Génération 3D de tissu myocardique humain à l’aide de l’écriture électrofilée à l’état fondu d’échafaudages de polycaprolactone et de cellules cardiaques dérivées de hiPSC

Résumé

Une méthode reproductible est présentée pour générer des tissus myocardiques 3D combinant l’écriture par électrofilage fondu (MEW), des échafaudages de polycaprolactone (PCL) et des hydrogels de fibrine avec des cardiomyocytes et des fibroblastes dérivés de hiPSC. Cette technique offre un contrôle précis de l’architecture de l’échafaudage et peut être appliquée dans les tests précliniques de médicaments et la modélisation des maladies cardiaques.

Résumé

Le développement de tissus cardiaques humains fonctionnels est très prometteur pour faire progresser les applications dans le dépistage de médicaments, la modélisation des maladies et la médecine régénérative. Ce protocole décrit la fabrication par étapes de tissus myocardiques 3D avec mimétisme avancé de la structure cardiaque native en combinant des échafaudages de polycaprolactone (PCL) d’écriture par électrofilage à l’état fondu (MEW) avec des hydrogels de fibrine et des cellules cardiaques dérivées de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). Le processus consiste à intégrer un mélange de cardiomyocytes (hiPSC-CM) et de fibroblastes cardiaques (hiPSC-CF) dans une matrice de fibrine pour créer des mini-tissus, avec un soutien structurel fourni par des échafaudages générés par MEW. Ces échafaudages fibrillaires sont fabriqués à l’échelle micrométrique et nanométrique, ce qui permet un contrôle précis de l’architecture des fibres, qui joue un rôle clé dans l’organisation de la distribution et de l’alignement des cellules. Pendant ce temps, la matrice de fibrine favorise la viabilité cellulaire et imite l’environnement extracellulaire. La caractérisation des tissus générés révèle des sarcomères bien organisés au sein des hiPSC-CM, ainsi qu’une activité contractile stable. Les tissus présentent des battements spontanés constants dès deux jours après l’ensemencement, avec une fonctionnalité soutenue au fil du temps. La combinaison des hiPSC-CF et des hiPSC-CM améliore l’intégrité structurelle des tissus tout en soutenant la viabilité cellulaire à long terme. Cette approche offre une méthode reproductible, adaptable et évolutive pour créer des modèles de tissus cardiaques biomimétiques, fournissant une plate-forme polyvalente pour les tests précliniques de médicaments, les études mécanistes des maladies cardiaques et les thérapies régénératives potentielles.

Introduction

La fabrication de tissus fonctionnels issus du génie cardiaque humain est très prometteuse pour les applications à fort impact. Celles-ci vont de la modélisation de la cardiotoxicité des médicaments et des maladies cardiaques humaines à la génération de tissus thérapeutiques de tailles pertinentes¹. Bien que les 15 dernières années aient été marquées par des avancées significatives dans le domaine, la fabrication du myocarde humain hautement mimétique est actuellement contrecarrée par des difficultés à reproduire l’organisation structurale et mécanique complexe de son homologue naturel².

Sur le plan biologique, la technologie révolutionnaire de reprogrammation cellulaire a ouvert la possibilité de développer des cellules thérapeutiques spécifiques au patient. Actuellement, les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) sont la seule source de cardiomyocytes humains dans un contexte personnalisé. Un rendement élevé de cardiomyocytes peut être obtenu en suivant des protocoles de différenciation robustes ^3,4. Une question clé est le degré de maturation car les cardiomyocytes humains dérivés d’hiPSC (hiPSC-CM) actuellement utilisés présentent un phénotype immature dans des conditions de différenciation 2D conventionnelles⁵. Cela est lié au fait que l’organisation structurelle du tissu cardiaque est très complexe, absolument différente des cultures 2D conventionnelles. En outre, le myocarde est composé de différentes cellules cardiovasculaires, y compris des non-myocytes tels que les fibroblastes cardiaques, les muscles lisses et les cellules endothéliales, disposés de manière ordonnée à travers une structure 3D spécifique, permettant un pompage efficace du sang ^6,7. Ainsi, des mini-tissus cardiaques humains hautement structurés composés de tous les principaux types de cellules sont nécessaires pour générer des tissus biomimétiques physiologiquement pertinents.

L’application de nouvelles approches de biofabrication peut sortir de cette impasse. Parmi ceux-ci, l’écriture électrofilature à l’état fondu (MEW), une technologie d’impression 3D avancée, est capable de fournir une précision et une résolution élevées. Dans MEW, un champ électrique est utilisé pour déposer un polymère fondu sous forme de fibres dans la gamme de taille de la cellule, un ordre de grandeur inférieur à l’impression 3D conventionnelle de modélisation par dépôt de fil fondu (FDM), ce qui permet d’obtenir des structures d’échafaudage hautement définies ^8,9. Il a été démontré que MEW est capable de traduire une conception complexe in silico en une matrice imprimée et d’ajuster les propriétés physiques en 3D pour correspondre à celles du tissu cardiaque¹⁰. En utilisant la technologie MEW, il est possible d’imprimer des mailles polymères avec différentes formes et structures qui, combinées à des hydrogels doux pour les cellules, génèrent des tissus composites imitant l’environnement micro- et macromécanique du myocarde adulte natif^11,12. Il a été démontré que la modification de la conception de l’échafaudage 3D MEW modifie la fonctionnalité résultante (transitoires calciques)¹⁰, jetant ainsi les bases de la compréhension de la relation forme-fonction sur ce système prometteur conçu en 3D.

Ici, un protocole détaillé est fourni pour la fabrication de mini-tissus cardiaques humains contractiles à partir de hiPSC-CM et de fibroblastes cardiaques humains dérivés d’iPSC (hiPSC-CF) et leur combinaison au sein d’un hydrogel de fibrine renforcé par des structures imprimées en 3D MEW. L’ajout de fibroblastes a été largement utilisé dans différents systèmes conçus en 3D pour améliorer la survie des hiPSC-CM et maintenir la structure tissulaire, mais son utilisation dans les systèmes 3D-MEW n’a pas encore été explorée¹³. La technologie décrite ici fournit une plate-forme polyvalente pour les chercheurs visant à développer des modèles de tissu cardiaque précis avec des applications telles que la compréhension des mécanismes de la maladie, la toxicologie préclinique et le criblage de médicaments. Ce modèle est adapté à l’évaluation de la cardiotoxicité de médicaments établis tels que les anthracyclines (par exemple, la doxorubicine), les inhibiteurs de la tyrosine kinase et les thérapies émergentes comme les cellules T DU RÉCEPTEUR ANTIGÉNIQUE CHIMÉRIQUE (CAR-T), qui ont été associées à la dysfonction cardiaque¹⁴. De plus, le modèle présente un potentiel important pour faire progresser la médecine régénérative en permettant de tester des biomatériaux, des bioencres et des thérapies cellulaires visant à améliorer la fonction cardiaque et à restaurer le tissu myocardique dans des conditions telles que l’infarctus du myocarde.

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Configuration du milieu et du réactif

1. Pré-revêtement de plaques de culture cellulaire
   1. Préparez les aliquotes de stock de Matrigel à facteur de croissance réduit (MGFr). Décongelez une bouteille de MGFr pendant la nuit au réfrigérateur sur de la glace. Dans une hotte stérile, à l’aide d’embouts réfrigérés et en gardant le bouillon et les tubes sur de la glace à tout moment, faites des aliquotes de volume approprié en diluant le stock 1:1 dans du RPMI 1640 L-glutamine froid (RPMI).
      REMARQUE : Pour la culture de cellules hiPSC et l’ensemencement de cardiomyocytes hiPSC (hiPSC-CM), différentes dilutions de MGFr sont utilisées. La dilution de l’enrobage MGFr pour les hiPSC varie en fonction de la lignée cellulaire spécifique. Cependant, une fois le stade cardiomyocytaire atteint, la dilution 1:80 est utilisée quelle que soit la lignée cellulaire.
   2. Pour le revêtement des plaques de culture cellulaire, décongelez lentement le nombre requis d’aliquotes de MGFr sur de la glace et diluez-les davantage dans du RPMI froid, 1:180 pour la culture de hiPSC (100 μL de MGFr dans 9 mL de RPMI) et 1:80 pour le replacage de hiPSC-CM (100 μL de MGFr dans 4 mL de RPMI).
      1. Ajouter immédiatement le MGFr dilué à un volume de 1 mL par puits pour les plaques à 6 puits (maintenance hiPSC) et 0,5 mL par puits pour les plaques à 12 puits (replacage des hiPSC-CM). Conservez les plaques à 4 °C avant utilisation (jusqu’à 1 semaine).
         REMARQUE : Les plaques revêtues de MGFr doivent être chauffées à 37 °C pendant 30 minutes avant l’ensemencement des cellules. Avant de plaquer les cellules, aspirez le liquide de la plaque revêtue de MGFr.
   3. Pour la culture de cellules hiPSC-CF, enduire les flacons T75 ou T175 de gélatine à 0,1 % pendant au moins 15 min à température ambiante (RT) avant utilisation, à un volume de 5 mL pour les flacons T75 ou 10 mL pour les flacons T175. Après l’incubation, aspirez le liquide avant l’ensemencement cellulaire.
2. Milieux de culture cellulaire
   1. Pour la culture hiPSC, utilisez le milieu Complete Essential 8 (milieu E8) en ajoutant le supplément Essential 8 (50x) au milieu basal Essential 8.
   2. Pour la différenciation des cardiomyocytes, préparez :
      1. RPMI/B27 sans insuline (-INS moyen) : Mélanger 500 mL de RPMI et 10 mL de B27 sans supplément d’insuline ; RPMI/B27 (B27 moyen) : Mélanger 500 mL de RPMI et 10 mL de supplément de B27.
   3. Pour la purification des cardiomyocytes (milieu lactique), ajoutez 2 ml de lactate 1 M dans 500 ml de RPMI 1640 sans glucose. Le milieu peut être stocké à 4 °C jusqu’à 1 mois.
   4. Pour le replacage des cardiomyocytes (Replating Medium), complétez le milieu B27 avec 10 % de remplacement sérique knock-out (KSR) et 10 μM de Y27.
      REMARQUE : KSR est une formulation définie, sans sérum, qui remplace le FBS dans les protocoles de culture ESC et iPSC.
   5. Pour la différenciation et l’entretien des fibroblastes (à partir du jour 11), préparez le milieu de croissance des fibroblastes 3 complet (FGM3) comme spécifié par le fabricant. Ajoutez son emballage de suppléments (0,1 mL/mL de sérum de veau fœtal, 5 μg/mL d’insuline humaine recombinante et 1 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes de base humains, FGF2) au milieu de base FGM3.
      REMARQUE : Pour favoriser la prolifération des fibroblastes, il est recommandé d’augmenter la concentration de FGF2 à 10 ng/mL.
   6. Pour la génération de tissu cardiaque 3D et l’utilisation d’entretien, préparez :
      1. Milieu de génération tissulaire : Compléter le milieu B27 avec 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S), 10 % de KSR et 10 μM de Y27. Milieu d’entretien des tissus : Préparez le milieu B27 avec 1 % P/S et de l’aprotinine (0,1 % (poids/vol) ; 33 μg/mL).
         REMARQUE : L’aprotinine permet l’intégrité du gel de fibrine pendant le temps de culture, empêchant sa dégradation et maintenant les cellules à l’intérieur de l’hydrogel. Par conséquent, il est fortement recommandé de l’ajouter au milieu le jour même de la génération du tissu.
3. Solutions mères de petites molécules et de facteurs de croissance
   1. CHIR-99021 (CHIR) : Pour l’inhibiteur de GSK3 et l’activateur de signalisation Wnt, préparez une solution mère de 10 mM en la dissolvant dans du DMSO. Conserver les aliquotes à -20 °C jusqu’à 6 mois.
      REMARQUE : Les lignes hiPSC peuvent répondre différemment au traitement CHIR. Une optimisation de la concentration CHIR peut être nécessaire. Un test CHIR de 6 à 10 μM est recommandé.
   2. C59, inhibiteur de Wnt : Préparez une solution mère de 10 mM en la dissolvant dans du DMSO. Conserver les aliquotes à -20 °C jusqu’à 6 mois.
   3. Y-27632, inhibiteur de ROCK (Y27) : Préparez une matrice de 10 mM en la dissolvant dans du DMSO. Conservez les aliquotes à -20 °C jusqu’à 1 mois. La concentration finale dépend du type de cellule cible. Utilisez 2 μM (1/5000) pour les hiPSC et 10 μM (1/1000) pour les hiPSC-CM, les hiPSC-CF et la génération de tissus.
      REMARQUE : Le Y27 favorise la survie cellulaire en supprimant la mort cellulaire en suspension pendant le détachement. Utilisez-le lors de la récolte pour éviter une mort cellulaire excessive.
   4. Acide rétinoïque : Préparez une solution mère de 30 mM en la dissolvant dans du chloroforme. Conservez les aliquotes à -20 °C jusqu’à 2 ans.
   5. FGF2 (Recombinant Human Fibroblast Growth Factor, également FGF-b, favorise la prolifération des fibroblastes) : Préparez une solution mère de 50 μg/mL en la dissolvant dans de l’eau stérile. Conservez les aliquotes à -20 °C jusqu’à 6 mois.
   6. SB431542 (SB), inhibiteur de signalisation TGFß1 : Préparer une solution mère de 10 mM en la dissolvant dans du DMSO. Conservez les aliquotes à -20 °C jusqu’à 6 mois.
      REMARQUE : Ajoutez-le au milieu de fibroblaste pour maintenir l’état de la mucoviscidose et prévenir la transition du myofibroblaste (le phénotype pathologique apparaissant pendant la fibrose) en culture 2D.
4. Solutions mères pour hydrogel de fibrine
   1. Fibrinogène : Préparez une solution mère à 200 mg/mL. Tout d’abord, broyez les morceaux de fibrinogène en une poudre fine à l’aide d’outils stériles à l’intérieur d’un capuchon de cellule. Ajouter une solution chaude de NaCl à 0,9 % (poids/vol) et la maintenir à 37 °C jusqu’à dissolution complète. Stocker les aliquotes à -80 °C jusqu’à un an ; à 4 °C pendant 1 semaine.
      REMARQUE : En raison de sa viscosité à 4 °C, décongelez-le et maintenez-le à RT quelque temps avant l’étape de génération du tissu afin qu’il puisse être pipeté avec précision. Si une aliquote ne peut pas être facilement pipetée lorsqu’elle est réutilisée, il est recommandé de la jeter et d’en utiliser une nouvelle.
   2. Thrombine : Préparez une solution mère de 100 U/mL en dissolvant la thrombine dans du PBS stérile à 60 % + 40 % d’eau. Conservez les aliquotes à -20 °C jusqu’à un an à 4 °C jusqu’à 6 mois.
      REMARQUE : Avant utilisation, décongelez-le et conservez-le sur de la glace jusqu’à ce que l’étape de génération des tissus soit terminée.
   3. Aprotinine : Préparez une solution mère à 33 mg/mL en dissolvant l’aprotinine dans de l’eau stérile (100 mg de poudre dans 3,04 mL d’eau). Conservez les aliquotes à -20 °C jusqu’à un an.
5. Solutions d’analyse
   1. Tampon FACS (cytométrie cellulaire) : Préparez une solution de PBS (sans Mg²⁺ et Ca²⁺) plus 2,5 mM d’EDTA et 5 % (v/v) de FBS.

2. Culture et passage des iPSC humaines

REMARQUE : Les procédures rapportées ici ont été effectuées avec plusieurs lignées saines hiPSC, y compris UCSFi001-A (mâle, don aimable du professeur Bruce Conklin, David J. Gladstone Institutes), ESi044-A (mâle), ESi007-A (femelle) et ESi044-C (femelle) et ESi107-A (amylose cardiaque femelle malade) avec des adaptations mineures concernant le milieu de culture hiPSC, la dilution de passage et la concentration CHIR. Le protocole de celui-ci contient les détails spécifiques à l’utilisation de UCSFi001-A. Toutes les incubations de cultures cellulaires dans ce protocole sont effectuées à 37 °C, 5 % de CO₂ et 96 % d’humidité.

1. Ligne de culture hiPSC sur plaques à 6 puits pré-revêtues de MGFr au 1:180. Maintenez-les sur le milieu E8 pour assurer la pluripotence.
   REMARQUE : Pour éviter la différenciation spontanée, il est essentiel d’éviter la prolifération des cultures. Par conséquent, effectuez le passage des hiPSC lorsque les cellules sont confluentes à 80 % à 90 %.
2. Pour le passage cellulaire, aspirer l’ancien milieu, laver les puits deux fois avec 1 mL de solution EDTA 0,5 mM diluée dans du PBS (sans Mg²⁺- et Ca²⁺) par puits, et incuber pendant 7 min dans de l’EDTA/PBS à la RT pour perturber les adhérences intercellulaires.
3. Aspirez l’EDTA/PBS et récoltez les cellules, en les détachant par pipetage vigoureux avec une micropipette de 1000 μL avec 1 mL de milieu E8 sur la surface du puits jusqu’à ce que les cellules soient détachées. Collectez-les dans un tube à centrifuger stérile.
   REMARQUE : Évitez de pipeter plus de 10 à 15 fois, car cela augmenterait la mort des hiPSC.
4. À partir de ce volume, faites des dilutions 1:15-1:20 et ensemencez les cellules sur des plaques à 6 puits recouvertes de MGF dans un milieu E8 + 2 μM de Y27. Ne conserver Y27 que les 24 premières heures après l’ensemencement pour éviter la toxicité par surexposition.
   REMARQUE : Ajustez le taux de division pour les autres lignées hiPSC afin de maintenir les cellules indifférenciées et sur une morphologie saine pendant 4-5 jours.
5. Après 24 h, aspirez l’ancien milieu et ajoutez-y suffisamment de milieu E8 frais à température ambiante pour deux jours (généralement 3-4 ml). Après cela, changez de support chaque jour pendant 3-4 jours.
   REMARQUE : La fréquence de passage dépend de chaque lignée cellulaire ; Évitez d’atteindre 100 % de confluence. Les hiPSC doivent se développer en grandes colonies plates et compactes avec une géométrie polygonale, des bords lissés et un rapport noyau/cytoplasme élevé.

3. Différenciation des cardiomyocytes humains

REMARQUE : Pour la génération de cardiomyocytes à partir de hiPSC (hiPSC-CM), le protocole décrit est basé sur la méthodologie de différenciation monocouche utilisée par Lian et ^al.3,15 et Burridge et ^al.4. Avec une maintenance adéquate, hiPSC peut être différencié sur 30 passages consécutifs avec une efficacité de différenciation élevée. Les signes de comportement anormal sont détectés par une différenciation spontanée ou une défaillance consécutive de plus de 4 différenciations. Des contrôles réguliers, y compris des tests de mycoplasmes, sont recommandés.

1. Pour initier la différenciation cardiaque, prélever les hiPSC à 80 %-90 % de confluence, comme décrit à l’étape du passage cellulaire ci-dessus (étape 2). Cellules de semence dans des plaques à 12 puits revêtues de 1:180 MGFr, ajustant les dilutions divisées pour obtenir des monocouches cellulaires compactes à 90 % de confluence après 48 à 72 h de semis. Pour cette lignée cellulaire, faites des dilutions de 1:10, et les cellules atteindront la confluence à 72 h. Changez le milieu E8 tous les jours.
   REMARQUE : dans ce protocole, les dilutions ont été ajustées en volume, et non en fonction du nombre de cellules, afin d’éviter toute variabilité dépendante de l’utilisateur. Si l’état monocouche n’est pas atteint dans les 72 heures suivant le placage, il est fort probable que le processus de différenciation ne réussira pas. Dans un tel cas, il est conseillé d’abandonner la tentative et de redémarrer, en assurant une efficacité de passage optimale.
2. Lorsque les monocouches sont stabilisées, le processus de différenciation commence, considéré désormais comme le jour 0. Ensuite, remplacer le milieu par un milieu -INS complété par 8 μM de CHIR, l’activateur de signalisation Wnt, et incuber la plaque pendant 24 h à 37 °C (1 mL par puits).
   REMARQUE : Titrez la concentration CHIR entre 6 et 12 μM pour chaque ligne iPSC pour une induction efficace du mésoderme. Dans cette étape, un niveau élevé de mort cellulaire est attendu, signe d’un processus optimal.
3. Jour 1 : Le lendemain, aspirez le milieu de chaque puits et lavez les cellules avec du RPMI sans suppléments (0,5 ml par puits). Ensuite, ajoutez 1,5 ml de milieu -INS frais et incubez les cellules pendant 2 jours.
   REMARQUE : Les étapes de lavage sont effectuées lors de tous les changements de support pour éliminer les débris, les cellules mortes et les résidus de supplément.
4. Jour 3 : Pour induire la spécification de la lignée cardiaque, remplacer le milieu par 1,5 mL de milieu -INS complété par 5 μM d’inhibiteur de Wnt C59 pendant 48 h.
   REMARQUE : Ici, le complexe GSK3 est formé et la ß-caténine est dégradée, conduisant à une lignée mésodermique cardiaque. Une certaine mort cellulaire est également observable après cette étape.
5. Jour 5 : Laver et remplacer par du milieu -INS frais pendant 48 h à un volume de 1,5 mL par puits, pour favoriser l’expansion des progéniteurs cardiaques.
6. Jour 7 : À partir de ce jour, les cellules sont maintenues dans le milieu B27, avec un changement de média tous les 2-3 jours.
   REMARQUE : Ajustez les quantités de milieu à 2,5 ml par puits pour éviter de changer de support pendant la fin de semaine, mais seulement une fois que cet état a été atteint. Normalement, les hiPSC-CM commencent à battre spontanément les jours 7 et 9. Tout d’abord, la contraction sera observée sous forme d’amas isolés et non coordonnés, mais dans quelques jours, les cultures de haute pureté devraient former une monocouche de battement uniforme.
7. Une fois obtenues, ces monocouches contractiles (généralement au jour 10) sont soumises à un processus de sélection métabolique composé de 2 cycles de 72 h en milieu lactique séparés par une étape de replacage pour éliminer les cellules non cardiomyocytes et enrichir la pureté de la culture.
8. Jour 10, première étape de purification (1^ère Lactate) : Laver les cellules de battement avec du milieu de Lactate (0,5 mL par puits) et les incuber avec 1 mL par puits de milieu de Lactate pendant 72 h.
   REMARQUE : L’étape de lavage doit être effectuée avec du milieu Lactate ou le milieu basal sans glucose RPMI 1640 pour éliminer complètement toutes les traces du milieu de glucose précédent (B27).
9. Jour 13 : Laver et laisser les cellules récupérer du premier cycle de purification avec 1,5 ml par puits de milieu B27 pendant 2 jours.
10. Jour 15 (étape de replaquage) : Entre les deux cycles de purification, dissocier les monocouches par lavage à l’EDTA/PBS et incubation au TrypLE pendant 10 min à 37 °C (0,5 mL par puits).
    REMARQUE : Le temps d’incubation dépend de chaque lignée cellulaire.
11. Détachez les cellules à l’aide d’une micropipette de 1000 μL et récupérez-les avec 0,5 mL par puits de milieu B27 complété par 10 % de KSR (v/v) dans un tube à centrifuger stérile.
    REMARQUE : Les cardiomyocytes sont sensibles aux contraintes de cisaillement et aux forts pipetages, alors essayez d’éviter les étapes de pipetage répétées. D’autres options pour une dissociation hiPSC-CM moins dommageable pourraient être l’utilisation de TrypLE 10x ou de collagénase avec DNase. Optimisez le temps d’incubation pour vous assurer qu’il est suffisant pour le détachement des cellules sans causer de dommages cellulaires ou nécessiter un pipetage excessif, ce qui pourrait compromettre l’intégrité des cellules.
12. Centrifugez 10 min à 100 x g à RT et replaquez-les dans des plaques 12 puits revêtues de MGFr 1:80 avec milieu de replaquage. Grainez-les dans 1 mL par puits.
    REMARQUE : Cela éliminera les cellules mortes et la matrice en excès déposées lors de la différenciation, car celles-ci peuvent avoir un impact négatif sur la génération de tissus.
13. Jour 16 : Après 24 h de replacage, retirez Y27 et KSR et conservez les cellules dans le milieu B27 avant l’étape de purification suivante (généralement 48-72 h).
14. Jour 18 : Deuxième étape de purification (2ème^Lactate ). Comme lors du premier cycle, laver et incuber les cellules avec du milieu de lactate pendant 72 h (1 mL par puits).
    REMARQUE : Les cycles de purification peuvent améliorer la pureté de la culture jusqu’à 30 %, comme l’a observé l’analyse par cytométrie en flux du marqueur cardiomyocytaire cTNT (troponine cardiaque T) (non illustré). Ce processus réduit principalement la contamination par les fibroblastes et les hiPSC restants. Bien que le niveau de pureté minimum acceptable requis pour procéder à la génération de tissus sans compromettre le rendement n’ait pas été déterminé, il est recommandé d’utiliser des cultures d’une pureté d’au moins 85 % à 90 %. Ce niveau de pureté favorise une meilleure fixation des cardiomyocytes, améliore la force contractile du tissu final et favorise la reproductibilité entre les expériences.
15. Jour 21 : Une fois la purification au lactate terminée, maintenez les cardiomyocytes purifiés dans le milieu B27 jusqu’à leur utilisation, avec des changements fréquents de milieu (tous les 2-3 jours).
    REMARQUE : Un retard dans l’utilisation diminuera le rendement des cellules car elles seront plus difficiles à détacher. Par conséquent, il est conseillé de les utiliser entre le jour où la deuxième purification au lactate est terminée et moins d’une semaine supplémentaire.

4. Différenciation des fibroblastes cardiaques humains

REMARQUE : Pour obtenir des fibroblastes cardiaques humains (hiPSC-CF) à partir de hiPSC, le protocole suivant est basé sur la méthodologie en deux phases utilisée par Zhang et ^al.16. La première étape consiste à obtenir des cellules épicardiques (hiPSC-EpiCs) en réactivant la voie de signalisation Wnt après induction du mésoderme cardiogénique. Ensuite, les hiPSC-EpiC sont exposés à des inhibiteurs du développement vasculaire et à FGF2 pour obtenir des fibroblastes cardiaques en 18 jours.

1. Assurer l’entretien, la récolte et la densité de semis des hiPSC comme décrit dans le protocole de différenciation des hiPSC-CM. Cultivez des hiPSC sur des plaques 12 puits revêtues de 1:180 MGFr pour commencer la différenciation.
2. Lorsque des monocouches compactes de hiPSC sont obtenues (jour 0), ajouter le milieu -INS complété par 5 μM de CHIR (1,5 mL par puits) pendant 48 h.
   REMARQUE : Titrez la concentration CHIR pour chaque ligne hiPSC pour une induction efficace du mésoderme.
3. Jour 2 : Aspirez et jetez le milieu, lavez les cellules avec du RPMI et remplacez-le par 1,5 mL de milieu frais -INS pendant 24 h.
   REMARQUE : Comme dans le protocole hiPSC-CMs, rincer les cellules lors de tout changement de support ; En fonction de chaque étape, utilisez le milieu basal non supplémenté correspondant.
4. Jour 3 : Incuber des cellules avec un milieu -INS contenant 5 μM de C59 (inhibiteur de Wnt) pendant 48 h (1,5 mL par puits).
5. Jour 5 : Pour le replacage des cellules mésodermiques cardiaques, détacher les cellules en les lavant avec de l’EDTA/PBS et en les incubant avec TrypLE pendant 5 minutes à 37 °C (0,5 mL par puits). Prélever les cellules dans 0,5 mL par puits de milieu basal Advance DMEM (ADMEM) et centrifuger pendant 5 min à 300 x g à RT.
6. Semez-les dans des plaques de 12 puits pré-enrobées de MGFr 1:180 (1 mL par puits) à une densité de 20 000 cellules/^cm2. Pour le replaquage, utilisez ADMEM complété par 5 μM de CHIR, 2 μM d’acide rétinoïque, 10 % de KSR (v/v) et 10 μM de Y27.
7. Jour 6 : À 24 h après le replacage, rafraîchir le milieu pour éliminer Y27 et diminuer KSR à 2 %. Maintenir les mêmes concentrations de CHIR et d’acide rétinoïque pendant 48 h de plus pour obtenir le développement d’un phénotype épicardique.
8. Jour 8 : Culture de cellules avec ADMEM supplémenté plus 2 % de KSR pendant 72 h pour favoriser la génération de monocouches épicardiques.
   REMARQUE : les hiPSC-EpiC semblent être de grandes cellules plates ou cubiques regroupées en colonies uniques. À ce stade, lors de l’exécution des premiers cycles de différenciation, les marqueurs typiques des cellules épicardiques tels que WT1 (antigène nucléaire), ZO1 (antigène de la membrane cytoplasmique) et TCF21 (antigène cytoplasmique) ont pu être analysés par FACS (cytométrie à cellules en flux) ou IF (coloration par immunofluorescence) (non illustré).
9. Jour 11 : Pour le replacage des cellules épicardiques, dissocier le lavage des hiPSC-EpiCs avec de l’EDTA/PBS et incuber avec TrypLE pendant 5 min à 37 °C (0,5 mL par puits). Prélever les cellules dans un milieu FGM3 (0,5 mL par puits) et centrifuger pendant 5 min à 300 x g à RT.
10. Replaquez les hiPSC-EpiCs dans des plaques à 12 puits recouvertes de gélatine à 0,1 % à une densité cellulaire de 10 000 cellules/cm². Utilisez un milieu FGM3 complété par 10 μM de SB (un inhibiteur de la signalisation TGFß1 pour éviter la transition myofibroblastique, généralement lors d’une culture sur plastique) et 10 μM de Y27 (uniquement pendant les 24 premières heures).
11. Le lendemain, rafraîchir le milieu fibroblastique (FGM3 + 10 μM de SB) tous les 2 jours jusqu’à l’obtention de hiPSC-CF, soit un total d’environ 18 jours pour l’ensemble du processus.
    REMARQUE : les hiPSC-CF doivent présenter une morphologie fusiforme. Ici, l’expression du marqueur fibroblastique DDR2 doit être analysée par les techniques FACS et IF (voir étapes 7.1-7.2).
12. Une fois que la culture des hiPSC-CFs est confluente, effectuer des passages cellulaires 1:3 dans des flacons de gélatine pré-enrobés T75 ou T175. Les cellules atteignent 90 % de confluence en 4 à 6 jours environ. Pour détacher les hiPSC-CFs, utiliser le protocole de récolte TrypLE décrit pour le replacage des hiPSC-EpiCs ; ici, Y27 n’est pas nécessaire pour le passage.
13. Maintenir les hiPSC-CF dans un milieu FGM3 + 10 μM de SB jusqu’à leur utilisation ou les congeler à faible passage à une densité cellulaire de 1 à 3 millions de cellules par cryotube.
    REMARQUE : Il est recommandé de maintenir les hiPSC-CF pendant un maximum de 6 passages avant de décongeler de nouvelles cellules, car lorsqu’elles sont cultivées dans des flacons en plastique à long terme, les cellules commencent à se différencier en un phénotype de myofibroblaste plus contractile.

5. Fabrication d’échafaudages d’écriture par électrofilage à l’état fondu (MEW)

REMARQUE : Ce protocole utilise un homopolymère poly ε-caprolactone (PCL) de qualité médicale pour imprimer des échafaudages fibrillaires, à l’aide d’une imprimante MEW spécialement conçue à cet effet par QUT, Queensland University of Technology¹⁰.

1. Préparez un support polymère PCL pour l’impression. Chargez les granules de PCL dans une seringue Luer-lock en plastique de 3 ml fixée à une aiguille de 23 G et faites-les fondre à 80 °C pendant 2 h au four, en appuyant doucement sur le piston pour éliminer les bulles pendant que le polymère est fondu. Préparez plusieurs seringues et rangez-les à RT, car le PCL se solidifie rapidement.
2. Le jour de l’impression, introduisez la seringue à l’intérieur de la chambre de chauffe et connectez-la à un tuyau d’alimentation N₂ sous pression. Allumez l’équipement MEW, réglez les régulateurs de température à 80/65 °C (chambre/buse) et maintenez la seringue pendant 30 min pour assurer une bonne fusion du polymère.
3. Sous la seringue, il y a la plaque collectrice, motorisée et mobile dans les directions XY par un logiciel compatible (Mach3). Déplacez la plaque collectrice (commande des curseurs de l’ordinateur) jusqu’à ce que la tête d’impression soit placée sur un bord de la plaque ou à l’endroit souhaité, et ajustez manuellement la distance entre la chambre de chauffe et la plaque collectrice (distance du collecteur) à 10 mm (plan Z).
   REMARQUE : Cette distance doit être testée expérimentalement pour atteindre un diamètre de fibre donné. Plus la distance entre le collecteur est courte, plus la fibre est épaisse, et vice versa.
4. Fermez la porte de l’équipement, qui connecte automatiquement l’alimentation du champ électrique. Réglez la tension à 7 kV et la pression N₂ à 2 bars afin qu’il puisse extruder à travers la pointe 23 G lors de l’impression.
   REMARQUE : En fournissant une tension élevée, une différence de potentiel est créée entre l’extrémité de la seringue et la plaque collectrice (en acier inoxydable). Ensuite, la goutte accumulée au niveau de la tuyère par la pression fournie devient chargée électrostatiquement, générant le cône de Taylor, qui se dirige vers la plaque collectrice. La tension et la pression peuvent être réglées pour modifier les dimensions finales de la fibre. Les paramètres haute pression extrudent des fibres plus épaisses, nécessitant une tension accrue pour stabiliser la fibre. Le logiciel est basé sur la commande numérique par ordinateur (CNC), de sorte que les géométries d’échafaudage sont écrites sous forme de code G et transmises au programme, qui contrôle le mouvement X-Y et la vitesse du moteur à plaques du collecteur. Par conséquent, avant d’imprimer les échafaudages définitifs, il est recommandé d’imprimer n’importe quel code G comme étape préalable pour obtenir un jet stable qui construit des fibres définies sans aucune apparence d’enroulement ou de fouettage. Pour cela, optimisez les paramètres par de petits changements à chaque fois, c’est-à-dire 0,1 bar pour la pression atmosphérique, 0,1 kV pour la tension et 60-100 mm/min pour la vitesse du collecteur ; cela garantira un comportement du cône de Taylor du jet.
5. Sélectionnez le code G conçu dans le logiciel pour imprimer des échafaudages avec une géométrie carrée. Cet exemple de code G imprime des mailles carrées de 15 couches de 6 cm x 6 cm avec des pores de forme carrée de 0,5 mm x 0,5 mm.
6. Pour imprimer des fibres déposées avec précision (c’est-à-dire des fibres qui se chevauchent), réglez la vitesse du collecteur à 1080 mm/min.
   REMARQUE : Ajustez les paramètres de tension, de pression, de vitesse du collecteur et de distance du collecteur sur chaque équipement MEW pour définir des diamètres de fibre précis (μm). Au-delà de l’influence des paramètres mentionnés précédemment, l’augmentation de la vitesse du collecteur permet d’obtenir des fibres plus fines, tandis que sa diminution produit des fibres plus épaisses. Les paramètres de ce protocole permettent d’imprimer des fibres d’un diamètre de 10 à 15 microns.
7. Appuyez sur le bouton START du logiciel pour lancer l’impression. Retirez délicatement l’échafaudage du collecteur une fois l’impression terminée.
   REMARQUE : Pour faciliter la manipulation de l’échafaudage après l’impression, il est recommandé de l’imprimer sur une pièce de verre plus grande que l’échafaudage, fixée à la base du collecteur avec du ruban adhésif.
8. Découpez le treillis imprimé avec un poinçon de 6 mm de diamètre pour obtenir les échafaudages finaux pour la fabrication de tissus.
9. Comme les mailles PCL sont très hydrophobes, traitez-les pendant 5 min avec du plasma O₂/Argon pour augmenter leur hydrophilie et favoriser l’interaction avec la fibrine et les cellules.
   REMARQUE : En option, un traitement 0,1 N de NaOH pendant 15 min, suivi de lavages PBS approfondis, fonctionne également.
10. Stérilisez les mailles par immersion dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 min, lavez-les abondamment à l’eau distillée stérile pendant 30 minutes et laissez-les sécher.
    REMARQUE : Effectuez ce processus dans une boîte de Pétri stérile et à l’intérieur d’une hotte stérile. Ne séchez pas complètement les mailles avant qu’elles ne soient utilisées pour éviter leur adhérence à la plaque et la déformation qui en résulte.

6. Génération et entretien de mini-tissus de fibrine

REMARQUE : La génération de mini-tissus myocardiques humains 3D repose sur l’encapsulation de cellules cardiaques dérivées de hiPSC dans des hydrogels de fibrine combinés à des échafaudages MEW qui fournissent un soutien fibrillaire. Le protocole suivant a été adapté à partir des approches de conception technique utilisées par Breckwoldt et ^al.17 et Ronaldson-Bouchard et ^al.18.

1. Détachez les hiPSC-CMs comme décrit ci-dessus dans l’étape de replaquage (3.10-3.11) du protocole de différenciation des hiPSC-CMs (récolte TrypLE). Remettez en suspension la pastille cellulaire dans le milieu de génération tissulaire pour compter les cellules dans la chambre Neubauer.
2. Détachez les hiPSC-CFs comme dans l’étape de récolte des hiPSC-CMs avec TrypLE. Utilisez 3 mL de TrypLE pour les flacons T75, 5 mL pour les flacons T175 et le même volume pour inactiver l’incubation de TrypLE. Enfin, remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de génération de tissus, comme pour les MC, car ils vont être mélangés et cultivés dans le même milieu.
3. Comptez les cellules dans une chambre de Neubauer. Calculez le nombre total exact de cellules nécessaires pour ensemencer tous les tissus.
   REMARQUE : Ce protocole utilise 1 million de cellules par tissu, soit 80 % de CM et 20 % de CF, soit 800 000 CM et 200 000 CF. D’autres quantités, telles que des totaux de 1,5 et 3 millions par tissu, sont également réalisables avec de la pratique.
4. Mélangez et granulez les cellules totales nécessaires dans un nouveau tube (Cell Mix), 5 min à 300 x g à RT. Assurez-vous que la granule est complètement sèche et gardez-la sur de la glace jusqu’à l’ensemencement. Calculez le volume total d’hydrogel nécessaire pour ensemencer tous les tissus.
   REMARQUE : Ce protocole nécessite 35 μL par tissu (pour une taille d’échafaudage de 6 mm de diamètre) jusqu’à une densité finale proche de 30 millions de cellules/mL, mais il peut être augmenté, comme déjà mentionné à l’étape 6.4 ci-dessus. Chaque hydrogel de fibrine se compose de 6 mg/mL de fibrinogène et de 5 U/mL de thrombine ainsi que du milieu de génération tissulaire, dans lequel les cellules sont remises en suspension. Pour un hydrogel de 35 μL, le rapport fibrinogène/thrombine est de 1,05 μL/1,8 μL. Un volume final supplémentaire de 10 % d’hydrogel est recommandé pour éviter les pertes de volume dues aux erreurs de pipetage. Exemple : pour 10 tissus, remettre les cellules en suspension dans 350 μL + 10 %, soit 385 μL comme volume final total.
5. Remettez le mélange cellulaire en suspension dans le volume requis de milieu de génération de tissus. Mélangez soigneusement, en évitant la formation de bulles.
   REMARQUE : Pour 10 tissus, remettre en suspension 10 millions de cellules (80 CM : 20 CF) dans 374,5 μL de milieu de génération tissulaire (volume total d’hydrogels moins la quantité totale de fibrinogène requise pour les tissus totaux, c’est-à-dire 10,5 μL).
6. Ajouter le volume requis de fibrinogène et mélanger soigneusement. Pour 10 tissus, ajoutez 10,5 μL de fibrinogène au Cell Mix, générant ainsi le Hydrogel Mix. Gardez-le sur RT.
   REMARQUE : Il est essentiel d’éviter le pipetage excessivement répété afin que les forces de cisaillement n’affectent pas la viabilité des hiPSC-CM. Il est recommandé de couper un morceau de la pointe de la pipette à l’aide d’un scalpel stérile, puis de remettre en suspension l’Hydrogel Mix avec celui-ci pour réduire les dommages causés par le cisaillement.
7. Pour éviter l’adhérence de la fibrine à la plaque, ensemencez un mélange d’hydrogel dans une surface en polytétrafluoroéthylène (PTFE). Pipetez la moitié du volume d’un mouchoir (17,5 μL), qui restera sous forme de goutte, et faites-le pour le nombre total de tissus.
   REMARQUE : Ne faites pas plus de 10 mouchoirs à la fois, car ils peuvent se dessécher.
8. Placez un échafaudage PCL sur chaque goutte et ajoutez le volume restant (17,5 μL). Assurez-vous que l’échafaudage est complètement immergé.
   REMARQUE : Soyez prêt pour le pipetage à deux mains, car la réaction est très rapide. Un tissu à la fois.
9. Ajoutez la quantité requise de thrombine (1,8 μL) avec votre main non dominante et mélangez rapidement l’hydrogel avec la main dominante (en pipetant au moins 2 à 3 fois).
   REMARQUE : Mélanger de préférence en pipetant moins que le volume total, pour éviter la formation de bulles (30 μL). Si une bulle d’air se forme, piquez-la rapidement avec une aiguille.
10. Répétez l’étape précédente pour chaque tissu.
    REMARQUE : Il est conseillé de pratiquer cette technique sans cellules jusqu’à ce qu’une bonne manipulation soit assurée.
11. Incuber les tissus à 37 °C pendant 1 h pour terminer la polymérisation de la fibrine.
12. Prélevez délicatement chaque tissu par le bord à l’aide d’une pince à épiler stérile et placez-les dans des plaques à 12 puits contenant 2 ml par puits du milieu de génération de tissus complété par 33 μg/ml d’aprotinine. Placez un mouchoir par puits.
    REMARQUE : Ne les ramassez pas par le centre de l’hydrogel afin que les cellules puissent être endommagées par la force mécanique. Si nécessaire, utilisez une spatule.
13. Incuber les tissus pendant 24 h à 37 °C.
    REMARQUE : Il est essentiel de maintenir l’aprotinine dans le milieu de culture tissulaire à partir du jour de la génération, car il a été observé que l’omission de l’aprotinine pendant les premières 24 heures, même si elle est ajoutée plus tard, entraîne un détachement cellulaire partiel du treillis et de l’hydrogel. Cela compromet la couverture cellulaire complète nécessaire à l’intégrité du tissu final.
14. Le lendemain, rafraîchissez le milieu avec 2 ml de milieu d’entretien des tissus, en éliminant les résidus de KSR et de Y27. Changez de support tous les deux jours à partir de là.

7. Analyse systématique du potentiel de différenciation cardiaque de la fonction tissulaire hiPSC et mini

1. Analyse par cytométrie en flux
   REMARQUE : Les cellules sont analysées à l’aide de la méthode de cytométrie « Fluorescence-activated Cell Sorting » (FACS) pour déterminer l’efficacité de la différenciation des hiPSC. Toutes les étapes sont effectuées dans des conditions de température ambiante.
   1. Dissocier les cultures cellulaires en suspension unicellulaire (récolte de TrypLE), à la fois les hiPSC-CM et les CF séparément.
   2. Remettez la pastille en suspension à 250 000 cellules/mL dans le tampon FACS et distribuez au moins 1 mL par tube. Incuber pendant 30 minutes pour éviter la liaison d’anticorps non spécifiques.
   3. Centrifugez les cellules à 300 x g à RT pendant 5 min et jetez le surnageant.
      REMARQUE : Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées dans ces conditions.
   4. Pour détecter les antigènes intracellulaires, fixez et perméabilisez les membranes cellulaires à l’aide d’un kit de perméabilisation cellulaire. Tout d’abord, incubez les cellules avec Reactive A (Fix) pendant 30 min et centrifugez-les (comme à l’étape 7.1.3).
   5. Ensuite, incubez des cellules avec le réactif B (Perm) et l’anticorps primaire pendant 30 min. Utilisez 100 μL de réactif par tube.
      1. Pour les hiPSC-CM, utiliser un anticorps cTNT de souris (troponine T cardiaque, marqueur de la CM) à une dilution de 1/200. Pour les hiPSC-CF, utilisez un anticorps DDR2 de souris (récepteur de collagène, marqueur de la FK) à une dilution de 1/500.
         REMARQUE : Pour arrêter toutes les réactions, ajoutez 1 mL de tampon FACS dans chaque tube avant la centrifugation.
   6. Incuber pendant 15 min avec l’anticorps secondaire anti-souris Alexa-Fluor 488 dilué 1/100 dans un tampon FACS.
   7. Laver 3 fois avec du PBS, en centrifugeant entre les lavages (en suivant les mêmes conditions qu’à l’étape 7.1.3), et enfin remettre en suspension la pastille cellulaire dans 400 μL de PBS. Analyse dans un cytomètre ou un appareil similaire.
2. Analyse de coloration par immunofluorescence (IF)
   1. Pour les cultures de cellules cardiaques 2D, ensemencez les deux types de cellules séparément sur un système de puits de chambre de culture basé sur des lames pré-enrobées de 1:80 MGFr ou 0,1 % de gélatine. Plaquez environ 80 000 cellules/^cm2 pour atteindre une confluence cellulaire suffisante pour l’analyse. Pour les mini-mouchoirs 3D, transférez-les doucement à l’aide d’une pince à épiler dans un tube de microcentrifugation de 2 ml.
   2. Jetez le milieu cellulaire et lavez deux fois les cellules ou les tissus avec du PBS. Fixer les échantillons avec 10 % de formol (v/v) à RT ; 15 min pour la chambre de glissement et 1 h pour les mini-mouchoirs.
      ATTENTION : Le formol est dangereux s’il est inhalé et doit être manipulé dans une hotte.
   3. Jetez le tampon de fixation et lavez 5 min avec du PBS trois fois. Conserver les échantillons à 4 °C dans du PBS jusqu’à leur utilisation.
   4. Pour perméabiliser la membrane cellulaire, incubez les cellules avec 0,1 % de Triton X-100 (v/v) pendant 10 min ou des tissus 3D avec 1 % de Tween-20 pendant 15 min à RT. Ensuite, lavez 5 min avec du PBS trois fois.
   5. Pour réduire les liaisons d’anticorps non spécifiques, traitez les échantillons avec une solution d’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % (v/v) pendant 30 min à RT.
   6. Préparez des solutions d’anticorps primaires dans du PBS plus 1 % de BSA pour bloquer les liaisons non spécifiques et incubez-les pendant la nuit à 4 °C.
      1. Pour les hiPSC-CM 2D, utilisez une dilution de 1/400 d’anticorps anti-cardiaque α-ACTN (actinine sarcomérique) de souris. Pour les hiPSC-CF 2D, utilisez une dilution de 1/500 d’anticorps anti-DDR2 de souris. Pour les tissus 3D, combinez les deux anticorps spécifiques du CM et de la FK.
   7. Le lendemain, aspirez la solution d’anticorps et effectuez 3 lavages avec du PBS à RT, 5 min chacun.
   8. Diluer les anticorps secondaires (Alexa-Fluor 488 et Alexa-Fluor 594) à 1/200 et incuber pendant 1 h à RT dans l’obscurité pour identifier les anticorps primaires de souris et de lapin, respectivement. Répétez le lavage PBS trois fois.
   9. Pour contre-colorer les noyaux, incuber des échantillons avec une dilution de 1/500 de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 20 min à RT dans l’obscurité. Répétez trois fois le lavage PBS et conservez les échantillons à 4 °C dans du PBS.
   10. Examinez les échantillons à l’aide d’un microscope confocal, acquérez des images et traitez-les à l’aide d’un logiciel approprié tel que Fiji.
   11. Pour les mini tissus 3D, transférez-les soigneusement avec du PBS entre deux lamelles en verre pour permettre une bonne imagerie.
       REMARQUE : Un objectif à immersion dans l’huile 40x ou supérieur est recommandé pour obtenir des images Z-stack à haute résolution.
3. Analyse de la viabilité cellulaire
   REMARQUE : Le test Alamar Blue (AB) est utilisé pour mesurer l’activité métabolique cellulaire, qui est directement liée à la viabilité cellulaire dans les mini-tissus cardiaques 3D. Effectuez l’ensemble du processus en protégeant les échantillons de la lumière et dans des conditions stériles.
   1. Préparer une solution AB à 10 % (v/v) dans un milieu RPMI 1640 sans rouge de phénol (car cela pourrait interférer avec la mesure colorimétrique).
   2. Transférez soigneusement les mini-tissus cardiaques dans une plaque à 48 puits avec une pince à épiler stérile. Incuber les constructions avec 300 μL de solution AB par tissu pendant 1 h 30 min (ajuster le temps expérimentalement) à 37 °C.
      REMARQUE : Comme les cellules réduisent la résazurine par l’action des enzymes métaboliques, un changement de couleur dans le milieu de culture sera généré, qui sera mesuré par spectrophotométrie à 570 nm et 600 nm.
   3. Pour la mesure, prélever 100 μL par tissu de la solution AB métabolisée dans une plaque à 96 puits et lire les absorbances.
      REMARQUE : Les échantillons peuvent être cultivés après cette analyse en changeant à nouveau le milieu pour le milieu d’entretien des tissus.
4. Analyse de contraction
   REMARQUE : Les mini-tissus cardiaques commencent à battre spontanément, généralement 1 à 2 jours après la génération des tissus.
   1. Mesurez manuellement la fréquence des battements en observant les tissus au microscope optique (battements/min). Si plusieurs tissus sont mesurés en même temps, gardez les plaques au chaud avant chaque lecture.
      REMARQUE : À mesure que la température diminue, le taux de battement commence également à diminuer.
   2. Pour une évaluation prolongée de la contractilité cardiaque, procurez-vous des vidéos de microscopie optique des tissus battants. À 4x pour capturer un plan plus grand ou à 10x à partir de différentes zones de tissus. Enregistrez environ 30 s par vidéo (au moins 3 battements).
   3. Utilisez une fréquence d’images d’au moins 30 images/s et enregistrez la vidéo dans .AVI format.
      REMARQUE : ici, les vidéos ont été analysées à l’aide d’un algorithme de point de suivi personnalisé développé pour MATLAB¹⁰. Avec cette méthode, la vitesse de contraction, le déplacement maximal de contraction (amplitude) et la direction de contraction peuvent être obtenus pour chaque vidéo.
   4. Exécutez directement l’algorithme dans MATLAB pour les vidéos contenues dans le dossier d’analyse. Il fournira automatiquement un document Excel Résultats avec les valeurs de la vitesse de contraction par image, de l’amplitude de contraction par image, de l’angle de contraction (direction) et de ses écarts-types respectifs¹⁰.
   5. Multipliez la « vitesse de contraction par image » par la résolution de l’appareil photo (μm/pixel) et par la fréquence d’images de l’appareil photo (images/s). Cela donnera la valeur finale de la vitesse de contraction (μm/s).
   6. Multipliez l’amplitude de contraction par image par la résolution de la caméra (μm/pixel), et vous obtiendrez la valeur finale de l’amplitude de contraction (μm).
      REMARQUE : Il serait possible d’analyser la cinétique de contraction plus en profondeur à l’aide d’un logiciel tel que MUSCLEMOTION, comme nous l’avons vu ailleurs^19,20. La configuration d’imagerie doit capturer au moins 60 images/s pour l’analyse avec le logiciel.

Résultats

Caractérisation de cellules cardiaques dérivées d’hiPSC 2D
Afin de générer des tissus cardiaques multiphénotypiques, les hiPSC-CM et les hiPSC-CF sont différenciés et caractérisés indépendamment in vitro. Avec une optimisation appropriée et une maintenance stricte, le protocole suivant permettra d’obtenir un rendement hiPSC-CMs de plus de 80 % vers le jour 9 de différenciation, donnant lieu à des cellules battantes spontanément (

Discussion

Pour générer un modèle composite 3D de mini-tissu cardiaque qui reproduit les caractéristiques natives du myocarde humain, plusieurs facteurs essentiels doivent être pris en compte. Ceux-ci peuvent être regroupés en trois points principaux : (1) optimiser le rendement et la pureté des cellules pour la fabrication de tissus, (2) imprimer l’échafaudage fibrillaire pour imiter le mécano-environnement 3D, et (3) intégrer l’hydrogel de fibrine dans le processus de fabrication.<...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide 8 Well chamber coverslip (IbiTreat)	IBIDI	80826
0.1% Gelatin Solution (Embryomax)	Merck Millipore	ES-006-B
10% formalin	Sigma Aldrich	HT501128
12-well plates	Costar/Corning	3513
6-well plates	Costar/Corning	3506
Advanced DMEM 1x (ADMEM)	Gibco	12491015
Aprotinin from bovine lung	Sigma Aldrich	A1153
B-27 SUPLEMENT, PLUS INSULIN (50x)	Life Technologies	A317504044
B27 SUPPLEMENT, MINUS INSULIN (50x)	Life Technologies	A1895601
Biopsy punch (6mm diameter)	Medical	BP-60F
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A9647
CHIR-99021	AXON MEDCHEM	AXON1386
Confocal Laser Scanning Microscope	Zeiss	LSM 800
Culture flask 175 cm	Greiner Bio-One	660175
Culture flask 75 cm	Falcon	353136
Cytometer	Beckman Coulter	CytoFlex
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21202
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-21207
DPBS (Mg2+, Ca2+ free)	Gibco	A314190094
EDTA 0.5M pH 8.0	Life Technologies	AM9260G
ESSENTIAL 8 MEDIUM KIT	Life Technologies	A1517001
FGF2 (Recombinant Human FGF-basic 154 a.a.)	Peprotech	100-18B
Fibrinogen from bovine plasma	Sigma Aldrich	F8630
Fibroblast Growth Medium 3 KIT (FGM3)	PromoCell	C-23130
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828028
Lactate (Sodium L-lactate)	Sigma Aldrich	71718
Matrigel Growth Factor Reduced (MGFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354230
MEW 23-G needle	Nordson	7018302
MEW printer	QUT, Queensland University of Technology
MEW syringe	Nordson	7012072
Mouse Anti-Cardiac Troponin T Monoclonal Antibody	Invitrogen	MA5-12960
Mouse Anti-DDR2 monoclonal antibody	Sigma Aldrich	SAB5300116
Mouse Anti-α-actinin (sarcomeric) Monoclonal Antibody	Sigma Aldrich	A7811
PENICILLIN - STREPTOMYCIN	Life Technologies	15140122
Poly ε-caprolactone (PCL), medical grade	Corbion	PURASORB® PC 12
Rabbit Anti-Vimentin Recombinant Monoclonal Antibody [EPR3776] - Cytoskeleton Marker	Abcam	Ab29547
Retinoic Acid	Sigma Aldrich	R2625
ROCK inhibitor Y-27632 (10mg)	Fisher Scientific	HB2297
RPMI 1640 (L-glutamine)	Gibco	21875034
RPMI 1640 (no phenol red)	Gibco	32404014
RPMI no glucose	Gibco	11879020
SB431542	SELLECK CHEMICALS	S1067
Spectrophotometer	BMG Labtech	SPECTROstar Nano
Thrombin (human alpha thrombin, Factor IIa)	Enzyme Research Lab	HT 1002a
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
TrypLE Express	Life Technologies	12604021
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287
Wnt-C59	AXON MEDCHEM	AXON2287