폴리카프로락톤 골격 및 hiPSC 유래 심장 세포의 용융 전기방사 쓰기를 사용한 3D 인간 심근 조직 생성

요약

용융 전기방사 쓰기(MEW), 폴리카프로락톤(PCL) 스캐폴드 및 피브린 하이드로겔을 hiPSC 유래 심근세포 및 섬유아세포와 결합한 3D 심근 조직을 생성하기 위해 재현 가능한 방법이 제시됩니다. 이 기술은 스캐폴드 아키텍처를 정밀하게 제어하며 전임상 약물 테스트 및 심장 질환 모델링에 적용할 수 있습니다.

초록

기능성 인간 심장 조직의 개발은 약물 스크리닝, 질병 모델링 및 재생 의학 분야의 응용 분야를 발전시키는 데 중요한 가능성을 가지고 있습니다. 이 프로토콜은 MEW(melt electrospinning writing), PCL(polycaprolactone) 골격을 피브린 하이드로겔 및 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC) 유래 심장 세포와 결합하여 천연 심장 구조를 고급 모방한 3D 심근 조직의 단계적 제작을 설명합니다. 이 과정에는 섬유소 매트릭스 내에 심근세포(hiPSC-CM)와 심장 섬유아세포(hiPSC-CF)의 혼합물을 삽입하여 MEW에서 생성된 골격이 제공하는 구조적 지지와 함께 미니 조직을 만드는 작업이 포함됩니다. 이 섬유소 골격은 마이크로에서 나노 규모로 제작되어 세포 분포 및 정렬을 구성하는 데 중요한 역할을 하는 섬유 구조를 정밀하게 제어할 수 있습니다. 한편, 피브린 기질은 세포 생존력을 촉진하고 세포 외 환경을 모방합니다. 생성된 조직의 특성화는 안정적인 수축 활동과 함께 hiPSC-CM 내에서 잘 조직된 sarcomeres를 나타냅니다. 이 조직은 파종 후 빠르면 이틀 후부터 일관된 자발적 박동을 보여주며 시간이 지남에 따라 지속적인 기능을 발휘합니다. hiPSC-CF와 hiPSC-CM의 조합은 조직의 구조적 무결성을 향상시키는 동시에 장기적인 세포 생존력을 지원합니다. 이 접근 방식은 생체 모방 심장 조직 모델을 만들기 위한 재현 가능하고 적응 가능하며 확장 가능한 방법을 제공하여 전임상 약물 테스트, 심장 질환의 기계론적 연구 및 잠재적인 재생 요법을 위한 다목적 플랫폼을 제공합니다.

서문

기능성 인간 심장 공학 조직의 제작은 충격이 큰 응용 분야에 큰 가능성을 가지고 있습니다. 이는 심장독성 약물 및 인간 심장 질환 모델링 개발부터 관련 크기의 치료 조직 생성에 이르기까지^{다양합니다 1}. 지난 15년 동안 이 분야에서 상당한 발전이 있었지만, 고도로 모방적인 인간 심근의 제작은 현재 자연적 대응²의 복잡한 구조적, 기계적 조직을 재현하는 데 어려움이 있어 방해를 받고 있습니다.

생물학적 측면에서, 혁신적인 세포 재프로그래밍 기술은 환자 맞춤형 치료용 세포를 개발할 수 있는 가능성을 열었습니다. 현재 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)는 개인화된 맥락에서 인간 심근세포의 유일한 공급원입니다. 높은 수율의 심근세포는 강력한 분화 프로토콜 ^3,4에 따라 얻을 수 있습니다. 핵심 쟁점은 현재 사용되는 human hiPSC-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM)가 기존의 2D 분화 조건 하에서 미성숙 표현형을 나타내기 때문에 성숙 정도입니다⁵. 이는 심장 조직의 구조적 조직이 매우 복잡하고 기존의 2D 배양과 완전히 다르다는 사실과 관련이 있습니다. 또한 심근은 심장 섬유아세포, 평활근, 내피 세포와 같은 비근세포를 포함한 다양한 심혈관 세포로 구성되어 있으며, 특정 3D 구조를 통해 질서 정연하게 배열되어 있어 혈액을 효율적으로 펌핑할 수 있습니다 ^6,7. 따라서 모든 주요 세포 유형으로 구성된 고도로 구조화된 인간 심장 미니 조직은 생리학적으로 관련된 생체 모방 조직을 생성하는 데 필요합니다.

새로운 바이오 제조 접근법을 적용하면 이러한 교착 상태를 타개할 수 있습니다. 이 중 첨단 3D 프린팅 기술인 MEW(Melt Electrospinning Writing)는 높은 정밀도와 해상도를 제공할 수 있습니다. MEW에서는 전기장을 사용하여 기존의 융합 증착 모델링(FDM) 3D 프린팅보다 훨씬 작은 크기의 섬유 형태로 용융 폴리머를 증착하여 고도로 정의된 골격 구조를 생성합니다 ^8,9. MEW는 인실리코(in silico) 복합체 설계를 프린팅된 매트릭스로 변환하고 심장 조직의 특성과 일치하도록 물리적 특성을 3D로 조정할 수 있는 것으로 나타났습니다¹⁰. MEW 기술을 사용하면 부드러운 세포 친화적 인 하이드로겔과 결합하여 천연 성인 심근^{11 , 12} 의 미시 및 거시 기계적 환경을 모방 한 복합 조직을 생성하는 다양한 모양과 구조의 고분자 메쉬를 인쇄 할 수 있습니다. MEW 3D 스캐폴드의 설계를 수정하면 결과 기능(칼슘 과도 현상)¹⁰이 변경되는 것으로 나타나 이 유망한 3D 엔지니어링 시스템에서 형태-기능 관계를 이해할 수 있는 근거를 마련했습니다.

여기에서는 hiPSC-CM 및 인간 iPSC 유래 심장 섬유아세포(hiPSC-CF)로부터 수축성 인간 심장 미니 조직을 제작하고 3D MEW 프린팅 구조로 강화된 피브린 하이드로겔 내에서 이들의 조합에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 섬유아세포의 추가는 hiPSC-CM의 생존을 향상시키고 조직 구조를 유지하기 위해 다양한 3D 엔지니어링 시스템에서 널리 사용되어 왔지만, 3D-MEW 시스템에서의 사용은 아직 연구되지 않았습니다¹³. 여기에 설명된 기술은 질병 메커니즘 이해, 전임상 독성학 및 약물 스크리닝과 같은 응용 프로그램을 통해 정확한 심장 조직 모델을 개발하려는 연구자를 위한 다목적 플랫폼을 제공합니다. 이 모델은 심장 기능 장애와 관련이 있는 안트라사이클린(예: 독소루비신), 티로신 키나아제 억제제 및 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포와 같은 새로운 치료법과 같은 기존 약물의 심장독성을 평가하는 데 적합합니다¹⁴. 또한 이 모델은 심근 경색과 같은 조건에서 심장 기능을 개선하고 심근 조직을 복원하는 것을 목표로 하는 생체 재료, 바이오잉크 및 세포 기반 요법의 테스트를 가능하게 함으로써 재생 의학을 발전시키는 데 상당한 잠재력을 가지고 있습니다.

프로토콜

이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 배지 및 시약 설정

1. 세포 배양 플레이트의 사전 코팅
   1. MGFr(Matrigel Growth Factor Reduced) 주식 부분 표본을 준비합니다. MGFr 한 바이알을 얼음에 담아 냉장고에서 하룻밤 동안 해동합니다. 멸균 후드에서 냉장 팁을 사용하고 스톡과 튜브를 항상 얼음 위에 보관하고 저온 RPMI 1640 L-글루타민(RPMI)에 스톡을 1:1로 희석하여 적절한 부피의 부분 표본을 만듭니다.
      참고: hiPSC 배양 및 hiPSC-심근세포(hiPSC-CM)의 파종을 위해 다양한 MGFr 희석액이 사용됩니다. hiPSC에 대한 MGFr 코팅 희석은 특정 세포주에 따라 다릅니다. 그러나 심근세포 단계에 도달하면 세포주에 관계없이 1:80 희석이 사용됩니다.
   2. 세포 배양 플레이트를 코팅하려면 얼음에서 필요한 수의 MGFr 분취량을 천천히 해동하고 차가운 RPMI, hiPSC 배양의 경우 1:180(9mL의 RPMI 중 MGFr 100μL), hiPSC-CM 리플레팅의 경우 1:80(RPMI 4mL의 MGFr 중 100μL)으로 더 희석합니다.
      1. 즉시 6-well 플레이트(hiPSC 유지)의 경우 well당 1mL의 부피로 희석된 MGFr을 첨가하고 12-well plate(hiPSC-CM replating)의 경우 well당 0.5mL의 부피로 추가합니다. 사용하기 전에 플레이트를 4 ° C에서 보관하십시오 (최대 1 주일).
         참고: MGFr 코팅 플레이트는 세포 파종 전에 37°C에서 30분 동안 예열해야 합니다. 세포를 도금하기 전에 MGFr 코팅된 플레이트에서 액체를 흡입합니다.
   3. hiPSC-CF 배양의 경우, T75 또는 T175 플라스크를 사용하기 전에 실온(RT)에서 최소 15분 동안 0.1% 젤라틴으로 코팅하며, T75 플라스크의 경우 5mL, T175 플라스크의 경우 10mL의 부피로 코팅합니다. 배양 후 세포 파종 전에 액체를 흡입하십시오.
2. 세포 배양 배지
   1. hiPSC 배양의 경우, Essential 8 Supplement (50x)를 Essential 8 Basal Medium에 첨가하여 Complete Essential 8 Medium (E8 medium)를 사용하십시오.
   2. 심근세포 분화를 위해 다음을 준비하십시오.
      1. 인슐린이 없는 RPMI/B27(-INS 배지): 인슐린 보충제가 없는 RPMI 500mL와 B27 10mL를 혼합합니다. RPMI/B27 (B27 배지): RPMI 500 mL와 B27 보충제 10 mL를 혼합합니다.
   3. 심근세포 정제(젖산 배지)를 위해 1M 젖산 2mL를 포도당이 없는 RPMI 1640 500mL에 첨가합니다. 배지는 최대 1개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
   4. 심근세포 재생(Replating Medium)의 경우, B27 배지에 10% 녹아웃 혈청 대체(KSR)와 10μM의 Y27을 보충합니다.
      참고: KSR은 ESC 및 iPSC 배양 프로토콜에서 FBS를 대체하는 정의된 무혈청 제형입니다.
   5. 섬유아세포 분화 및 유지 관리(11일차 이후)를 위해 제조업체에서 지정한 대로 완전한 섬유아세포 성장 배지 3(FGM3)을 준비합니다. FGM3 기저 배지에 보충제 팩(0.1mL/mL 태아 송아지 혈청, 5μg/mL 재조합 인간 인슐린, 1ng/mL 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자, FGF2)을 추가합니다.
      참고: 섬유아세포 증식을 촉진하려면 FGF2 농도를 10ng/mL로 높이는 것이 좋습니다.
   6. 3D 심장 조직 생성 및 유지 관리에 사용하려면 다음을 준비하십시오.
      1. 조직 생성 배지: B27 배지에 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S), 10% KSR 및 10μM의 Y27을 보충합니다. 조직 유지 배지: 1% P/S 및 아프로티닌(0.1%(wt/vol); 33μg/mL)이 포함된 B27 배지를 준비합니다.
         참고: 아프로티닌은 배양 기간 동안 피브린 겔 무결성을 허용하여 분해를 방지하고 하이드로겔 내 세포를 유지합니다. 그러므로, 조직이 생성되는 당일에 배지에 첨가하는 것이 적극 권장된다.
3. Small molecule 및 Growth Factor 스톡 솔루션
   1. CHIR-99021(CHIR): GSK3 억제제 및 Wnt 신호 활성화제의 경우 DMSO에 용해하여 10mM 원액을 준비합니다. 부분 표본은 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관합니다.
      참고: hiPSC 라인은 CHIR 치료에 다르게 반응할 수 있습니다. CHIR 농도의 최적화가 필요할 수 있습니다. 6-10μM CHIR 테스트가 권장됩니다.
   2. C59, Wnt 억제제: 10mM 원액을 DMSO에 용해시켜 준비합니다. 부분 표본은 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관합니다.
   3. Y-27632, ROCK 억제제(Y27): 10mM 스톡을 DMSO에 용해하여 준비합니다. 부분 표본은 -20 °C에서 최대 1개월 동안 보관합니다. 최종 농도는 표적 세포 유형에 따라 다릅니다. hiPSC의 경우 2μM(1/5000)를 사용하고 hiPSC-CM, HIPSC-CF 및 조직 생성의 경우 10μM(1/1000)를 사용합니다.
      참고: Y27은 분리 중 현탁액 상태에서 세포 사멸을 억제하여 세포 생존을 촉진합니다. 과도한 세포 사멸을 피하기 위해 수확 시 사용하십시오.
   4. 레티노산: 30mM 원액을 클로로포름에 용해시켜 준비합니다. 부분 표본은 -20°C에서 최대 2년 동안 보관합니다.
   5. FGF2(재조합 인간 섬유아세포 성장 인자, FGF-b, 섬유아세포 증식 촉진): 50μg/mL 원액을 멸균수에 용해시켜 준비합니다. 부분 표본을 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관합니다.
   6. SB431542(SB), TGFß1 신호전달 억제제: 10mM 원액을 DMSO에 용해시켜 준비합니다. 부분 표본을 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관합니다.
      참고: 섬유아세포 배지에 첨가하여 CF 상태를 유지하고 2D 배양에서 근섬유아세포 전이(섬유증 중에 발생하는 병리학적 표현형)를 방지합니다.
4. 피브린 하이드로겔을 위한 재고 솔루션
   1. 피브리노겐: 200mg/mL 원액을 준비합니다. 먼저 세포 후드 내부의 멸균 도구를 사용하여 피브리노겐 덩어리를 미세한 분말로 분쇄합니다. 따뜻한 0.9%(wt/vol) NaCl 용액을 넣고 완전히 용해될 때까지 37°C로 유지합니다. 부분 표본을 -80 ° C에서 최대 1 년까지 보관하십시오. 4 °C에서 1 주일 동안.
      참고: 점도가 4°C이기 때문에 해동하고 조직 생성 단계 전에 일정 시간 동안 RT를 유지하여 정확하게 피펫팅할 수 있도록 하십시오. 부분 표본을 재사용했을 때 쉽게 파이펫화할 수 없는 경우 폐기하고 새 것을 사용하는 것이 좋습니다.
   2. 트롬빈: 멸균 60% PBS + 40% 물에 트롬빈을 용해시켜 100U/mL 스톡 용액을 준비합니다. 부분 표본은 -20 °C에서 최대 1년, 4 °C에서 최대 6개월 동안 보관합니다.
      알림: 사용하기 전에 해동하고 조직 생성 단계가 완료될 때까지 얼음에 보관하십시오.
   3. 아프로티닌: 아프로티닌을 멸균수(물 3.04mL에 분말 100mg)에 용해시켜 33mg/mL 스톡 용액을 준비합니다. 부분 표본을 -20 °C에서 최대 1년 동안 보관하십시오.
5. 분석을 위한 솔루션
   1. FACS 완충액(세포 세포 분석): PBS 용액(Mg²⁺ 및 Ca²⁺-free)과 2.5mM의 EDTA 및 5%(v/v) FBS를 준비합니다.

2. 인간 iPSC 배양 및 통과

참고: 여기에 보고된 절차는 UCSFi001-A(남성, David J. Gladstone Institutes의 브루스 콘클린 교수의 친절한 선물), ESi044-A(남성), ESi007-A(여성) 및 ESi044-C(여성) 건강한 세포주 및 ESi107-A(심장 아밀로이드증 여성 질환 라인)를 포함한 여러 hiPSC 라인으로 수행되었으며, hiPSC 배양 배지, 계대 노화 희석 및 CHIR 농도와 관련된 경미한 적응이 있습니다. 이 프로토콜에는 UCSFi001-A의 사용과 관련된 세부 정보가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜의 모든 세포 배양 배양은 37°C, 5% CO₂ 및 96% 습도 조건에서 수행됩니다.

1. 1:180 MGFr 사전 코팅된 6웰 플레이트의 배양 hiPSC 라인. 다능성을 보장하기 위해 E8 매체에서 유지하십시오.
   참고: 자발적인 분화를 방지하기 위해서는 배양물의 과도한 증식을 피하는 것이 중요합니다. 따라서 세포가 80%-90% 융합될 때 hiPSC 계대를 수행합니다.
2. 세포 통과의 경우, 기존 배지를 흡인하고, 웰당 PBS(Mg²⁺- 및 Ca²⁺-free)로 희석된 0.5mM EDTA 용액 1mL로 웰을 두 번 세척하고, RT에서 EDTA/PBS에서 7분 동안 배양하여 세포 간 접착을 방해합니다.
3. EDTA/PBS를 흡인하고 세포를 수확한 후 세포가 분리될 때까지 웰 표면에 1mL의 E8 배지가 있는 1000μL 마이크로피펫으로 격렬하게 피펫팅하여 세포를 분리합니다. 멸균 원심분리기 튜브에 모으십시오.
   참고: 10-15회 이상 피펫팅은 hiPSC 사망을 증가시킬 수 있으므로 피하십시오.
4. 이 부피에서 1:15-1:20 희석을 만들고 E8 배지 + 2μM의 Y27에서 MGF로 코팅된 6웰 플레이트에 세포를 시딩합니다. 과다 노출로 인한 독성을 피하기 위해 파종 후 처음 24시간 동안만 Y27을 유지하십시오.
   참고: 다른 hiPSC 라인의 분할 비율을 조정하여 세포가 4-5일 동안 분화되지 않고 건강한 형태를 유지하도록 합니다.
5. 24 시간 후, 오래된 배지를 흡입하고 2 일 동안 충분히 신선한 실온 E8 배지 (보통 3-4 mL)를 첨가하십시오. 그 후 3-4일 동안 매일 배지를 교체하십시오.
   참고: 계대 빈도는 각 세포주에 따라 다릅니다. 컨플루언스의 100%에 도달하지 않도록 합니다. hiPSC는 다각형 기하학, 매끄러운 가장자리 및 높은 핵/세포질 비율을 가진 크고 평평하며 조밀한 군체에서 성장해야 합니다.

3. 인간 심근세포 분화

참고: hiPSC(hiPSC-CM)에서 심근세포 생성을 위해 설명된 프로토콜은 Lian et ^al.3,15 및 Burridge et ^al.4에서 사용한 단층 분화 방법론을 기반으로 합니다. 적절한 유지 관리를 통해 hiPSC는 높은 차별화 효율로 30개의 연속된 계대를 통해 구별할 수 있습니다. 비정상적인 행동의 징후는 자발적인 분화 또는 4개 이상의 분화가 연속적으로 실패하는 것으로 감지됩니다. 마이코플라스마 검사를 포함한 정기적인 대조군이 권장됩니다.

1. 심장 분화를 시작하려면 위의 세포 통로 단계(2단계)에 설명된 대로 80%-90% 합류점에서 hiPSC를 채취합니다. 1:180 MGFr 코팅된 12웰 플레이트의 종자 세포는 분할 희석을 조정하여 48-72시간의 파종 후 90%의 포화도에서 조밀한 세포 단층을 달성합니다. 이 세포주에 대해 1:10 희석을 하면 세포가 72시간에 포화도를 달성합니다. E8 배지를 매일 변경합니다.
   참고: 이 프로토콜에서는 사용자 의존적 변동성을 방지하기 위해 세포 수가 아닌 부피에 따라 희석이 조정되었습니다. 도금 후 72시간 이내에 단층 상태가 달성되지 않으면 분화 과정이 성공하지 못할 가능성이 높습니다. 이러한 경우 시도를 취소하고 다시 시작하여 최적의 패시징 효율성을 보장하는 것이 좋습니다.
2. 단층이 안정화되면 분화 과정이 시작되며, 이후 0일로 간주됩니다. 그런 다음 배지를 Wnt 신호 활성화제인 8μM의 CHIR이 보충된 -INS 배지로 변경하고 37°C(웰당 1mL)에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.
   참고: 효율적인 중배엽 유도를 위해 각 iPSC 라인에 대해 6-12μM 사이의 적정 CHIR 농도. 이 단계에서는 높은 수준의 세포 사멸이 예상되며, 이는 최적의 과정의 신호입니다.
3. 1일차: 다음 날, 각 웰에서 배지를 흡인하고 보충제가 없는 RPMI(웰당 0.5mL)로 세포를 세척합니다. 그런 다음 1.5mL의 신선한 -INS 배지를 추가하고 2일 동안 세포를 배양합니다.
   참고: 세척 단계는 파편, 죽은 세포 및 보충 잔류물을 제거하기 위해 모든 매체 교체 중에 수행됩니다.
4. 3일차: 심장 계통 사양을 유도하기 위해 배지를 48시간 동안 5μM의 Wnt 억제제 C59가 보충된 1.5mL의 -INS 배지로 교체합니다.
   참고: 여기에서 GSK3 복합체가 형성되고 ß-catenin이 분해되어 심장 중배엽 계통으로 이어집니다. 이 단계 후에 일부 세포 사멸도 관찰할 수 있습니다.
5. 5일차: 심장 전구세포의 확장을 촉진하기 위해 웰당 1.5mL의 부피로 48시간 동안 세척하고 새 -INS 배지로 교체합니다.
6. 7일차: 이 날부터 세포는 B27 배지에서 유지되며 2-3일마다 배지가 교체됩니다.
   참고: 배지 수량을 웰당 2.5mL로 조정하여 주말 동안 배지 교체를 건너뛸 수 있지만 이 상태에 도달한 후에만 가능합니다. 일반적으로 hiPSC-CM은 7-9일째에 자발적으로 박동하기 시작합니다. 첫째, 수축은 고립되고 조정되지 않은 클러스터로 관찰되지만 며칠 안에 고순도 배양은 균일한 박동 단층을 형성해야 합니다.
7. 일단 얻어지면, 이러한 수축성 단층(보통 10일째)은 비-심근세포 세포를 제거하고 배양물의 순도를 풍부하게 하기 위해 리플레팅 단계로 분리된 젖산 배지에서 72시간의 2주기로 구성된 대사 선택 과정을 거칩니다.
8. 10일차, 첫 번째 정제 단계(1^차 젖산): 박동 세포를 젖산 배지(웰당 0.5mL)로 세척하고 젖산 배지 웰당 1mL로 72시간 동안 배양합니다.
   알림: 세척 단계는 이전 포도당 배지(B27)의 모든 흔적을 완전히 제거하기 위해 젖산 배지 또는 기저 포도당이 없는 RPMI 1640으로 수행해야 합니다.
9. 13일차: 세척하고 2일 동안 B27 배지 웰당 1.5mL로 1차 정제 라운드에서 세포를 회복시킵니다.
10. Day 15(리플라팅 단계): 두 정제 주기 사이에 EDTA/PBS로 세척하고 37°C(웰당 0.5mL)에서 10분 동안 TrypLE로 배양하여 단층을 해리합니다.
    참고: 배양 시간은 각 세포주에 따라 다릅니다.
11. 1000μL-마이크로피펫을 사용하여 세포를 분리하고 멸균 원심분리기 튜브에서 10% KSR(v/v)이 보충된 B27 배지 웰당 0.5mL로 세포를 회수합니다.
    참고: 심근세포는 전단 응력과 강한 피펫팅에 민감하므로 반복적인 피펫팅 단계를 피하십시오. 손상이 적은 hiPSC-CM 해리를 위한 다른 옵션으로는 TrypLE 10x 또는 콜라겐분해효소와 DNase를 함께 사용하는 것이 있습니다. 배양 시간을 최적화하여 세포 손상을 일으키거나 세포 무결성을 손상시킬 수 있는 과도한 피펫팅을 요구하지 않고 세포 분리에 충분한지 확인합니다.
12. RT에서 100 x g 에서 10분 동안 원심분리기를 원심분리기하고 Replating Medium을 사용하여 1:80 MGFr 코팅된 12웰 플레이트에 다시 플레이팅합니다. 웰당 1mL에 씨를 뿌립니다.
    참고: 이렇게 하면 분화 중에 침전된 과도한 죽은 세포와 기질이 제거되며, 이는 나중에 조직 생성에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
13. 16일차: 리플레이팅 24시간 후, Y27 및 KSR을 제거하고 다음 정제 단계(보통 48-72시간) 전에 B27 배지에 세포를 유지합니다.
14. 18일차: 두 번째 정제 단계(2^차 젖산). 첫 번째 주기에서와 같이 72시간(웰당 1mL) 동안 젖산 배지로 세포를 세척하고 배양합니다.
    참고: 정제 주기는 심근세포 마커 cTNT(심장 트로포닌 T)의 유세포 분석 분석에서 관찰된 바와 같이 배양 순도를 최대 30%까지 향상시킬 수 있습니다(표시되지 않음). 이 공정은 주로 섬유아세포와 남아 있는 hiPSC 오염을 줄입니다. 수율 저하 없이 조직 생성을 진행하는 데 필요한 최소 허용 순도 수준은 결정되지 않았지만 순도가 85%-90% 이상인 배양물을 사용하는 것이 좋습니다. 이 수준의 순도는 심근세포 부착 개선을 지원하고, 최종 조직의 수축 강도를 강화하며, 실험 간 재현성을 지원합니다.
15. 21일차: 젖산 정제가 완료되면 정제된 심근세포를 B27 배지에서 사용할 때까지 유지하고 배지를 자주 교체합니다(2-3일마다).
    알림: 사용이 지연되면 분리가 더 어려워지므로 세포 수율이 감소합니다. 따라서 두 번째 젖산 정제가 끝나는 날과 추가 일주일 미만 사이에 사용하는 것이 좋습니다.

4. 인간 심장 섬유아세포 분화

참고: hiPSC에서 인간 심장 섬유아세포(hiPSC-CF)를 얻기 위해 다음 프로토콜은 Zhang et ^al.16에서 사용한 2단계 방법론을 기반으로 합니다. 첫 번째 단계는 심인성 중배엽 유도 후 Wnt 신호 경로를 재활성화하여 심외막 세포(hiPSC-EpiC)를 얻는 것입니다. 그런 다음 hiPSC-EpiC를 혈관 발달 억제제와 FGF2에 노출시켜 18일 이내에 심장 섬유아세포를 얻습니다.

1. hiPSC-CM 차별화 프로토콜에 설명된 대로 hiPSC 유지보수, 수확 및 파종(seeding) 밀도를 보장합니다. 분화를 시작하기 위해 1:180 MGFr 코팅된 12웰 플레이트에서 hiPSC를 배양합니다.
2. 소형 hiPSC 단층이 달성되면(Day 0) 5μM의 CHIR(웰당 1.5mL)이 보충된 -INS 배지를 48시간 동안 추가합니다.
   참고: 효율적인 중배엽 유도를 위해 각 hiPSC 라인에 대한 적정 CHIR 농도.
3. 2일차: 배지를 흡입 및 폐기하고, RPMI로 세포를 세척하고, 24시간 동안 1.5mL의 새 -INS 배지로 교체합니다.
   참고: hiPSC-CM 프로토콜에서와 같이 배지를 교체하는 동안 세포를 헹굽니다. 각 단계에 따라 해당 보충되지 않은 기저 배지를 사용합니다.
4. 3일차: 5μM의 C59(Wnt 억제제)를 함유한 -INS 배지로 세포를 48시간(웰당 1.5mL) 동안 배양합니다.
5. 5일차: 심장 중배엽 세포의 재생의 경우, EDTA/PBS로 세척하고 37°C(웰당 0.5mL)에서 5분 동안 TrypLE로 배양하여 세포를 분리합니다. Advance DMEM 기저 배지(ADMEM)의 웰당 0.5mL에서 세포를 수집하고 RT에서 300 x g 으로 5분 동안 원심분리합니다.
6. 20,000 cells/cm²의 밀도로 1:180 MGFr 사전 코팅된 12-well 플레이트(웰당 1mL)에 파종합니다. 리플레팅을 위해 CHIR 5μM, 레티노산 2μM, 10% KSR(v/v) 및 Y27 10μM가 보충된 ADMEM을 사용하십시오.
7. 6일차: 리플레이팅 후 24시간에 배지를 새로 고쳐 Y27을 제거하고 KSR을 2%로 감소시킵니다. 심외막 표현형의 발달을 달성하기 위해 48시간 동안 동일한 CHIR 및 레티노산 농도를 유지합니다.
8. 8일차: ADMEM이 보충되고 KSR 2%가 72시간 동안 배양되어 심외막 단층의 생성을 촉진합니다.
   참고: hiPSC-EpiC는 단일 콜로니로 그룹화된 평면 또는 입방체 모양의 큰 세포로 보입니다. 이 시점에서 1차 분화를 수행할 때 WT1(핵 항원), ZO1(세포질 막 항원) 및 TCF21(세포질 항원)과 같은 일반적인 심외막 세포 마커를 FACS(유동 세포 세포 분석) 또는 IF(면역형광 염색)(표시되지 않음)로 분석할 수 있습니다.
9. 11일차: 심외막 세포 재생의 경우, EDTA/PBS로 hiPSC-EpiC 세척을 해리하고 37°C(웰당 0.5mL)에서 5분 동안 TrypLE로 배양합니다. FGM3 배지(웰당 0.5mL)에서 세포를 수집하고 RT에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
10. 10,000 cells/cm의 세포 밀도에서 0.1% 젤라틴으로 코팅된 12웰 플레이트에 hiPSC-EpiC를 재플레이플레이트합니다². 10μM의 SB(일반적으로 플라스틱 배양 중 근섬유아세포 전이를 피하기 위한 TGFß1 신호 억제제)와 10μM의 Y27(처음 24시간 동안만 해당)이 보충된 FGM3 배지를 사용합니다.
11. 다음 날, hiPSC-CF가 얻어질 때까지 2일마다 섬유아세포 배지(FGM3 + 10μM SB)를 갱신하여 전체 공정에 대해 총 약 18일을 만듭니다.
    참고: hiPSC-CF는 방추 모양의 형태를 나타내야 합니다. 여기서, 섬유아세포 마커 DDR2의 발현은 FACS 및 IF 기법으로 분석해야 합니다(7.1-7.2 단계 참조).
12. hiPSC-CF 배양이 합쳐지면 젤라틴이 사전 코팅된 T75 또는 T175 플라스크에서 1:3 세포 계대를 수행합니다. 세포는 대략 4-6일 만에 90% 합류점에 도달합니다. hiPSC-CF를 분리하려면 hiPSC-EpiCs 재생에 대해 설명된 TrypLE 수확 프로토콜을 사용합니다. 여기서 Y27은 통과에 필요하지 않습니다.
13. FGM3 배지 + 10μM의 SB에서 hiPSC-CF를 사용할 때까지 유지하거나 cryotube당 1-300만 cells의 세포 밀도에서 낮은 계대에서 동결합니다.
    참고: 플라스틱 플라스크에서 장기간 배양하면 세포가 더 수축성 근섬유아세포 표현형으로 분화하기 시작하므로 새로운 세포를 해동하기 전에 최대 6회 계대 동안 hiPSC-CF를 유지하는 것이 좋습니다.

5. MEW(Melt Electrospinning Writing) 스캐폴드 제작

참고: 이 프로토콜은 QUT, Queensland University of Technology¹⁰에서 이 목적을 위해 특별히 설계한 MEW 프린터를 사용하여 의료용 PCL(poly ε-caprolactone) 단일 중합체를 사용하여 섬유소 골격을 인쇄합니다.

1. 인쇄를 위해 PCL 폴리머 스톡을 준비합니다. 23G 바늘에 부착된 3mL 플라스틱 루어락 주사기에 PCL 과립을 충전하고 오븐에서 80°C에서 2시간 동안 녹인 후 피스톤을 부드럽게 눌러 폴리머가 녹는 동안 기포를 제거합니다. PCL이 빠르게 응고되므로 여러 개의 주사기를 준비하고 RT에 보관하십시오.
2. 인쇄 당일에는 가열실 내부에 주사기를 넣고 가압된 N₂ 공급 파이프에 연결합니다. MEW 장비를 켜고 온도 조절기를 80/65°C(챔버/노즐)로 설정하고 폴리머의 적절한 용융을 위해 주사기를 30분 동안 유지합니다.
3. 주사기 아래에는 호환 가능한(Mach3) 소프트웨어에 의해 XY 방향으로 전동 및 이동할 수 있는 수집기 플레이트가 있습니다. 프린트 헤드가 플레이트의 한쪽 가장자리 또는 원하는 위치에 배치될 때까지 컬렉터 플레이트(컴퓨터 커서 제어)를 이동하고 가열 챔버와 컬렉터 플레이트 사이의 거리(컬렉터 거리)를 10mm(Z 평면)로 수동으로 조정합니다.
   참고: 이 거리는 주어진 섬유 직경을 얻기 위해 실험적으로 테스트해야 합니다. 수집기 거리가 짧을수록 섬유가 두꺼워지고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
4. 전기장 공급 장치를 자동으로 연결하는 장비의 도어를 닫습니다. 전압을 7kV로, N₂ 압력을 2bar로 설정하여 프린팅 시 23G 팁을 통해 압출할 수 있도록 합니다.
   참고: 높은 전압을 공급하면 주사기 팁과 수집기 플레이트(스테인리스강으로 제작) 사이에 전위차가 생성됩니다. 그런 다음, 공급된 압력에 의해 노즐에 축적된 방울은 정전기로 충전되어 테일러 원뿔을 생성하고, 이 원뿔은 컬렉터 플레이트를 향해 구동됩니다. 전압과 압력을 조정하여 최종 섬유 치수를 수정할 수 있습니다. 고압 매개변수는 더 두꺼운 섬유를 압출하여 섬유를 안정화하기 위해 증가된 전압을 필요로 합니다. 이 소프트웨어는 CNC(Computer Numerical Control)를 기반으로 하므로 비계 형상은 G 코드로 작성되어 XY 이동과 수집기 플레이트 모터의 속도를 제어하는 프로그램에 공급됩니다. 따라서 최종 스캐폴드를 인쇄하기 전에 코일링이나 휘핑 모양 없이 정의된 섬유를 구축하는 안정적인 제트를 얻기 위해 이전 단계로 G 코드를 인쇄하는 것이 좋습니다. 이를 위해 매번 작은 변화(예: 기압의 경우 0.1bar, 전압의 경우 0.1kV, 수집기 속도의 경우 60-100mm/min)로 매개변수를 최적화합니다. 이것은 제트의 테일러 원뿔 거동을 보장할 것입니다.
5. 소프트웨어에서 설계된 G 코드를 선택하여 사각형 패턴 형상으로 스캐폴드를 인쇄합니다. 이 예제 G 코드는 0.5mm x 0.5mm의 사각형 모양의 기공이 있는 6cm x 6cm의 정사각형 메쉬 15개를 인쇄합니다.
6. 정밀하게 증착된 섬유(즉, 겹치는 섬유)를 인쇄하려면 수집기 속도를 1080mm/min으로 조정하십시오.
   참고: 각 MEW 장비의 전압, 압력, 컬렉터 속도 및 컬렉터 거리 매개변수를 조정하여 정확한 파이버 직경(μm)을 정의합니다. 앞서 언급한 매개변수의 영향 외에도 수집기 속도를 높이면 섬유가 더 얇아지고 감소하면 더 두꺼운 섬유가 생성됩니다. 이 프로토콜의 매개변수 설정을 사용하면 직경이 10-15미크론인 섬유를 인쇄할 수 있습니다.
7. 소프트웨어의 START(시작 ) 버튼을 눌러 인쇄를 시작합니다. 인쇄가 완료된 후 수집기에서 비계를 조심스럽게 제거합니다.
   알림: 인쇄 후 비계를 더 쉽게 다루려면 접착 테이프로 수집기 바닥에 고정한 비계보다 큰 유리 조각에 인쇄하는 것이 좋습니다.
8. 조직 제작을 위한 최종 골격을 얻기 위해 6mm 직경의 펀치로 인쇄된 메쉬를 자릅니다.
9. PCL 메쉬는 소수성이 높으므로 O₂/아르곤 플라즈마로 5분 동안 처리하여 친수성을 높이고 피브린 및 세포와의 상호 작용을 촉진합니다.
   참고: 선택적으로, 15분 동안 0.1N의 NaOH 처리 후 광범위한 PBS 세척도 효과가 있습니다.
10. 70% 에탄올에 30분 동안 담가 메쉬를 살균하고 멸균 증류수로 30분 동안 광범위하게 세척한 다음 건조시킵니다.
    알림: 멸균 페트리 접시와 멸균 후드 내부에서 이 과정을 수행하십시오. 메쉬가 플레이트에 접착되어 결과적으로 변형되는 것을 방지하기 위해 사용될 때까지 메쉬를 완전히 건조시키지 마십시오.

6. 피브린 미니 조직 생성 및 유지 관리

참고: 인간 심근 3D 미니 조직의 생성은 섬유질 지지를 제공하는 MEW 골격과 결합된 피브린 하이드로겔 내에서 hiPSC 유래 심장 세포의 캡슐화에 의존합니다. 다음 프로토콜은 Breckwoldt et ^al.17 및 Ronaldson-Bouchard et ^al.18에서 사용한 엔지니어링 설계 접근 방식에서 수정되었습니다.

1. hiPSC-CM 분화 프로토콜(TrypLE harvesting)의 재현 단계(3.10-3.11)에서 상술한 바와 같이 hiPSC-CM을 분리합니다. Tissue Generation Medium에서 세포 펠릿을 재현탁하여 Neubauer Chamber의 세포를 계수합니다.
2. TrypLE를 사용한 hiPSC-CM 수확 단계에서와 같이 hiPSC-CF를 분리합니다. T75의 경우 3mL의 TrypLE, T175 플라스크의 경우 5mL를 사용하고 TrypLE 배양을 비활성화하려면 동일한 부피를 사용합니다. 마지막으로 CM의 경우 동일한 배지에서 혼합 및 배양될 예정이므로 Tissue Generation Medium에서 세포 펠릿을 재현탁합니다.
3. Neubauer Chamber의 세포 수를 셉니다. 모든 조직을 시딩하는 데 필요한 정확한 총 세포 수를 계산합니다.
   참고: 이 프로토콜은 80% CM과 20% CF, 즉 800,000CM과 200,000CF로 구성된 조직당 100만 개의 세포를 사용합니다. 조직당 총 1.5 및 300만 개와 같은 다른 수량도 연습을 통해 달성할 수 있습니다.
4. 새 튜브(Cell Mix)에서 필요한 총 세포를 혼합하고 펠렛으로 5분, RT에서 300 x g 에서 5분 펠릿이 완전히 건조되었는지 확인하고 파종할 때까지 얼음에 보관하십시오. 모든 조직을 파종하는 데 필요한 하이드로겔의 총 부피를 계산합니다.
   참고: 이 프로토콜은 3,000만 cells/mL에 가까운 최종 밀도까지 조직당 35μL(직경 6mm의 스캐폴드 크기)가 필요하지만 위의 6.4단계에서 이미 언급한 것처럼 늘릴 수 있습니다. 각 피브린 하이드로겔은 6mg/mL 피브리노겐과 5U/mL 트롬빈과 세포가 재현탁되는 조직 생성 배지로 구성됩니다. 35μL 하이드로겔의 경우 피브리노겐/트롬빈 비율은 1.05μL/1.8μL입니다. 파이펫팅 오류로 인한 부피 손실을 방지하기 위해 하이드로겔의 최종 부피를 10% 더 늘리는 것이 좋습니다. 예: 10개 조직의 경우 350 μL + 10%, 즉 총 말단 부피로 385 μL에서 세포를 재현탁합니다.
5. 필요한 부피의 Tissue Generation Medium에서 세포 혼합물 을 재현탁합니다. 거품이 생기지 않도록 조심스럽게 섞습니다.
   참고: 10개 조직의 경우 374.5μL의 조직 생성 배지(하이드로겔의 총 부피에서 총 조직에 필요한 피브리노겐의 총량, 즉 10.5μL)에 1,000만 개의 세포(80CM:20 CFs)를 재현탁합니다.
6. 필요한 양의 피브리노겐을 넣고 조심스럽게 섞습니다. 10개 조직의 경우 10.5μL 피브리노겐을 Cell Mix에 추가하여 하이드로겔 혼합물을 생성합니다. RT로 유지하십시오.
   참고: 전단력이 hiPSC-CM의 생존력에 영향을 미치지 않도록 과도하게 반복되는 피펫팅을 피하는 것이 중요합니다. 멸균 메스로 피펫 팁 끝에서 조각을 잘라낸 다음 하이드로겔 믹스 를 다시 현탁하여 전단 손상을 줄이는 것이 좋습니다.
7. 플레이트에 피브린이 부착되는 것을 방지하려면 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 표면에 하이드로겔 믹스 를 시드합니다. 한 방울로 남을 조직 부피(17.5 μL)의 절반을 피펫팅하고 총 조직 수에 대해 수행합니다.
   참고: 티슈는 건조해질 수 있으므로 한 번에 10개 이상 티슈를 만들지 마십시오.
8. 각 방울 위에 PCL 스캐폴드를 놓고 남은 부피(17.5μL)를 추가합니다. 비계가 완전히 잠겼는지 확인하십시오.
   참고: 반응이 매우 빠르므로 양손으로 피펫팅할 준비를 하십시오. 한 번에 하나의 조직으로.
9. 주로 사용하지 않는 손에 필요한 양의 트롬빈(1.8 μL)을 추가하고 주로 사용하는 손에 하이드로겔을 빠르게 혼합합니다(최소 2-3회 피펫팅).
   참고: 기포 형성(30 μL)을 방지하기 위해 총 부피보다 작게 피펫팅하여 혼합하는 것이 좋습니다. 기포가 생기면 바늘로 재빨리 찔러주세요.
10. 각 조직에 대해 이전 단계를 반복합니다.
    알림: 좋은 취급이 보장될 때까지 세포 없이 이 기술을 연습하는 것이 좋습니다.
11. 조직을 37°C에서 1시간 동안 배양하여 피브린 중합을 완료합니다.
12. 멸균 핀셋으로 각 조직의 가장자리를 부드럽게 집어 올리고 33μg/mL의 아프로티닌이 보충된 조직 생성 배지 웰당 2mL가 있는 12웰 플레이트에 넣습니다. 웰당 하나의 티슈를 놓습니다.
    알림: 세포가 기계적 힘에 의해 손상될 수 있도록 하이드로겔의 중앙을 잡고 들어 올리지 마십시오. 필요한 경우 주걱을 사용하십시오.
13. 37 ° C에서 24 시간 동안 조직을 배양합니다.
    참고: 처음 24시간 동안 아프로티닌을 생략하면 나중에 추가되더라도 메쉬와 하이드로겔에서 세포가 부분적으로 분리되는 것으로 관찰되었기 때문에 생성 당일부터 조직 배양 배지에서 아프로티닌을 유지하는 것이 중요합니다. 이는 최종 조직의 무결성에 필요한 전체 세포 범위를 손상시킵니다.
14. 다음 날, 2mL의 조직 유지 배지로 배지를 새로 고쳐 KSR 및 Y27 잔류물을 제거합니다. 거기서부터 격일로 매체를 바꾸십시오.

7. hiPSC 및 미니 조직 기능의 심장 분화 가능성에 대한 체계적인 분석

1. 유세포 분석
   참고: hiPSC 분화의 효율성을 결정하기 위해 "FACS(Fluorescence-activated Cell Sorting)"(FACS) 세포 분석 방식을 사용하여 세포를 분석합니다. 모든 단계는 실온 조건에서 수행됩니다.
   1. 세포 배양액을 hiPSC-CM 및 CF를 별도로 단일 세포 현탁액(TrypLE harvesting)으로 해리합니다.
   2. FACS 완충액에서 펠렛을 250,000 cells/mL로 재현탁시키고 튜브당 최소 1mL를 분주합니다. 비특이적 항체 결합을 피하기 위해 30분 동안 배양합니다.
   3. 300 x g 의 세포를 실온에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 폐기합니다.
      참고: 모든 원심분리 단계는 이러한 조건에서 수행됩니다.
   4. 세포 내 항원을 검출하려면 세포 투과화 키트로 세포막을 고정하고 투과화합니다. 먼저 Reactive A(Fix)로 세포를 30분 동안 배양하고 원심분리기(7.1.3단계 참조)합니다.
   5. 그런 다음 Reactive B(Perm)와 1차 항체로 세포를 30분 동안 배양합니다. 튜브당 100μL의 반응성을 사용합니다.
      1. hiPSC-CM의 경우 1/200 희석에서 마우스 cTNT 항체(심장 T 트로포닌, CM 마커)를 사용합니다. hiPSC-CF의 경우 1/500 희석에서 마우스 DDR2 항체(콜라겐 수용체, CF 마커)를 사용합니다.
         참고: 모든 반응을 중지하려면 원심분리 전에 각 튜브에 1mL의 FACS 버퍼를 추가합니다.
   6. FACS 완충액에서 1/100으로 희석된 anti-mouse Alexa-Fluor 488 2차 항체로 15분 동안 배양합니다.
   7. PBS로 3회 세척하고, 세척 사이에 원심분리를 하고(7.1.3단계와 동일한 조건으로), 마지막으로 400μL의 PBS에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포 분석기 또는 유사한 장치에서 분석합니다.
2. 면역형광 염색 분석(IF)
   1. 2D 심장 세포 배양의 경우, 1:80 MGFr 또는 0.1% 젤라틴 사전 코팅된 슬라이드 기반 배양 챔버 웰 시스템에서 두 세포 유형을 별도로 시딩합니다. 분석을 위한 충분한 세포 밀도에 도달하기 위해 약 80,000 cells/cm² 플레이트를 만듭니다. 3D 미니 티슈의 경우 핀셋으로 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 부드럽게 옮깁니다.
   2. 세포 배지를 버리고 PBS로 세포 또는 조직을 두 번 세척합니다. RT에서 10% 포르말린(v/v)으로 샘플을 고정합니다. 슬라이드 챔버의 경우 15분, 미니 티슈의 경우 1시간.
      주의: 포르말린은 흡입하면 위험하므로 흄 후드에서 취급해야 합니다.
   3. 정착 버퍼를 버리고 PBS로 5분을 세 번 씻습니다. 샘플을 사용할 때까지 PBS에서 4°C로 보관하십시오.
   4. 세포막을 투과화하려면 0.1% Triton X-100 (v/v)으로 세포를 10분 동안 배양하거나 3D 조직에 1% Tween-20을 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS로 5분을 세 번 씻습니다.
   5. 비특이적 항체 결합을 줄이려면 RT에서 30분 동안 3%(v/v) 소 혈청 알부민(BSA) 용액으로 샘플을 처리합니다.
   6. PBS와 1% BSA로 1차 항체 용액을 준비하여 비특이적 결합을 차단하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
      1. 2D hiPSC-CM의 경우 Anti-cardiac α-ACTN(sarcomeric actinin) 마우스 항체의 1/400 희석을 사용합니다. 2D hiPSC-CF의 경우 Anti-DDR2 마우스 항체의 1/500 희석을 사용합니다. 3D 조직의 경우 두 개의 CM 및 CF 특이적 항체를 결합합니다.
   7. 다음 날에는 항체 용액을 흡인하고 PBS로 RT에서 각각 5분씩 3회 세척합니다.
   8. 2차 항체(Alexa-Fluor 488 및 Alexa-Fluor 594)를 1/200로 희석하고 어둠 속에서 RT에서 1시간 동안 배양하여 각각 마우스 및 토끼 1차 항체를 식별합니다. PBS 세척을 세 번 반복합니다.
   9. 핵을 역염색하려면 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 1/500 희석하여 어두운 곳에서 RT에서 20분 동안 샘플을 배양합니다. PBS 세척을 세 번 반복하고 샘플을 PBS에서 4°C로 보관합니다.
   10. 컨포칼 현미경으로 샘플을 검사하고, 이미지를 획득하고, Fiji와 같은 적절한 소프트웨어로 처리합니다.
   11. 3D 미니 티슈의 경우 두 개의 유리 커버슬립 사이에 PBS를 사용하여 조심스럽게 옮겨 좋은 이미징을 가능하게 합니다.
       참고: 고해상도에서 Z-stack 이미지를 얻으려면 40x 오일 이멀젼 이상의 대물렌즈를 사용하는 것이 좋습니다.
3. 세포 생존율 분석
   참고: Alamar Blue assay(AB)는 3D 심장 미니 조직의 세포 생존율과 직접적인 관련이 있는 세포 대사 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 전체 공정을 수행하여 빛과 멸균 상태에서 샘플을 보호합니다.
   1. 페놀이 없는 RPMI 1640 배지에 10%(v/v) AB 용액을 준비합니다(비색 측정을 방해할 수 있으므로).
   2. 심장 미니 조직을 멸균 핀셋이 있는 48웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다. 37°C에서 1시간 30분(실험적으로 시간 조정) 동안 조직당 300μL의 AB 용액으로 구성물을 배양합니다.
      참고: 세포가 대사 효소의 작용을 통해 레사주린을 감소시킴에 따라 배양 배지의 색상 변화가 생성되며, 이는 570nm 및 600nm에서 분광 광도계로 측정됩니다.
   3. 측정을 위해 96웰 플레이트에서 대사된 AB 용액의 조직당 100μL를 수집하고 흡광도를 판독합니다.
      참고: 이 분석 후 배지를 조직 유지 배지로 한 번 더 변경하여 샘플을 배양할 수 있습니다.
4. 수축 분석
   참고: 심장 미니 조직은 일반적으로 조직 생성 후 1-2일 후에 자발적으로 박동하기 시작합니다.
   1. 광학 현미경으로 조직을 관찰하여 박동 주파수를 수동으로 측정합니다(beats/min). 많은 조직을 동시에 측정하는 경우 각 판독 전에 플레이트를 따뜻하게 유지하십시오.
      알림: 온도가 내려가면 박동 속도도 감소하기 시작합니다.
   2. 확장된 심장 수축성 평가를 위해 박동 조직의 광학 현미경 비디오를 확보하십시오. 4배에서 더 큰 평면을 캡처하거나 10배에서 다른 조직 영역을 캡처합니다. 동영상당 약 30초(최소 3비트)를 녹화합니다.
   3. 최소 30 frames/s의 프레임 속도를 사용하고 비디오를 .AVI 형식으로 저장합니다.
      참고: 여기에서 비디오는 MATLAB¹⁰용으로 개발된 맞춤형 추적 포인트 알고리즘으로 분석되었습니다. 이 방법을 사용하면 각 비디오에 대해 수축 속도, 수축 최대 변위(진폭) 및 수축 방향을 얻을 수 있습니다.
   4. analysis 폴더에 포함된 비디오에 대해 MATLAB에서 알고리즘을 직접 실행합니다. 프레임당 수축 속도, 프레임당 수축 진폭, 수축 각도(방향) 및 해당 표준 편차¹⁰ 값이 포함된 결과 Excel 문서를 자동으로 제공합니다.
   5. '프레임당 수축 속도'에 카메라 해상도(μm/픽셀)와 카메라 프레임 속도(frames/s)를 곱합니다. 이것은 수축 속도 최종 값(μm/s)을 제공합니다.
   6. '프레임당 수축 진폭'에 카메라 해상도(μm/픽셀)를 곱하면 수축 진폭 최종 값(μm)이 됩니다.
      참고: 다른 곳에서 논의된 바와 같이 MUSCLEMOTION과 같은 소프트웨어를 사용하여 수축 역학을 보다 심층적으로 분석할 수 있습니다^19,20. 이미징 설정은 소프트웨어로 분석하기 위해 최소 60프레임/초를 캡처해야 합니다.

결과

2D hiPSC 유래 심장 세포의 특성화
다중 표현형 심장 조직을 생성하기 위해 hiPSC-CM과 hiPSC-CF를 독립적으로 분화하고 in vitro에서 특성화합니다. 적절한 최적화와 엄격한 유지 관리를 통해 다음 프로토콜은 분화 9일차에 80% 이상의 hiPSC-CM 수율을 달성하여 자발적으로 박동하는 세포를 생성합니다(그림 1A). 또한, 대사 선택에 의한 순?...

토론

인간 심근의 고유한 특성을 복제하는 3D 복합 심장 미니 조직 모델을 생성하려면 몇 가지 필수 요소를 고려해야 합니다. 이는 (1) 조직 제조를 위한 세포의 수율과 순도 최적화, (2) 3D 기계 환경을 모방하기 위해 섬유소 골격 인쇄, (3) 제조 공정에서 피브린 하이드로겔 통합의 세 가지 주요 요점으로 그룹화할 수 있습니다.

성공적인 분화 과정을 보장하?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide 8 Well chamber coverslip (IbiTreat)	IBIDI	80826
0.1% Gelatin Solution (Embryomax)	Merck Millipore	ES-006-B
10% formalin	Sigma Aldrich	HT501128
12-well plates	Costar/Corning	3513
6-well plates	Costar/Corning	3506
Advanced DMEM 1x (ADMEM)	Gibco	12491015
Aprotinin from bovine lung	Sigma Aldrich	A1153
B-27 SUPLEMENT, PLUS INSULIN (50x)	Life Technologies	A317504044
B27 SUPPLEMENT, MINUS INSULIN (50x)	Life Technologies	A1895601
Biopsy punch (6mm diameter)	Medical	BP-60F
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A9647
CHIR-99021	AXON MEDCHEM	AXON1386
Confocal Laser Scanning Microscope	Zeiss	LSM 800
Culture flask 175 cm	Greiner Bio-One	660175
Culture flask 75 cm	Falcon	353136
Cytometer	Beckman Coulter	CytoFlex
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21202
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-21207
DPBS (Mg2+, Ca2+ free)	Gibco	A314190094
EDTA 0.5M pH 8.0	Life Technologies	AM9260G
ESSENTIAL 8 MEDIUM KIT	Life Technologies	A1517001
FGF2 (Recombinant Human FGF-basic 154 a.a.)	Peprotech	100-18B
Fibrinogen from bovine plasma	Sigma Aldrich	F8630
Fibroblast Growth Medium 3 KIT (FGM3)	PromoCell	C-23130
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828028
Lactate (Sodium L-lactate)	Sigma Aldrich	71718
Matrigel Growth Factor Reduced (MGFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354230
MEW 23-G needle	Nordson	7018302
MEW printer	QUT, Queensland University of Technology
MEW syringe	Nordson	7012072
Mouse Anti-Cardiac Troponin T Monoclonal Antibody	Invitrogen	MA5-12960
Mouse Anti-DDR2 monoclonal antibody	Sigma Aldrich	SAB5300116
Mouse Anti-α-actinin (sarcomeric) Monoclonal Antibody	Sigma Aldrich	A7811
PENICILLIN - STREPTOMYCIN	Life Technologies	15140122
Poly ε-caprolactone (PCL), medical grade	Corbion	PURASORB® PC 12
Rabbit Anti-Vimentin Recombinant Monoclonal Antibody [EPR3776] - Cytoskeleton Marker	Abcam	Ab29547
Retinoic Acid	Sigma Aldrich	R2625
ROCK inhibitor Y-27632 (10mg)	Fisher Scientific	HB2297
RPMI 1640 (L-glutamine)	Gibco	21875034
RPMI 1640 (no phenol red)	Gibco	32404014
RPMI no glucose	Gibco	11879020
SB431542	SELLECK CHEMICALS	S1067
Spectrophotometer	BMG Labtech	SPECTROstar Nano
Thrombin (human alpha thrombin, Factor IIa)	Enzyme Research Lab	HT 1002a
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
TrypLE Express	Life Technologies	12604021
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287
Wnt-C59	AXON MEDCHEM	AXON2287