estudos mecanicistas de doenças cardíacas e possíveis terapias regenerativas.

Introdução

A fabricação de tecidos funcionais de engenharia cardíaca humana é uma grande promessa para aplicações de alto impacto. Estes abrangem desde o desenvolvimento da modelagem de cardiotoxicidade de drogas e doenças cardíacas humanas até a geração de tecidos terapêuticos de tamanhos relevantes¹. Embora os últimos 15 anos tenham testemunhado avanços significativos no campo, a fabricação de miocárdio humano altamente mimético é atualmente frustrada por dificuldades em reproduzir a complexa organização estrutural e mecânica de sua contraparte natural².

Do lado biológico, a revolucionária tecnologia de reprogramação celular abriu a possibilidade de desenvolver células terapêuticas específicas do paciente. Atualmente, as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) são a única fonte de cardiomiócitos humanos em um contexto personalizado. Um alto rendimento de cardiomiócitos pode ser obtido seguindo protocolos robustos^{de diferenciação 3,4}. Uma questão fundamental é o grau de maturação, pois os cardiomiócitos humanos derivados de hiPSC (hiPSC-CMs) atualmente usados exibem um fenótipo imaturo sob condições convencionais de diferenciação 2D⁵. Isso está ligado ao fato de que a organização estrutural do tecido cardíaco é muito complexa, absolutamente diferente das culturas 2D convencionais. Além disso, o miocárdio é composto por diferentes células cardiovasculares, incluindo não miócitos, como fibroblastos cardíacos, músculo liso e células endoteliais, dispostas ordenadamente por meio de uma estrutura 3D específica, permitindo um bombeamento sanguíneo eficiente ^6,7. Assim, minitecidos cardíacos humanos altamente estruturados, compostos por todos os principais tipos de células, são necessários para gerar tecidos biomiméticos fisiologicamente relevantes.

A aplicação de novas abordagens de biofabricação pode quebrar esse impasse. Entre eles, a escrita eletrogiratória por fusão (MEW), uma tecnologia avançada de impressão 3D é capaz de fornecer alta precisão e resolução. No MEW, um campo elétrico é usado para depositar um polímero fundido na forma de fibras na faixa de tamanho da célula, uma ordem de magnitude menor do que a impressão 3D convencional de modelagem de deposição fundida (FDM), resultando em estruturas de andaime altamente definidas ^8,9. O MEW demonstrou ser capaz de traduzir um design in silico complexo em uma matriz impressa e ajustar as propriedades físicas em 3D para corresponder às do tecido cardíaco¹⁰. Utilizando a tecnologia MEW, é possível imprimir malhas poliméricas com diferentes formas e estruturas que, combinadas com hidrogéis amigáveis às células moles, geram tecidos compósitos que mimetizam o ambiente micro e macromecânico do miocárdio adulto nativo^11,12. Foi demonstrado que a modificação do design do andaime MEW 3D altera a funcionalidade resultante (transientes de cálcio)¹⁰, estabelecendo as bases para a compreensão da relação forma-função neste promissor sistema de engenharia 3D.

Aqui, um protocolo detalhado é fornecido para a fabricação de minitecidos cardíacos humanos contráteis a partir de hiPSC-CMs e fibroblastos cardíacos derivados de iPSC humanos (hiPSC-CFs) e sua combinação dentro de um hidrogel de fibrina reforçado com estruturas impressas em 3D MEW. A adição de fibroblastos tem sido amplamente utilizada em diferentes sistemas de engenharia 3D para aumentar a sobrevivência de hiPSC-CMs e manter a estrutura do tecido, mas seu uso em sistemas 3D-MEW ainda não foi explorado¹³. A tecnologia descrita aqui fornece uma plataforma versátil para pesquisadores que desejam desenvolver modelos precisos de tecido cardíaco com aplicações como compreensão de mecanismos de doenças, toxicologia pré-clínica e triagem de drogas. Esse modelo é adequado para avaliar a cardiotoxicidade de drogas estabelecidas, como antraciclinas (por exemplo, doxorrubicina), inibidores de tirosina quinase e terapias emergentes, como células T receptoras de antígeno quimérico (CAR-T), que têm sido associadas à disfunção cardíaca¹⁴. Além disso, o modelo possui um potencial significativo no avanço da medicina regenerativa, permitindo o teste de biomateriais, biotintas e terapias baseadas em células destinadas a melhorar a função cardíaca e restaurar o tecido miocárdico em condições como infarto do miocárdio.

Protocolo

Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Configuração de mídia e reagente

1. Pré-revestimento de placas de cultura de células
   1. Prepare alíquotas de estoque Matrigel Growth Factor Reduced (MGFr). Descongele um frasco de MGFr durante a noite na geladeira com gelo. Em um exaustor estéril, usando pontas refrigeradas e mantendo o estoque e os tubos sempre congelados, faça alíquotas de volume adequado diluindo o estoque 1:1 em L-glutamina RPMI 1640 fria (RPMI).
      NOTA: Para a cultura de hiPSC e a semeadura de cardiomiócitos hiPSC (hiPSC-CMs), diferentes diluições de MGFr são usadas. A diluição do revestimento MGFr para hiPSCs varia dependendo da linhagem celular específica. No entanto, uma vez atingido o estágio de cardiomiócitos, a diluição 1:80 é usada independentemente da linhagem celular.
   2. Para revestir placas de cultura de células, descongele lentamente o número necessário de alíquotas de MGFr em gelo e dilua-as ainda mais em RPMI frio, 1:180 para cultura hiPSC (100 μL de MGFr em 9 mL de RPMI) e 1:80 para replaqueamento de hiPSC-CMs (100 μL de MGFr em 4 mL de RPMI).
      1. Adicione imediatamente o MGFr diluído a um volume de 1 mL por poço para placas de 6 poços (manutenção hiPSC) e 0,5 mL por poço para placas de 12 poços (replaqueamento de hiPSC-CMs). Conservar as placas a 4 °C antes de utilizar (até 1 semana).
         NOTA: As placas revestidas com MGFr devem ser aquecidas a 37 °C por 30 minutos antes da semeadura celular. Antes de plaquear as células, aspire o líquido da placa revestida com MGFr.
   3. Para cultura de hiPSC-CFs, cubra os frascos T75 ou T175 com gelatina a 0,1% por pelo menos 15 min à temperatura ambiente (RT) antes do uso, com um volume de 5 mL para T75 ou 10 mL para frascos T175. Após a incubação, aspire o líquido antes da semeadura celular.
2. Meios de cultura celular
   1. Para a cultura hiPSC, use Complete Essential 8 Medium (meio E8) adicionando o Essential 8 Supplement (50x) ao Essential 8 Basal Medium.
   2. Para a diferenciação de cardiomiócitos, prepare:
      1. RPMI/B27 sem insulina (meio -INS): Misturar 500 mL de RPMI e 10 mL de B27 sem suplemento de insulina; RPMI/B27 (meio B27): Misture 500 mL de RPMI e 10 mL de suplemento B27.
   3. Para purificação de cardiomiócitos (meio de lactato), adicione 2 mL de lactato 1 M em 500 mL de RPMI 1640 livre de glicose. O meio pode ser armazenado a 4 °C por até 1 mês.
   4. Para replaqueamento de cardiomiócitos (meio de replaqueamento), suplemente o meio B27 com reposição de soro knock-out a 10% (KSR) e 10 μM de Y27.
      NOTA: O KSR é uma formulação definida e sem soro que substitui o FBS nos protocolos de cultura ESC e iPSC.
   5. Para diferenciação e manutenção de fibroblastos (dia 11 em diante), prepare o meio de crescimento de fibroblastos 3 (FGM3) completo conforme especificado pelo fabricante. Adicione seu pacote de suplementos (0,1 mL / mL de soro fetal de bezerro, 5 μg / mL de insulina humana recombinante e 1 ng / mL de fator de crescimento de fibroblastos humanos básicos, FGF2) ao meio basal FGM3.
      NOTA: Para promover a proliferação de fibroblastos, recomenda-se aumentar a concentração de FGF2 para 10 ng/mL.
   6. Para geração de tecido cardíaco 3D e uso de manutenção, prepare:
      1. Meio de geração de tecidos: Suplemento B27 médio com 1% de penicilina/estreptomicina (P/S), 10% de KSR e 10 μM de Y27. Meio de manutenção tecidual: Prepare o meio B27 com 1% P/S e aprotinina (0,1% (peso/vol); 33 μg/mL).
         NOTA: A aprotinina permite a integridade do gel de fibrina durante o tempo em cultura, evitando sua degradação e mantendo as células dentro do hidrogel. Portanto, é altamente recomendável que seja adicionado ao meio no mesmo dia em que o tecido é gerado.
3. Soluções estoque de moléculas pequenas e fatores de crescimento
   1. CHIR-99021 (CHIR): Para o inibidor de GSK3 e ativador de sinalização Wnt, prepare uma solução estoque de 10 mM dissolvendo-a em DMSO. Conservar as alíquotas a -20 °C durante um período máximo de 6 meses.
      NOTA: As linhas hiPSC podem responder ao tratamento com CHIR de maneira diferente. Pode ser necessária a otimização da concentração de CHI. Recomenda-se o teste CHIR de 6-10 μM.
   2. C59, inibidor de Wnt: Prepare uma solução estoque de 10 mM dissolvendo-a em DMSO. Conservar as alíquotas a -20 °C durante um período máximo de 6 meses.
   3. Y-27632, inibidor de ROCK (Y27): Prepare um estoque de 10 mM dissolvendo-o em DMSO. Armazene alíquotas a -20 °C por até 1 mês. A concentração final depende do tipo de célula-alvo. Use 2 μM (1/5000) para hiPSCs e 10 μM (1/1000) para hiPSC-CMs, hiPSC-CFs e geração de tecidos.
      NOTA: Y27 promove a sobrevivência celular suprimindo a morte celular em suspensão durante o descolamento. Use-o durante a colheita para evitar a morte celular excessiva.
   4. Ácido retinóico: Preparar uma solução-mãe a 30 mM, dissolvendo-a em clorofórmio. Conservar as alíquotas a -20 °C durante um período máximo de 2 anos.
   5. FGF2 (Fator de Crescimento de Fibroblastos Humanos Recombinantes, também FGF-b, promove a proliferação de fibroblastos): Prepare uma solução estoque de 50 μg / mL dissolvendo-a em água estéril. Conservar as alíquotas a -20 °C durante um período máximo de 6 meses.
   6. SB431542 (SB), inibidor de sinalização TGFß1: Prepare uma solução estoque de 10 mM dissolvendo-a em DMSO. Conservar as alíquotas a -20 °C durante um período máximo de 6 meses.
      NOTA: Adicione-o ao meio de fibroblastos para manter o estado de FC e prevenir a transição de miofibroblastos (o fenótipo patológico que surge durante a fibrose) em cultura 2D.
4. Soluções de estoque para hidrogel de fibrina
   1. Fibrinogênio: Prepare uma solução estoque de 200 mg / mL. Primeiro, triture os pedaços de fibrinogênio em um pó fino usando ferramentas estéreis dentro de uma capa de célula. Adicione a solução morna de NaCl a 0,9% (peso / vol) e mantenha-a a 37 ° C até dissolver completamente. Armazenar as alíquotas a -80 °C até um ano; a 4 °C durante 1 semana.
      NOTA: Devido à sua viscosidade a 4 °C, descongele-o e mantenha-o em RT algum tempo antes da etapa de geração do tecido para que possa ser pipetado com precisão. Se uma alíquota não puder ser facilmente pipetada quando reutilizada, é recomendável descartá-la e usar uma nova.
   2. Trombina: Prepare uma solução estoque de 100 U / mL dissolvendo a trombina em PBS estéril a 60% + 40% de água. Conservar as alíquotas a -20 °C durante um ano a 4 °C durante um período máximo de 6 meses.
      NOTA: Antes de usar, descongele-o e mantenha-o no gelo até que a etapa de geração do tecido seja concluída.
   3. Aprotinina: Prepare uma solução estoque de 33 mg / mL dissolvendo a aprotinina em água estéril (100 mg de pó em 3,04 mL de água). Conservar as alíquotas a -20 °C durante um ano.
5. Soluções para análise
   1. Tampão FACS (citometria celular): Prepare uma solução de PBS (livre de Mg²⁺ e Ca²⁺) mais 2,5 mM de EDTA e 5% (v/v) de FBS.

2. Cultura e passagem de iPSC humana

NOTA: Os procedimentos relatados aqui foram realizados com várias linhas hiPSC, incluindo UCSFi001-A (masculino, gentil presente do Professor Bruce Conklin, David J. Gladstone Institutes), ESi044-A (masculino), ESi007-A (feminino) e ESi044-C (feminino) linhas saudáveis e ESi107-A (linha doente feminina de amiloidose cardíaca) com pequenas adaptações relativas ao meio de cultura hiPSC, diluição de passagem e concentração de CHI. O protocolo contém os detalhes específicos para o uso do UCSFi001-A. Todas as incubações de cultura de células neste protocolo são realizadas em condições de 37 °C, 5% CO₂ e 96% de umidade.

1. Linha hiPSC de cultura em placas pré-revestidas de 6 poços 1:180 MGFr. Mantenha-os no meio E8 para garantir a pluripotência.
   NOTA: Para evitar a diferenciação espontânea, é fundamental evitar o crescimento excessivo de culturas. Portanto, realize a passagem do hiPSC quando as células estiverem 80%-90% confluentes.
2. Para a passagem celular, aspire o meio antigo, lave os poços duas vezes com 1 mL de solução de EDTA 0,5 mM diluída em PBS (livre de Mg²⁺ e Ca²⁺) por poço e incube por 7 min em EDTA / PBS em RT para interromper as aderências intercelulares.
3. Aspirar o EDTA/PBS e colher as células, destacando-as por pipetagem vigorosa com uma micropipeta de 1000 μL com 1 ml de meio E8 sobre a superfície do poço até que as células se desprendam. Colete-os em um tubo de centrífuga estéril.
   NOTA: Evite pipetar mais de 10 a 15 vezes, pois isso aumentará a morte por hiPSC.
4. A partir deste volume, faça diluições 1:15-1:20 e semeie as células em placas de 6 poços revestidas com MGF em meio E8 + 2 μM de Y27. Manter o Y27 apenas nas primeiras 24 h após a semeadura para evitar toxicidade por superexposição.
   NOTA: Ajuste a taxa de divisão para outras linhas hiPSC para manter as células indiferenciadas e em uma morfologia saudável por 4-5 dias.
5. Após 24 h, aspire o meio velho e adicione o meio E8 fresco em temperatura ambiente o suficiente para dois dias (geralmente 3-4 mL). Depois disso, troque o meio todos os dias por 3-4 dias.
   NOTA: A frequência de passagem depende de cada linha celular; Evite atingir 100% de confluência. hiPSCs devem crescer em colônias grandes, planas e compactas com geometria poligonal, bordas suavizadas e uma alta relação núcleo/citoplasma.

3. Diferenciação de cardiomiócitos humanos

NOTA: Para a geração de cardiomiócitos a partir de hiPSCs (hiPSC-CMs), o protocolo descrito é baseado na metodologia de diferenciação em monocamada usada por Lian et ^al.3,15 e Burridge et ^al.4. Com manutenção adequada, o hiPSC pode ser diferenciado em 30 passagens consecutivas com alta eficiência de diferenciação. Sinais de comportamento anormal são detectados por diferenciação espontânea ou falha consecutiva de mais de 4 diferenciações. Controles regulares, incluindo testes de micoplasma, são recomendados.

1. Para iniciar a diferenciação cardíaca, colha hiPSCs em 80% -90% de confluência, conforme descrito na etapa de passagem celular acima (etapa 2). Células-semente em placas de 12 poços revestidas com 1:180 MGFr ajustando diluições divididas para obter monocamadas de células compactas a 90% da confluência após 48-72 h de semeadura. Para esta linhagem celular, faça diluições 1:10 e as células atingirão a confluência em 72 h. Troque o meio E8 diariamente.
   NOTA: neste protocolo, as diluições foram ajustadas por volume, não pelo número de células, para evitar variabilidade dependente do usuário. Se o estado monocamada não for alcançado dentro de 72 h após o revestimento, é altamente provável que o processo de diferenciação não seja bem-sucedido. Nesse caso, é aconselhável descartar a tentativa e reiniciar, garantindo a eficiência ideal da passagem.
2. Quando as monocamadas são estabilizadas, inicia-se o processo de diferenciação, considerado doravante como dia 0. Em seguida, troque o meio por meio -INS suplementado com 8 μM de CHIR, o ativador de sinalização Wnt, e incube a placa por 24 h a 37 ° C (1 mL por poço).
   NOTA: Titule a concentração de CHIR entre 6-12 μM para cada linha iPSC para indução eficiente do mesoderma. Nesta etapa, espera-se um alto nível de morte celular, sendo um sinal de um processo ideal.
3. Dia 1: No dia seguinte, aspire o meio de cada poço e lave as células com suplementos RPMI sem (0,5 mL por poço). Em seguida, adicione 1,5 mL de meio -INS fresco e incube as células por 2 dias.
   NOTA: As etapas de lavagem são realizadas durante todas as trocas de mídia para remover detritos, células mortas e resíduos suplementares.
4. Dia 3: Para induzir a especificação da linhagem cardíaca, substitua o meio por 1,5 mL de meio -INS suplementado com 5 μM de inibidor de Wnt C59 por 48 h.
   NOTA: Aqui, o complexo GSK3 é formado e a ß-catenina é degradada, levando à linhagem mesodérmica cardíaca. Alguma morte celular também é observável após esta etapa.
5. Dia 5: Lave e substitua por meio -INS fresco por 48 h a um volume de 1,5 mL por poço, para promover a expansão dos progenitores cardíacos.
6. Dia 7: A partir deste dia, as células são mantidas no meio B27, com troca de meio a cada 2-3 dias.
   NOTA: Ajuste as quantidades de mídia para 2.5 mL por poço para pular a troca de meio durante o fim de semana, mas somente quando esse estado for atingido. Normalmente, os hiPSC-CMs começam a bater espontaneamente nos dias 7-9. Primeiro, a contração será observada como aglomerados isolados e descoordenados, mas em alguns dias, as culturas de alta pureza devem formar uma monocamada uniforme de batimento.
7. Uma vez obtidas, essas monocamadas contráteis (geralmente no dia 10) são submetidas a um processo de seleção metabólica que consiste em 2 ciclos de 72 h em meio lactato separados por uma etapa de replaqueamento para eliminar células não cardiomiócitos e enriquecer a pureza da cultura.
8. Dia 10, primeira etapa de purificação (^1º lactato): Lave as células batedoras com meio de lactato (0,5 mL por poço) e incube-as com 1 mL por poço de meio de lactato por 72 h.
   NOTA: A etapa de lavagem deve ser feita com meio de lactato ou RPMI 1640 sem glicose basal para remover completamente todos os vestígios do meio de glicose anterior (B27).
9. Dia 13: Lave e deixe as células se recuperarem da primeira rodada de purificação com 1,5 mL por poço de meio B27 por 2 dias.
10. Dia 15 (etapa de replaqueamento): Entre os dois ciclos de purificação, dissocie as monocamadas lavando com EDTA/PBS e incubando com TrypLE por 10 min a 37 °C (0,5 mL por poço).
    NOTA: O tempo de incubação depende de cada linha celular.
11. Retire as células usando uma micropipeta de 1000 μL e recupere-as com 0,5 mL por poço de meio B27 suplementado com 10% de KSR (v / v) em um tubo de centrífuga estéril.
    NOTA: Os cardiomiócitos são sensíveis ao estresse de cisalhamento e à pipetagem forte, portanto, tente evitar etapas repetidas de pipetagem. Outras opções para uma dissociação hiPSC-CM de menor dano podem ser o uso de TrypLE 10x ou colagenase com DNase. Otimize o tempo de incubação para garantir que seja suficiente para o desprendimento celular sem causar danos celulares ou exigir pipetagem excessiva, o que pode comprometer a integridade celular.
12. Centrifugue 10 min a 100 x g em RT e recoloque-os em placas de 12 poços revestidas com 1:80 MGFr com meio de regalvanização. Semeá-los em 1 mL por poço.
    NOTA: Isso removerá o excesso de células mortas e matriz depositadas durante a diferenciação, pois elas podem ter um impacto negativo na geração de tecidos.
13. Dia 16: Após 24 h de replaqueamento, remova Y27 e KSR e mantenha as células no meio B27 antes da próxima etapa de purificação (geralmente 48-72 h).
14. Dia 18: Segunda etapa de purificação (^2º lactato). Como no primeiro ciclo, lave e incube as células com meio de lactato por 72 h (1 mL por poço).
    NOTA: Os ciclos de purificação podem aumentar a pureza da cultura em até 30%, conforme observado pela análise de citometria de fluxo do marcador de cardiomiócitos cTNT (troponina T cardíaca) (não mostrado). Este processo reduz principalmente a contaminação por fibroblastos e hiPSC restantes. Embora o nível mínimo de pureza aceitável necessário para prosseguir com a geração de tecido sem comprometer o rendimento não tenha sido determinado, recomenda-se o uso de culturas com pureza de pelo menos 85% a 90%. Esse nível de pureza suporta a melhor fixação dos cardiomiócitos, aumenta a força contrátil do tecido final e suporta a reprodutibilidade entre os experimentos.
15. Dia 21: Quando a purificação do lactato estiver concluída, mantenha os cardiomiócitos purificados no meio B27 até o seu uso, com frequentes mudanças de meio (a cada 2-3 dias).
    NOTA: O atraso no uso diminuirá o rendimento das células, pois elas serão mais difíceis de desprender. Portanto, é aconselhável usá-los entre o dia em que a segunda purificação do lactato termina e menos de uma semana adicional.

4. Diferenciação de fibroblastos cardíacos humanos

NOTA: Para obter fibroblastos cardíacos humanos (hiPSC-CFs) a partir de hiPSCs, o protocolo a seguir é baseado na metodologia de duas fases utilizada por Zhang et ^al.16. O primeiro passo é obter células epicárdicas (hiPSC-EpiCs) reativando a via de sinalização Wnt após a indução cardiogênica do mesoderma. Em seguida, os hiPSC-EpiCs são expostos a inibidores do desenvolvimento vascular e FGF2 para obter fibroblastos cardíacos em 18 dias.

1. Garantir a manutenção, colheita e densidade de semeadura do hiPSC, conforme descrito no protocolo de diferenciação hiPSC-CMs. Cultive hiPSCs em placas de 12 poços revestidas com 1:180 MGFr para iniciar a diferenciação.
2. Quando as monocamadas compactas de hiPSC forem alcançadas (Dia 0), adicione meio -INS suplementado com 5 μM de CHIR (1,5 mL por poço) por 48 h.
   NOTA: Titule a concentração de CHIR para cada linha hiPSC para indução eficiente do mesoderma.
3. Dia 2: Aspirar e descartar o meio, lavar as células com RPMI e substituí-lo por 1,5 mL de meio -INS fresco por 24 h.
   NOTA: Como no protocolo hiPSC-CMs, enxágue as células durante qualquer troca de meio; Dependendo de cada etapa, use o meio basal não suplementado correspondente.
4. Dia 3: Incubar células com meio -INS contendo 5 μM de C59 (inibidor de Wnt) por 48 h (1,5 mL por poço).
5. Dia 5: Para replaqueamento de células mesodérmicas cardíacas, desprenda as células lavando com EDTA/PBS e incubando com TrypLE por 5 min a 37 °C (0,5 mL por poço). Colete as células em 0,5 mL por poço de meio basal Advance DMEM (ADMEM) e centrifugue por 5 min a 300 x g em RT.
6. Semeá-los em placas pré-revestidas de 12 poços 1:180 MGFr (1 mL por poço) a uma densidade de 20.000 células/cm². Para replaqueamento, use ADMEM suplementado com 5 μM de CHIR, 2 μM de ácido retinóico, 10% KSR (v / v) e 10 μM de Y27.
7. Dia 6: Às 24 h após o replaqueamento, atualize o meio para remover o Y27 e diminua o KSR para 2%. Manter as mesmas concentrações de CHIR e ácido retinóico por mais 48 h para alcançar o desenvolvimento de um fenótipo epicárdico.
8. Dia 8: Cultura de células com ADMEM suplementado mais 2% de KSR por 72 h para promover a geração de monocamadas epicárdicas.
   NOTA: hiPSC-EpiCs parecem ser células grandes planas ou cúbicas agrupadas em colônias únicas. Nesse momento, ao realizar as primeiras rodadas de diferenciação, marcadores típicos de células epicárdicas, como WT1 (antígeno nuclear), ZO1 (antígeno de membrana citoplasmática) e TCF21 (antígeno citoplasmático) podem ser analisados por FACS (citometria de células de fluxo) ou IF (coloração de imunofluorescência) (não mostrado).
9. Dia 11: Para replaquear as células epicárdicas, dissocie a lavagem hiPSC-EpiCs com EDTA / PBS e incube com TrypLE por 5 min a 37 ° C (0,5 mL por poço). Colete as células em meio FGM3 (0,5 mL por poço) e centrifugue por 5 min a 300 x g em RT.
10. Replate hiPSC-EpiCs em placas de 12 poços revestidas com gelatina a 0,1% a uma densidade celular de 10.000 células/cm². Use meio FGM3 suplementado com 10 μM de SB (um inibidor de sinalização TGFß1 para evitar a transição de miofibroblastos, geralmente durante a cultura plástica) e 10 μM de Y27 (apenas nas primeiras 24 h).
11. No dia seguinte, atualizar o meio de fibroblastos (FGM3 + 10 μM de SB) a cada 2 dias até que os hiPSC-CFs sejam obtidos, perfazendo um total de cerca de 18 dias para todo o processo.
    NOTA: hiPSC-CFs devem apresentar uma morfologia fusiforme. Aqui, a expressão do marcador de fibroblastos DDR2 deve ser analisada por técnicas FACS e IF (consulte as etapas 7.1-7.2).
12. Uma vez que a cultura hiPSC-CFs seja confluente, realizar passagens celulares 1:3 em frascos T75 ou T175 pré-revestidos com gelatina. As células atingem 90% de confluência em 4-6 dias aproximadamente. Para destacar hiPSC-CFs, use o protocolo de coleta TrypLE descrito para replaqueamento hiPSC-EpiCs; aqui, Y27 não é necessário para a passagem.
13. Manter hiPSC-CFs em meio FGM3 + 10 μM de SB até seu uso ou congelá-los em baixa passagem a uma densidade celular de 1-3 milhões de células por criotubo.
    NOTA: Recomenda-se manter hiPSC-CFs por no máximo 6 passagens antes de descongelar novas células, pois quando cultivadas em frascos de plástico a longo prazo, as células começam a se diferenciar em um fenótipo de miofibroblastos mais contrátil.

5. Fabricação de andaimes de escrita eletrogiratória por fusão (MEW)

NOTA: Este protocolo usa homopolímero de poli ε-caprolactona (PCL) de grau médico para imprimir andaimes fibrilares, usando uma impressora MEW especialmente projetada para esse fim pela QUT, Queensland University of Technology¹⁰.

1. Prepare um estoque de polímero PCL para impressão. Carregue os grânulos de PCL numa seringa de plástico Luer-lock de 3 ml ligada a uma agulha de 23 G e derreta-os a 80 °C durante 2 h na estufa, pressionando suavemente o pistão para remover quaisquer bolhas enquanto o polímero é derretido. Prepare várias seringas e guarde-as em RT, pois o PCL solidifica rapidamente.
2. No dia da impressão, introduza a seringa dentro da câmara de aquecimento e conecte-a a um tubo de alimentação N₂ pressurizado. Ligue o equipamento MEW, ajuste os reguladores de temperatura a 80/65 °C (câmara/bico) e mantenha a seringa por 30 min para garantir a fusão adequada do polímero.
3. Embaixo da seringa, encontra-se a placa coletora, motorizada e móvel nas direções XY por software compatível (Mach3). Mova a placa coletora (controle dos cursores do computador) até que o cabeçote de impressão seja colocado em uma borda da placa ou em qualquer local desejado e ajuste a distância entre a câmara de aquecimento e a placa coletora (distância do coletor) manualmente para 10 mm (plano Z).
   NOTA: Esta distância deve ser testada experimentalmente para atingir um determinado diâmetro de fibra. Quanto menor a distância do coletor, mais espessa é a fibra e vice-versa.
4. Feche a porta do equipamento, que conecta automaticamente a alimentação do campo elétrico. Defina a tensão em 7 kV e a pressão N₂ em 2 bar para que possa extrudar através da ponta de 23 G ao imprimir.
   NOTA: Ao fornecer um alto voltage, é criada uma diferença de potencial entre a ponta da seringa e a placa coletora (feita de aço inoxidável). Em seguida, a gota acumulada no bico pela pressão fornecida torna-se carregada eletrostaticamente, gerando o cone de Taylor, que se dirige em direção à placa coletora. A tensão e a pressão podem ser ajustadas para modificar as dimensões finais da fibra. Os parâmetros de alta pressão extrudarão fibras mais espessas, exigindo maior tensão para estabilizar a fibra. O software é baseado em controle numérico computadorizado (CNC), portanto, as geometrias do andaime são escritas como um código G e alimentadas no programa, que controla o movimento XY e a velocidade do motor da placa do coletor. Portanto, antes de imprimir os andaimes definitivos, recomenda-se imprimir qualquer código G como etapa anterior para obter um jato estável que construa fibras definidas sem qualquer aparência de enrolamento ou chicoteamento. Para isso, otimize os parâmetros com pequenas alterações a cada vez, ou seja, 0,1 bar para pressão do ar, 0,1 kV para tensão e 60-100 mm/min para velocidade do coletor; isso garantirá um comportamento do cone de Taylor do jato.
5. Selecione o código G projetado no software para imprimir andaimes com uma geometria de padrão quadrado. Este exemplo de código G imprime malhas quadradas de 15 camadas de 6 cm x 6 cm com poros quadrados de 0,5 mm x 0,5 mm.
6. Para imprimir fibras depositadas com precisão (ou seja, fibras sobrepostas), ajuste a velocidade do coletor para 1080 mm/min.
   NOTA: Ajuste os parâmetros de tensão, pressão, velocidade do coletor e distância do coletor em cada equipamento MEW para definir diâmetros de fibra precisos (μm). Além da influência dos parâmetros mencionados anteriormente, o aumento da velocidade do coletor resulta em fibras mais finas, enquanto a diminuição produz fibras mais espessas. As configurações de parâmetros neste protocolo permitem a impressão de fibras com diâmetros de 10 a 15 mícrons.
7. Pressione o botão START no software para iniciar a impressão. Remova cuidadosamente o andaime do coletor após a conclusão da impressão.
   NOTA: Para facilitar o manuseio do andaime após a impressão, recomenda-se imprimi-lo em uma peça de vidro maior que o andaime, presa à base do coletor com fita adesiva.
8. Corte a malha impressa com um punção de 6 mm de diâmetro para obter os andaimes finais para a fabricação de tecidos.
9. Como as malhas de PCL são altamente hidrofóbicas, trate-as por 5 min com plasma de O₂/Argônio para aumentar sua hidrofilicidade e promover a interação com a fibrina e as células.
   NOTA: Opcionalmente, um tratamento com 0,1 N de NaOH por 15 min, seguido de extensas lavagens de PBS, também funciona.
10. Esterilize as malhas por imersão em etanol a 70% por 30 min, lave extensivamente com água destilada estéril por 30 min e deixe secar.
    NOTA: Faça este processo em uma placa de Petri estéril e dentro de uma coifa estéril. Não seque completamente as malhas até que sejam utilizadas para evitar a sua aderência à placa e consequente deformação.

6. Geração e manutenção de mini tecidos de fibrina

NOTA: A geração de minitecidos 3D miocárdicos humanos depende do encapsulamento de células cardíacas derivadas de hiPSC em hidrogéis de fibrina combinados com andaimes MEW que fornecem suporte fibrilar. O protocolo a seguir foi adaptado das abordagens de projeto de engenharia utilizadas por Breckwoldt et ^al.17 e Ronaldson-Bouchard et ^al.18.

1. Retire hiPSC-CMs conforme descrito acima na etapa de replaqueamento (3.10-3.11) do protocolo de diferenciação hiPSC-CMs (colheita de TrypLE). Ressuspenda o pellet celular no Meio de Geração de Tecidos para contar as células na Câmara de Neubauer.
2. Separar hiPSC-CFs como na etapa de colheita de hiPSC-CMs com TrypLE. Use 3 mL de TrypLE para T75, 5 mL para frascos T175 e o mesmo volume para inativar a incubação de TrypLE. Por fim, ressuspenda o pellet celular no Meio de Geração de Tecidos, como para CMs, pois eles serão misturados e cultivados no mesmo meio.
3. Conte as células em uma câmara de Neubauer. Calcule o número total exato de células necessárias para semear todos os tecidos.
   NOTA: Este protocolo emprega 1 milhão de células por tecido, consistindo em 80% de CMs e 20% de CFs, ou seja, 800.000 CMs e 200.000 CFs. Outras quantidades, como totais de 1,5 e 3 milhões por tecido, também são alcançáveis com a prática.
4. Misture e pellet as células totais necessárias em um novo tubo (Cell Mix), 5 min a 300 x g em RT. Certifique-se de que o pellet esteja completamente seco e mantenha-o no gelo até a semeadura. Calcule o volume total de hidrogel necessário para semear todos os tecidos.
   NOTA: Este protocolo requer 35 μL por tecido (para um tamanho de andaime de 6 mm de diâmetro) para uma densidade final próxima a 30 milhões de células/mL, mas pode ser aumentada, como já mencionado na etapa 6.4 acima. Cada hidrogel de fibrina consiste em 6 mg/mL de fibrinogênio mais 5 U/mL de trombina junto com o Tissue Generation Medium, no qual as células são ressuspensas. Para um hidrogel de 35 μL, a relação Fibrinogênio/Trombina é de 1,05 μL/1,8 μL. Recomenda-se um volume final extra de 10% de hidrogel para evitar perda de volume devido a erros de pipetagem. Exemplo: para 10 tecidos, ressuspenda as células em 350 μL + 10%, ou seja, 385 μL como volume final total.
5. Ressuspenda a mistura celular no volume necessário de meio de geração de tecido. Misture com cuidado, evitando a formação de bolhas.
   NOTA: Para 10 tecidos, ressuspenda 10 milhões de células (80 CMs: 20 CFs) em 374,5 μL de Meio de Geração de Tecido (volume total de hidrogéis menos a quantidade total de fibrinogênio necessária para tecidos totais, ou seja, 10,5 μL).
6. Adicione o volume necessário de fibrinogênio e misture cuidadosamente. Para 10 tecidos, adicione 10,5 μL de fibrinogênio ao Cell Mix, gerando o Hydrogel Mix. Mantenha-o em RT.
   NOTA: É essencial evitar pipetagem excessivamente repetida para que as forças de cisalhamento não afetem a viabilidade do hiPSC-CMs. Recomenda-se cortar um pedaço da ponta da ponta da pipeta com um bisturi estéril e, em seguida, ressuspender a mistura de hidrogel com ele para reduzir os danos causados pelo cisalhamento.
7. Para evitar a adesão da fibrina à placa, semeie a mistura de hidrogel em uma superfície de politetrafluoretileno (PTFE). Pipete metade do volume de um tecido (17,5 μL), que permanecerá como uma gota, e faça isso para o número total de tecidos.
   NOTA: Não faça mais de 10 lenços de cada vez, pois eles podem secar.
8. Coloque um andaime PCL em cima de cada gota e adicione o volume restante (17,5 μL). Certifique-se de que o andaime esteja completamente imerso.
   NOTA: Esteja preparado para pipetar com as duas mãos, pois a reação é muito rápida. Um lenço de cada vez.
9. Adicione a quantidade necessária de trombina (1,8 μL) com sua mão não dominante e misture rapidamente o hidrogel com a mão dominante (pipetando pelo menos 2-3 vezes).
   NOTA: De preferência, misture pipetando menos do que o volume total, para evitar a formação de bolhas (30 μL). Se uma bolha de ar for formada, pique-a rapidamente com uma agulha.
10. Repita a etapa anterior para cada tecido.
    NOTA: É aconselhável praticar esta técnica sem células até que um bom manuseio seja garantido.
11. Incubar os tecidos a 37 °C durante 1 h para completar a polimerização da fibrina.
12. Pegue suavemente cada tecido pela borda com uma pinça estéril e coloque-os em placas de 12 poços com 2 mL por poço do Tissue Generation Medium suplementado com 33 μg/mL de aprotinina. Coloque um lenço de papel por poço.
    NOTA: Não os pegue pelo centro do hidrogel para que as células possam ser danificadas por força mecânica. Se necessário, use uma espátula.
13. Incubar os tecidos durante 24 h a 37 °C.
    NOTA: É fundamental manter a aprotinina no meio de cultura de tecidos a partir do dia da geração, pois foi observado que a omissão da aprotinina durante as primeiras 24 h, mesmo se adicionada posteriormente, leva ao descolamento parcial das células da tela e do hidrogel. Isso compromete toda a cobertura celular necessária para a integridade do tecido final.
14. No dia seguinte, refresque o meio com 2 mL do Meio de Manutenção Tecidual, retirando os resíduos de KSR e Y27. Mude o meio a cada dois dias a partir daí.

7. Análise sistemática do potencial de diferenciação cardíaca do hiPSC e da função do mini tecido

1. Análise de citometria de fluxo
   NOTA: As células são analisadas usando a modalidade de citometria "Classificação de células ativadas por fluorescência" (FACS) para determinar a eficiência da diferenciação de hiPSC. Todas as etapas são executadas em condições de temperatura ambiente.
   1. Dissocie as culturas de células em suspensão unicelular (colheita de TrypLE), hiPSC-CMs e CFs separadamente.
   2. Ressuspenda o pellet a 250.000 células/mL em tampão FACS e dispense pelo menos 1 mL por tubo. Incubar por 30 min para evitar a ligação de anticorpos não específicos.
   3. Centrifugar as células a 300 x g à RT durante 5 min e rejeitar o sobrenadante.
      NOTA: Todas as etapas de centrifugação são realizadas nessas condições.
   4. Para detectar antígenos intracelulares, fixe e permeabilize as membranas celulares com um kit de permeabilização celular. Primeiro, incube as células com Reactive A (Fix) por 30 min e centrifugue (como na etapa 7.1.3).
   5. Em seguida, incube as células com B reativo (Perm) mais o anticorpo primário por 30 min. Use 100 μL de reativo por tubo.
      1. Para hiPSC-CMs, use o anticorpo cTNT de camundongo (troponina T cardíaca, marcador de CM) na diluição de 1/200. Para hiPSC-CFs, use anticorpo DDR2 de camundongo (receptor de colágeno, marcador de FC) na diluição de 1/500.
         NOTA: Para interromper todas as reações, adicione 1 mL de tampão FACS a cada tubo antes da centrifugação.
   6. Incube por 15 min com anticorpo secundário Alexa-Fluor 488 anti-camundongo diluído 1/100 em tampão FACS.
   7. Lavar 3 vezes com PBS, centrifugando entre lavagens (seguindo as mesmas condições do passo 7.1.3) e, por fim, ressuspender o sedimento celular em 400 μL de PBS. Analisar num citómetro ou num dispositivo semelhante.
2. Análise de coloração por imunofluorescência (IF)
   1. Para culturas de células cardíacas 2D, semeie ambos os tipos de células separadamente em um sistema de poço de câmara de cultura pré-revestido com gelatina a 1:80 ou 0,1%. Placa de aproximadamente 80.000 células/^cm2 para atingir confluência celular suficiente para a análise. Para mini tecidos 3D, transfira-os suavemente com uma pinça para um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
   2. Descarte o meio celular e lave as células ou tecidos com PBS duas vezes. Fixar as amostras com formalina a 10% (v/v) em RT; 15 min para a câmara de lâminas e 1 h para mini lenços de papel.
      CUIDADO: A formalina é perigosa se inalada e deve ser manuseada em um exaustor.
   3. Descarte o tampão de fixação e lave 5 min com PBS três vezes. Armazenar as amostras a 4 °C em PBS até à sua utilização.
   4. Para permeabilizar a membrana celular, incube as células com 0,1% de Triton X-100 (v/v) por 10 min ou tecidos 3D com 1% de Tween-20 por 15 min em RT. Em seguida, lave 5 min com PBS três vezes.
   5. Para reduzir as ligações de anticorpos não específicos, trate as amostras com uma solução de albumina de soro bovino (BSA) a 3% (v/v) por 30 min em RT.
   6. Preparar soluções de anticorpos primários em PBS mais 1% de BSA para bloquear as ligações não específicas e incubá-las durante a noite a 4 °C.
      1. Para hiPSC-CMs 2D, use diluição de 1/400 de anticorpo de camundongo anticardíaco α-ACTN (actinina sarcomérica). Para hiPSC-CFs 2D, use diluição de 1/500 do anticorpo de camundongo Anti-DDR2. Para tecidos 3D, combine os dois anticorpos específicos para CM e CF.
   7. No dia seguinte, aspirar a solução de anticorpos e realizar 3 lavagens com PBS em RT, 5 min cada.
   8. Dilua os anticorpos secundários (Alexa-Fluor 488 e Alexa-Fluor 594) a 1/200 e incube por 1 h em RT no escuro para identificar anticorpos primários de camundongo e coelho, respectivamente. Repita a lavagem PBS três vezes.
   9. Para contracorar os núcleos, incubar amostras com diluição de 1/500 de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 20 min em RT no escuro. Repetir a lavagem com PBS três vezes e armazenar as amostras a 4 °C em PBS.
   10. Examine as amostras com um microscópio confocal, adquira imagens e processe-as com um software adequado, como o Fiji.
   11. Para mini tecidos 3D, transfira-os cuidadosamente com PBS entre duas lamínulas de vidro para permitir uma boa imagem.
       NOTA: Recomenda-se uma imersão em óleo de 40x ou objetiva superior para obter imagens Z-stack em alta resolução.
3. Análise de viabilidade celular
   NOTA: O ensaio Alamar Blue (AB) é usado para medir a atividade metabólica celular, que está diretamente relacionada à viabilidade celular em minitecidos cardíacos 3D. Execute todo o processo protegendo as amostras da luz e sob condições estéreis.
   1. Prepare a solução AB a 10% (v / v) em meio RPMI 1640 sem vermelho de fenol (pois pode interferir na medição colorimétrica).
   2. Transfira cuidadosamente os minitecidos cardíacos para uma placa de 48 poços com pinças estéreis. Incubar construções com 300 μL de solução de AB por tecido por 1 h 30 min (ajustar o tempo experimentalmente) a 37 ° C.
      NOTA: À medida que as células reduzem a resazurina através da ação de enzimas metabólicas, será gerada uma mudança de cor no meio de cultura, que será medida por espectrofotometria a 570 nm e 600 nm.
   3. Para medição, colete 100 μL por tecido da solução AB metabolizada em uma placa de 96 poços e leia as absorbâncias.
      NOTA: As amostras podem ser cultivadas após esta análise, alterando o meio para Meio de Manutenção de Tecido mais uma vez.
4. Análise de contração
   NOTA: Os minitecidos cardíacos começam a bater espontaneamente, geralmente 1-2 dias após a geração do tecido.
   1. Meça manualmente a frequência de batimentos observando os tecidos sob o microscópio óptico (batimentos/min). Se muitos tecidos forem medidos ao mesmo tempo, mantenha as placas aquecidas antes de cada leitura.
      NOTA: À medida que a temperatura diminui, a taxa de batimento também começa a diminuir.
   2. Para avaliação estendida da contratilidade cardíaca, obtenha vídeos de microscopia óptica dos tecidos batendo. Em 4x para capturar um plano maior ou em 10x de diferentes áreas de tecido. Grave cerca de 30 s por vídeo (pelo menos 3 batidas).
   3. Use uma taxa de quadros de pelo menos 30 quadros/s e salve o vídeo em .AVI formato.
      NOTA: Aqui, os vídeos foram analisados com um algoritmo de ponto de rastreamento personalizado desenvolvido para o MATLAB¹⁰. Com este método, a velocidade de contração, o deslocamento máximo de contração (amplitude) e a direção de contração podem ser obtidos para cada vídeo.
   4. Execute diretamente o algoritmo no MATLAB para os vídeos contidos na pasta de análise. Ele fornecerá automaticamente um documento do Excel de resultados com os valores de velocidade de contração por quadro, amplitude de contração por quadro, ângulo de contração (direção) e seus respectivos desvios padrão¹⁰.
   5. Multiplique a "Velocidade de contração por fotograma" pela resolução da câmara (μm/pixel) e pela taxa de fotogramas da câmara (fotogramas/s). Isso dará o valor final da velocidade de contração (μm/s).
   6. Multiplique 'Amplitude de contração por quadro' pela resolução da câmera (μm/pixel) e isso dará o valor final da amplitude de contração (μm).
      NOTA: Seria possível analisar a cinética de contração com mais profundidade usando softwares como o MUSCLEMOTION, como discutido em outro lugar^19,20. A configuração da imagem deve capturar pelo menos 60 quadros/s para análise com o software.

Resultados

Caracterização de células cardíacas derivadas de hiPSC 2D
Para gerar tecidos cardíacos multifenotípicos, hiPSC-CMs e hiPSC-CFs são independentemente diferenciados e caracterizados in vitro. Com otimização apropriada e manutenção rigorosa, o protocolo a seguir resultará em um rendimento de hiPSC-CMs de mais de 80% por volta do dia 9 de diferenciação, dando origem a células batendo espontaneamente (Figura 1A). Além ...

Discussão

Para gerar um modelo de mini-tecido cardíaco composto 3D que reproduza as características nativas do miocárdio humano, vários fatores essenciais devem ser considerados. Estes podem ser agrupados em três pontos principais: (1) otimizar o rendimento e a pureza das células para a fabricação de tecidos, (2) imprimir o andaime fibrilar para imitar o ambiente mecânico 3D e (3) integrar o hidrogel de fibrina no processo de fabricação.

Algumas das principai...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide 8 Well chamber coverslip (IbiTreat)	IBIDI	80826
0.1% Gelatin Solution (Embryomax)	Merck Millipore	ES-006-B
10% formalin	Sigma Aldrich	HT501128
12-well plates	Costar/Corning	3513
6-well plates	Costar/Corning	3506
Advanced DMEM 1x (ADMEM)	Gibco	12491015
Aprotinin from bovine lung	Sigma Aldrich	A1153
B-27 SUPLEMENT, PLUS INSULIN (50x)	Life Technologies	A317504044
B27 SUPPLEMENT, MINUS INSULIN (50x)	Life Technologies	A1895601
Biopsy punch (6mm diameter)	Medical	BP-60F
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A9647
CHIR-99021	AXON MEDCHEM	AXON1386
Confocal Laser Scanning Microscope	Zeiss	LSM 800
Culture flask 175 cm	Greiner Bio-One	660175
Culture flask 75 cm	Falcon	353136
Cytometer	Beckman Coulter	CytoFlex
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21202
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-21207
DPBS (Mg2+, Ca2+ free)	Gibco	A314190094
EDTA 0.5M pH 8.0	Life Technologies	AM9260G
ESSENTIAL 8 MEDIUM KIT	Life Technologies	A1517001
FGF2 (Recombinant Human FGF-basic 154 a.a.)	Peprotech	100-18B
Fibrinogen from bovine plasma	Sigma Aldrich	F8630
Fibroblast Growth Medium 3 KIT (FGM3)	PromoCell	C-23130
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828028
Lactate (Sodium L-lactate)	Sigma Aldrich	71718
Matrigel Growth Factor Reduced (MGFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354230
MEW 23-G needle	Nordson	7018302
MEW printer	QUT, Queensland University of Technology
MEW syringe	Nordson	7012072
Mouse Anti-Cardiac Troponin T Monoclonal Antibody	Invitrogen	MA5-12960
Mouse Anti-DDR2 monoclonal antibody	Sigma Aldrich	SAB5300116
Mouse Anti-α-actinin (sarcomeric) Monoclonal Antibody	Sigma Aldrich	A7811
PENICILLIN - STREPTOMYCIN	Life Technologies	15140122
Poly ε-caprolactone (PCL), medical grade	Corbion	PURASORB® PC 12
Rabbit Anti-Vimentin Recombinant Monoclonal Antibody [EPR3776] - Cytoskeleton Marker	Abcam	Ab29547
Retinoic Acid	Sigma Aldrich	R2625
ROCK inhibitor Y-27632 (10mg)	Fisher Scientific	HB2297
RPMI 1640 (L-glutamine)	Gibco	21875034
RPMI 1640 (no phenol red)	Gibco	32404014
RPMI no glucose	Gibco	11879020
SB431542	SELLECK CHEMICALS	S1067
Spectrophotometer	BMG Labtech	SPECTROstar Nano
Thrombin (human alpha thrombin, Factor IIa)	Enzyme Research Lab	HT 1002a
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
TrypLE Express	Life Technologies	12604021
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287
Wnt-C59	AXON MEDCHEM	AXON2287