3D-Generierung von humanem Myokardgewebe mittels Schmelzelektrospinnen, Schreiben von Polycaprolacton-Gerüsten und hiPSC-abgeleiteten Herzzellen

Zusammenfassung

Es wird eine reproduzierbare Methode zur Erzeugung von 3D-Myokardgeweben vorgestellt, bei der MEW-Gerüste (Melt Electrospinning Writing), Polycaprolacton (PCL)-Gerüste und Fibrin-Hydrogele mit hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten und Fibroblasten kombiniert werden. Diese Technik bietet eine präzise Kontrolle über die Gerüstarchitektur und kann in präklinischen Arzneimitteltests und bei der Modellierung von Herzerkrankungen eingesetzt werden.

Zusammenfassung

Die Entwicklung von funktionellem menschlichem Herzgewebe ist vielversprechend für die Weiterentwicklung von Anwendungen im Wirkstoffscreening, in der Krankheitsmodellierung und in der regenerativen Medizin. Dieses Protokoll beschreibt die schrittweise Herstellung von 3D-Myokardgeweben mit fortschrittlicher Nachahmung der nativen Herzstruktur durch die Kombination von Schmelz-Elektrospinning-Writing (MEW), Polycaprolacton (PCL)-Gerüsten mit Fibrin-Hydrogelen und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC)-abgeleiteten Herzzellen. Der Prozess beinhaltet die Einbettung einer Mischung aus Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) und kardialen Fibroblasten (hiPSC-CFs) in eine Fibrinmatrix, um Minigewebe zu erzeugen, wobei die strukturelle Unterstützung durch MEW-generierte Gerüste bereitgestellt wird. Diese fibrillären Gerüste werden im Mikro- bis Nanomaßstab hergestellt und ermöglichen eine präzise Kontrolle über die Faserarchitektur, die eine Schlüsselrolle bei der Organisation der Zellverteilung und -ausrichtung spielt. In der Zwischenzeit fördert die Fibrinmatrix die Lebensfähigkeit der Zellen und ahmt die extrazelluläre Umgebung nach. Die Charakterisierung der erzeugten Gewebe zeigt gut organisierte Sarkomere innerhalb der hiPSC-CMs, zusammen mit einer stabilen kontraktilen Aktivität. Das Gewebe zeigt bereits zwei Tage nach der Aussaat ein konsistentes spontanes Schlagen mit anhaltender Funktionalität über die Zeit. Die Kombination von hiPSC-CFs mit hiPSC-CMs verbessert die strukturelle Integrität des Gewebes und unterstützt gleichzeitig die langfristige Lebensfähigkeit der Zellen. Dieser Ansatz bietet eine reproduzierbare, anpassungsfähige und skalierbare Methode zur Erstellung biomimetischer Herzgewebemodelle und bietet eine vielseitige Plattform für präklinische Wirkstofftests, mechanistische Studien von Herzerkrankungen und potenzielle regenerative Therapien.

Einleitung

Die Herstellung von funktionellen, kardial entwickelten Geweben für den menschlichen Menschen ist vielversprechend für Anwendungen mit hoher Wirkung. Diese reichen von der Entwicklung der Modellierung der Kardiotoxizität von Arzneimitteln und menschlichen Herzerkrankungen bis hin zur Erzeugung von therapeutischen Geweben relevanter Größen¹. Obwohl in den letzten 15 Jahren bedeutende Fortschritte auf diesem Gebiet erzielt wurden, wird die Herstellung von hochmimetischem menschlichem Myokard derzeit durch Schwierigkeiten bei der Reproduktion der komplexen strukturellen und mechanischen Organisation seines natürlichen Gegenstücks vereitelt².

Auf der biologischen Seite eröffnete die revolutionäre Zellreprogrammierungstechnologie die Möglichkeit, patientenspezifische therapeutische Zellen zu entwickeln. Derzeit sind humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) die einzige Quelle für humane Kardiomyozyten in einem personalisierten Kontext. Eine hohe Ausbeute an Kardiomyozyten kann nach robusten Differenzierungsprotokollen erzielt werden ^3,4. Eine Schlüsselfrage ist der Reifegrad, da die derzeit verwendeten humanen hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) unter konventionellen 2D-Differenzierungsbedingungen einen unreifen Phänotyp aufweisen⁵. Das hängt damit zusammen, dass die strukturelle Organisation des Herzgewebes sehr komplex ist, ganz anders als bei herkömmlichen 2D-Kulturen. Außerdem besteht das Myokard aus verschiedenen kardiovaskulären Zellen, einschließlich Nicht-Myozyten wie Herzfibroblasten, glatten Muskeln und Endothelzellen, die durch eine spezifische 3D-Struktur geordnet angeordnet sind und ein effizientes Blutpumpen ermöglichen ^6,7. Daher werden hochstrukturierte humane kardiale Minigewebe benötigt, die sich aus allen wichtigen Zelltypen zusammensetzen, um physiologisch relevante biomimetische Gewebe zu erzeugen.

Die Anwendung neuartiger Biofabrikationsansätze kann diese Sackgasse durchbrechen. Unter diesen ist das Melt Electrospinning Writing (MEW), eine fortschrittliche 3D-Drucktechnologie, die in der Lage ist, eine hohe Präzision und Auflösung zu liefern. Bei MEW wird ein elektrisches Feld verwendet, um ein geschmolzenes Polymer in Form von Fasern im Größenbereich der Zelle abzuscheiden, eine Größenordnung kleiner als beim herkömmlichen Fused Deposition Modeling (FDM) 3D-Druck, was zu hochdefinierten Gerüststrukturen führt ^8,9. MEW hat gezeigt, dass es in der Lage ist, ein komplexes In-silico-Design in eine gedruckte Matrix zu übersetzen und die physikalischen Eigenschaften in 3D so abzustimmen, dass sie denen von Herzgewebe entsprechen¹⁰. Mit der MEW-Technologie ist es möglich, polymere Netze mit unterschiedlichen Formen und Strukturen zu drucken, die in Kombination mit weichzellfreundlichen Hydrogelen Kompositgewebe erzeugen, das die mikro- und makromechanische Umgebung des nativen adulten Myokards nachahmt^11,12. Es hat sich gezeigt, dass eine Änderung des Designs des MEW-3D-Gerüsts die resultierende Funktionalität (Kalziumtransienten)¹⁰ verändert, was die Grundlage für das Verständnis der Form-Funktions-Beziehung bei diesem vielversprechenden 3D-technischen System bildet.

Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von kontraktilen humanen kardialen Minigeweben aus hiPSC-CMs und humanen iPSC-abgeleiteten kardialen Fibroblasten (hiPSC-CFs) und deren Kombination in einem Fibrin-Hydrogel bereitgestellt, das mit 3D-MEW-gedruckten Strukturen verstärkt ist. Die Zugabe von Fibroblasten wurde in verschiedenen 3D-technischen Systemen häufig verwendet, um das Überleben von hiPSC-CM zu verbessern und die Gewebestruktur zu erhalten, aber ihre Verwendung in 3D-MEW-Systemen wurde noch nicht erforscht¹³. Die hier beschriebene Technologie bietet eine vielseitige Plattform für Forscher, die genaue Herzgewebemodelle entwickeln möchten, mit Anwendungen wie dem Verständnis von Krankheitsmechanismen, der präklinischen Toxikologie und dem Wirkstoffscreening. Dieses Modell eignet sich für die Bewertung der Kardiotoxizität etablierter Arzneimittel wie Anthrazykline (z. B. Doxorubicin), Tyrosinkinase-Inhibitoren und neuer Therapien wie chimäre Antigenrezeptor-T (CAR-T)-Zellen, die mit Herzfunktionsstörungen in Verbindung gebracht wurden¹⁴. Darüber hinaus birgt das Modell ein erhebliches Potenzial für die Weiterentwicklung der regenerativen Medizin, indem es die Erprobung von Biomaterialien, Biotinten und zellbasierten Therapien ermöglicht, die darauf abzielen, die Herzfunktion zu verbessern und das Myokardgewebe bei Erkrankungen wie Myokardinfarkt wiederherzustellen.

Protokoll

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Einrichtung von Medien und Reagenzien

1. Vorbeschichtung von Zellkulturplatten
   1. Bereiten Sie Matrigel Growth Factor Reduced (MGFr) Stammaliquote vor. Ein Fläschchen MGFr über Nacht im Kühlschrank auf Eis auftauen lassen. Machen Sie in einer sterilen Haube mit gekühlten Spitzen und wenn Sie den Fond und die Röhrchen immer auf Eis halten, Aliquots mit geeignetem Volumen, indem Sie den Fond 1:1 in kaltem RPMI 1640 L-Glutamin (RPMI) verdünnen.
      HINWEIS: Für hiPSC-Kulturen und die Aussaat von hiPSC-Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) werden verschiedene Verdünnungen von MGFr verwendet. Die MGFr-Beschichtungsverdünnung für hiPS-Zellen variiert je nach Zelllinie. Sobald jedoch das Kardiomyozytenstadium erreicht ist, wird unabhängig von der Zelllinie eine Verdünnung von 1:80 verwendet.
   2. Um Zellkulturplatten zu beschichten, tauen Sie die erforderliche Anzahl von MGFr-Aliquoten langsam auf Eis auf und verdünnen Sie sie weiter in kaltem RPMI, 1:180 für hiPSC-Kulturen (100 μl MGFr in 9 mL RPMI) und 1:80 für hiPSC-CMs, die replattieren (100 μl MGFr in 4 mL RPMI).
      1. Geben Sie das verdünnte MGFr sofort in einem Volumen von 1 ml pro Vertiefung für 6-Well-Platten (hiPSC-Erhaltung) und 0,5 ml pro Vertiefung für 12-Well-Platten (hiPSC-CMs-Replatintierung) zu. Lagern Sie die Platten vor Gebrauch bei 4 °C (bis zu 1 Woche).
         HINWEIS: MGFr-beschichtete Platten sollten vor der Zellaussaat 30 Minuten lang auf 37 °C erwärmt werden. Vor dem Plattieren der Zellen wird die Flüssigkeit aus der MGFr-beschichteten Platte abgesaugt.
   3. Für hiPSC-CF-Kulturen ist die T75- oder T175-Kolben vor der Verwendung mindestens 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) mit 0,1 % Gelatine zu beschichten, und zwar mit einem Volumen von 5 mL für T75 bzw. 10 mL für T175-Kolben. Nach der Inkubation aspirieren Sie die Flüssigkeit vor der Zellaussaat.
2. Zellkulturmedien
   1. Für hiPSC-Kulturen verwenden Sie Complete Essential 8 Medium (E8 Medium), indem Sie Essential 8 Supplement (50x) zu Essential 8 Basal Medium hinzufügen.
   2. Bereiten Sie für die Differenzierung von Kardiomyozyten vor:
      1. RPMI/B27 ohne Insulin (-INS medium): Mischen Sie 500 mL RPMI und 10 mL B27 ohne Insulinzusatz; RPMI/B27 (B27 medium): Mischen Sie 500 mL RPMI und 10 mL B27 Supplement.
   3. Für die Reinigung von Kardiomyozyten (Laktatmedium) fügen Sie 2 ml 1 M Laktat in 500 ml glukosefreies RPMI 1640 hinzu. Das Medium kann bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.
   4. Für die Kardiomyozyten-Replattierung (Replating Medium) ergänzen Sie B27 Medium mit 10% Knock-out-Serumersatz (KSR) und 10 μM Y27.
      HINWEIS: KSR ist eine definierte, serumfreie Formulierung, die FBS in ESC- und iPSC-Kulturprotokollen ersetzt.
   5. Für die Differenzierung und Erhaltung der Fibroblasten (ab Tag 11) bereiten Sie das vollständige Fibroblasten-Wachstumsmedium 3 (FGM3) vor, wie vom Hersteller angegeben. Geben Sie die Ergänzungspackung (0,1 ml/ml fötales Kälberserum, 5 μg/ml rekombinantes Humaninsulin und 1 ng/ml humaner basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, FGF2) zum FGM3-Basalmedium.
      HINWEIS: Um die Proliferation von Fibroblasten zu fördern, wird empfohlen, die FGF2-Konzentration auf 10 ng/ml zu erhöhen.
   6. Bereiten Sie für die Generierung und Pflege von 3D-Herzgewebe Folgendes vor:
      1. Tissue Generation Medium: Ergänzen Sie B27 Medium mit 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S), 10 % KSR und 10 μM Y27. Gewebeerhaltungsmedium: Bereiten Sie B27-Medium mit 1 % P/S und Aprotinin (0,1 % (wt/vol); 33 μg/ml) vor.
         HINWEIS: Aprotinin ermöglicht die Integrität des Fibringels während der Zeit in Kultur, verhindert dessen Abbau und hält die Zellen im Hydrogel. Daher wird dringend empfohlen, es am selben Tag zum Medium hinzuzufügen, an dem das Gewebe erzeugt wird.
3. Niedermolekulare und Wachstumsfaktor-Stammlösungen
   1. CHIR-99021 (CHIR): Für den GSK3-Inhibitor und den Wnt-Signalaktivator ist eine 10 mM Stammlösung herzustellen, indem sie in DMSO gelöst wird. Aliquote bis zu 6 Monate bei -20 °C lagern.
      HINWEIS: Die hiPS-Linien können unterschiedlich auf die CHIR-Behandlung ansprechen. Eine Optimierung der CHIR-Konzentration kann erforderlich sein. Es wird eine CHIR-Prüfung von 6-10 μM empfohlen.
   2. C59, Wnt-Inhibitor: Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung her, indem Sie sie in DMSO auflösen. Aliquote bis zu 6 Monate bei -20 °C lagern.
   3. Y-27632, ROCK-Inhibitor (Y27): Bereiten Sie einen 10 mM-Stamm her, indem Sie ihn in DMSO auflösen. Aliquots bis zu 1 Monat bei -20 °C lagern. Die endgültige Konzentration hängt vom Zielzelltyp ab. Verwenden Sie 2 μM (1/5000) für hiPS-Zellen und 10 μM (1/1000) für hiPS-CMs, hiPSC-CFs und Gewebegenerierung.
      HINWEIS: Y27 fördert das Überleben der Zellen, indem es den Zelltod in Suspension während der Ablösung unterdrückt. Verwenden Sie es bei der Ernte, um einen übermäßigen Zelltod zu vermeiden.
   4. Retinsäure: Bereiten Sie eine 30 mM Stammlösung vor, indem Sie sie in Chloroform auflösen. Lagern Sie die Aliquots bei -20 °C bis zu 2 Jahre.
   5. FGF2 (Rekombinanter humaner Fibroblasten-Wachstumsfaktor, auch FGF-b, fördert die Fibroblastenproliferation): Bereiten Sie eine 50 μg/ml-Stammlösung her, indem Sie sie in sterilem Wasser auflösen. Lagern Sie die Aliquote bei -20 °C bis zu 6 Monate.
   6. SB431542 (SB), TGFß1-Signalinhibitor: Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung her, indem Sie sie in DMSO auflösen. Lagern Sie die Aliquote bei -20 °C bis zu 6 Monate.
      HINWEIS: Fügen Sie es dem Fibroblastenmedium hinzu, um den CF-Zustand aufrechtzuerhalten und den Übergang von Myofibroblasten (der pathologische Phänotyp, der während der Fibrose entsteht) in 2D-Kultur zu verhindern.
4. Stammlösungen für Fibrinhydrogel
   1. Fibrinogen: Bereiten Sie eine Stammlösung von 200 mg/ml vor. Mahlen Sie zunächst die Fibrinogenklumpen mit sterilen Werkzeugen in einer Zellhaube zu einem feinen Pulver. Fügen Sie warme 0,9%ige (wt/vol) NaCl-Lösung hinzu und halten Sie sie bei 37 °C, bis sie sich vollständig aufgelöst hat. Lagern Sie die Aliquote bei -80 °C bis zu einem Jahr; bei 4 °C für 1 Woche.
      HINWEIS: Aufgrund seiner Viskosität bei 4 °C sollten Sie es auftauen und einige Zeit vor dem Schritt der Gewebeerzeugung auf RT halten, damit es genau pipettiert werden kann. Wenn ein Aliquot bei der Wiederverwendung nicht einfach pipettiert werden kann, wird empfohlen, es zu verwerfen und ein neues zu verwenden.
   2. Thrombin: Bereiten Sie eine 100 U/ml-Stammlösung vor, indem Sie Thrombin in sterilem 60 % PBS + 40 % Wasser auflösen. Lagern Sie die Aliquote bei -20 °C bis zu einem Jahr bei 4 °C für bis zu 6 Monate.
      HINWEIS: Tauen Sie es vor dem Gebrauch auf und bewahren Sie es auf Eis auf, bis der Schritt zur Gewebeerzeugung abgeschlossen ist.
   3. Aprotinin: Bereiten Sie eine Stammlösung von 33 mg/ml her, indem Sie Aprotinin in sterilem Wasser auflösen (100 mg Pulver in 3,04 ml Wasser). Lagern Sie die Aliquote bei -20 °C bis zu einem Jahr.
5. Lösungen für die Analyse
   1. FACS-Puffer (Zellzytometrie): Bereiten Sie eine PBS-Lösung (Mg²⁺ und Ca²⁺-frei) plus 2,5 mM EDTA und 5% (v/v) FBS vor.

2. Kultur und Passage menschlicher iPSC

HINWEIS: Die hier beschriebenen Verfahren wurden mit mehreren hiPS-Linien durchgeführt, darunter UCSFi001-A (männlich, freundliches Geschenk von Professor Bruce Conklin, David J. Gladstone Institutes), ESi044-A (männlich), ESi007-A (weiblich) und ESi044-C (weiblich) gesunde Linien und ESi107-A (kardiale Amyloidose weibliche erkrankte Leitung) mit geringfügigen Anpassungen in Bezug auf hiPSC-Kulturmedium, Passagenverdünnung und CHIR-Konzentration. Das Protokoll enthält die spezifischen Details für die Verwendung von UCSFi001-A. Alle Zellkulturinkubationen in diesem Protokoll werden bei 37 °C, 5 % CO₂ und 96 % Luftfeuchtigkeit durchgeführt.

1. Kultur-hiPSC-Linie auf 1:180 MGFr vorbeschichteten 6-Well-Platten. Halten Sie sie auf dem E8-Medium, um die Pluripotenz zu gewährleisten.
   HINWEIS: Um eine spontane Differenzierung zu verhindern, ist es wichtig, ein Überwachsen der Kulturen zu vermeiden. Führen Sie daher die hiPSC-Passage durch, wenn die Zellen zu 80 % bis 90 % konfluent sind.
2. Für die Zellpassage aspirieren Sie das alte Medium, waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 1 ml 0,5 mM EDTA-Lösung, verdünnt in PBS (Mg²⁺- und Ca²⁺-frei), pro Vertiefung und inkubieren Sie 7 Minuten lang in EDTA/PBS bei RT, um interzelluläre Adhäsionen zu stören.
3. Aspirieren Sie das EDTA/PBS und ernten Sie die Zellen, indem Sie sie durch kräftiges Pipettieren mit einer 1000 μL-Mikropipette mit 1 mL E8-Medium über die Oberfläche der Vertiefung lösen, bis die Zellen abgelöst sind. Sammeln Sie sie in einem sterilen Zentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, mehr als 10-15 Mal zu pipettieren, da dies die Zahl der hiPS-Toten erhöht.
4. Nehmen Sie aus diesem Volumen Verdünnungen von 1:15 bis 1:20 vor und säen Sie die Zellen auf MGF-beschichteten 6-Well-Platten in E8-Medium + 2 μM Y27 aus. Halten Sie Y27 nur in den ersten 24 Stunden nach der Aussaat, um Toxizität durch Überbelichtung zu vermeiden.
   HINWEIS: Passen Sie das Teilungsverhältnis für andere hiPS-Linien an, um die Zellen 4-5 Tage lang undifferenziert und auf einer gesunden Morphologie zu halten.
5. Nach 24 h altes Medium aspirieren und frisches E8-Medium mit Raumtemperatur für zwei Tage (normalerweise 3-4 ml) hinzufügen. Wechseln Sie danach das Medium jeden Tag für 3-4 Tage.
   HINWEIS: Die Häufigkeit des Durchgangs hängt von jeder Zelllinie ab. Vermeiden Sie es, 100 % der Konfluenz zu erreichen. hiPSCs sollten in großen, flachen und kompakten Kolonien mit polygonaler Geometrie, geglätteten Kanten und einem hohen Zellkern/Zytoplasma-Verhältnis wachsen.

3. Differenzierung der menschlichen Kardiomyozyten

HINWEIS: Für die Erzeugung von Kardiomyozyten aus hiPSCs (hiPSC-CMs) basiert das beschriebene Protokoll auf der Monolayer-Differenzierungsmethode, die von Lian et ^al.3,15 und Burridge et ^al.4 verwendet wird. Bei angemessener Wartung kann hiPSC über 30 aufeinanderfolgende Durchgänge mit hoher Differenzierungseffizienz differenziert werden. Anzeichen von abnormalem Verhalten werden durch spontane Differenzierung oder konsekutives Versagen von mehr als 4 Differenzierungen erkannt. Regelmäßige Kontrollen, einschließlich Mykoplasmentests, werden empfohlen.

1. Um die kardiale Differenzierung zu initiieren, entnehmen Sie hiPSCs mit einer Konfluenz von 80 % bis 90 %, wie im obigen Zellpassageschritt (Schritt 2) beschrieben. Seed-Zellen in 1:180 MGFr-beschichteten 12-Well-Platten, die die Split-Verdünnungen anpassen, um nach 48-72 h Seeding kompakte Zellmonoschichten bei 90 % der Konfluenz zu erreichen. Für diese Zelllinie nehmen Sie Verdünnungen im Verhältnis 1:10 vor, und die Zellen erreichen die Konfluenz nach 72 Stunden. Wechseln Sie das E8-Medium täglich.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wurden die Verdünnungen nach Volumen und nicht nach der Anzahl der Zellen angepasst, um benutzerabhängige Schwankungen zu vermeiden. Wenn der Monolagenzustand nicht innerhalb von 72 h nach der Beschichtung erreicht wird, ist es sehr wahrscheinlich, dass der Differenzierungsprozess nicht gelingt. In einem solchen Fall ist es ratsam, den Versuch zu verwerfen und neu zu starten, um eine optimale Übergabeeffizienz zu gewährleisten.
2. Wenn Monolagen stabilisiert sind, beginnt der Differenzierungsprozess, der fortan als Tag 0 gilt. Wechseln Sie dann das Medium zu -INS-Medium, das mit 8 μM CHIR, dem Wnt-Signalaktivator, ergänzt wird, und inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 37 °C (1 mL pro Well).
   HINWEIS: Titrieren Sie die CHIR-Konzentration zwischen 6 und 12 μM für jede iPSC-Leitung für eine effiziente Mesoderminduktion. In diesem Schritt wird ein hoher Zelltod erwartet, was ein Zeichen für einen optimalen Prozess ist.
3. Tag 1: Am nächsten Tag aspirieren Sie das Medium aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit RPMI ohne Nahrungsergänzungsmittel (0,5 mL pro Vertiefung). Fügen Sie dann 1,5 ml frisches -INS-Medium hinzu und inkubieren Sie die Zellen 2 Tage lang.
   HINWEIS: Bei allen Medienwechseln werden Waschschritte durchgeführt, um Ablagerungen, abgestorbene Zellen und Rückstände von Nahrungsergänzungsmitteln zu entfernen.
4. Tag 3: Um die Spezifikation der Herzlinie zu induzieren, ersetzen Sie das Medium durch 1,5 ml -INS-Medium, das mit 5 μM Wnt-Inhibitor C59 für 48 Stunden ergänzt wurde.
   HINWEIS: Hier wird der GSK3-Komplex gebildet und ß-Catenin abgebaut, was zu einer kardialen mesodermalen Linie führt. Ein gewisser Zelltod ist auch nach diesem Schritt zu beobachten.
5. Tag 5: Waschen und 48 h lang durch frisches -INS-Medium mit einem Volumen von 1,5 ml pro Vertiefung ersetzen, um die Expansion der Herzvorläuferzellen zu fördern.
6. Tag 7: Ab diesem Tag werden die Zellen im B27-Medium gehalten, wobei das Medium alle 2-3 Tage gewechselt wird.
   HINWEIS: Passen Sie die Medienmenge auf 2,5 ml pro Vertiefung an, um den Wechsel des Mediums während des Wochenendes zu überspringen, jedoch erst, wenn dieser Zustand erreicht ist. Normalerweise beginnen hiPS-CMs an den Tagen 7-9 spontan zu schlagen. Zuerst wird die Kontraktion als isolierte und unkoordinierte Cluster beobachtet, aber in einigen Tagen sollten hochreine Kulturen eine gleichmäßig schlagende Monoschicht bilden.
7. Nach der Gewinnung werden diese kontraktilen Monoschichten (normalerweise am Tag 10) einem metabolischen Selektionsprozess unterzogen, der aus 2 Zyklen von 72 Stunden in Laktatmedium besteht, die durch einen Beschichtungsschritt getrennt sind, um Nicht-Kardiomyozytenzellen zu eliminieren und die Reinheit der Kultur zu bereichern.
8. Tag 10, erster Reinigungsschritt (1^{. Laktat} ): Waschen Sie die schlagenden Zellen mit Laktatmedium (0,5 mL pro Well) und inkubieren Sie sie mit 1 mL pro Well Laktatmedium für 72 h.
   HINWEIS: Der Waschschritt muss mit Laktatmedium oder dem basalen glukosefreien RPMI 1640 durchgeführt werden, um alle Spuren des vorherigen Glukosemediums (B27) vollständig zu entfernen.
9. Tag 13: Waschen Sie die Zellen und lassen Sie sie 2 Tage lang mit 1,5 ml B27-Medium pro Vertiefung von der ersten Reinigungsrunde erholen.
10. Tag 15 (Replattierungsschritt): Zwischen den beiden Reinigungszyklen dissoziieren Sie die Monolayer, indem Sie sie mit EDTA/PBS waschen und 10 Minuten lang bei 37 °C (0,5 mL pro Well) mit TrypLE inkubieren.
    HINWEIS: Die Inkubationszeit hängt von der jeweiligen Zelllinie ab.
11. Nehmen Sie die Zellen mit einer 1000 μL-Mikropipette ab und gewinnen Sie sie mit 0,5 mL B27-Medium pro Well, ergänzt mit 10 % KSR (v/v) in einem sterilen Zentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Kardiomyozyten reagieren empfindlich auf Scherbelastung und starkes Pipettieren, versuchen Sie also, wiederholte Pipettierschritte zu vermeiden. Andere Optionen für eine siPSC-CM-Dissoziation mit geringerem Schaden könnten die Verwendung von TrypLE 10x oder Kollagenase mit DNase sein. Optimieren Sie die Inkubationszeit, um sicherzustellen, dass sie für die Zellablösung ausreicht, ohne Zellschäden zu verursachen oder übermäßiges Pipettieren zu erfordern, was die Zellintegrität beeinträchtigen könnte.
12. Zentrifugieren Sie 10 min bei 100 x g bei RT und plattieren Sie sie in 1:80 MGFr-beschichteten 12-Well-Platten mit Replating Medium. Säen Sie sie in 1 ml pro Vertiefung aus.
    HINWEIS: Dadurch werden überschüssige abgestorbene Zellen und Matrix, die sich während der Differenzierung abgelagert haben, entfernt, da diese sich später negativ auf die Gewebebildung auswirken können.
13. Tag 16: Nach 24 Stunden der Neubeschichtung Y27 und KSR entfernen und die Zellen vor dem nächsten Reinigungsschritt (normalerweise 48-72 Stunden) im B27-Medium halten.
14. Tag 18: Zweiter Reinigungsschritt (2^. Laktat). Waschen und inkubieren Sie die Zellen wie im ersten Zyklus mit Laktatmedium für 72 h (1 mL pro Well).
    HINWEIS: Reinigungszyklen können die Reinheit der Kultur um bis zu 30 % verbessern, wie bei der durchflusszytometrischen Analyse des Kardiomyozytenmarkers cTNT (kardiales Troponin T) (nicht abgebildet) beobachtet wurde. Dieses Verfahren reduziert in erster Linie die Fibroblasten- und verbleibende hiPSC-Kontamination. Obwohl der minimal akzeptable Reinheitsgrad, der erforderlich ist, um mit der Gewebeerzeugung fortzufahren, ohne die Ausbeute zu beeinträchtigen, nicht bestimmt wurde, wird empfohlen, Kulturen mit einer Reinheit von mindestens 85 % bis 90 % zu verwenden. Dieser Reinheitsgrad unterstützt eine verbesserte Kardiomyozytenbindung, erhöht die kontraktile Festigkeit des endgültigen Gewebes und unterstützt die Reproduzierbarkeit zwischen den Experimenten.
15. Tag 21: Wenn die Laktatreinigung abgeschlossen ist, halten Sie die gereinigten Kardiomyozyten bis zu ihrer Verwendung im B27-Medium mit häufigem Medienwechsel (alle 2-3 Tage).
    HINWEIS: Eine Verzögerung bei der Verwendung verringert die Zellenausbeute, da sie schwieriger zu lösen sind. Daher ist es ratsam, sie zwischen dem Tag, an dem die zweite Laktatreinigung abgeschlossen ist, und weniger als einer weiteren Woche zu verwenden.

4. Differenzierung der menschlichen kardialen Fibroblasten

HINWEIS: Um humane kardiale Fibroblasten (hiPSC-CFs) aus hiPSCs zu erhalten, basiert das folgende Protokoll auf der von Zhang et al. verwendeten Zwei-Phasen-Methodik.16. Der erste Schritt besteht darin, epikardiale Zellen (hiPSC-EpiCs) zu gewinnen, indem der Wnt-Signalweg nach kardiogener Mesoderm-Induktion reaktiviert wird. Anschließend werden hiPSC-EpiCs Gefäßentwicklungsinhibitoren und FGF2 ausgesetzt, um innerhalb von 18 Tagen kardiale Fibroblasten zu erhalten.

1. Stellen Sie die Erhaltung, Ernte und Aussaatdichte von hiPSC sicher, wie im Differenzierungsprotokoll von hiPSC-CM beschrieben. Kultur von hiPSCs auf 1:180 MGFr-beschichteten 12-Well-Platten, um die Differenzierung zu starten.
2. Wenn kompakte hiPSC-Monoschichten erreicht sind (Tag 0), fügen Sie -INS-Medium hinzu, das mit 5 μM CHIR (1,5 mL pro Well) für 48 Stunden ergänzt wird.
   HINWEIS: Titrieren Sie die CHIR-Konzentration für jede hiPSC-Leitung für eine effiziente Mesoderminduktion.
3. Tag 2: Aspirieren und verwerfen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit RPMI und ersetzen Sie es für 24 Stunden durch 1,5 ml frisches -INS-Medium.
   HINWEIS: Wie im hiPSC-CMs-Protokoll sollten die Zellen bei jedem Medienwechsel gespült werden. Verwenden Sie je nach Schritt das entsprechende unsupplementierte Basalmedium.
4. Tag 3: Inkubieren Sie Zellen mit -INS-Medium mit 5 μM C59 (Wnt-Inhibitor) für 48 h (1,5 mL pro Well).
5. Tag 5: Für die Neubeschichtung der mesodermalen Herzzellen lösen Sie die Zellen ab, indem Sie sie mit EDTA/PBS waschen und 5 Minuten lang bei 37 °C (0,5 mL pro Well) mit TrypLE inkubieren. Sammeln Sie die Zellen in 0,5 ml Advance DMEM Basalmedium (ADMEM) pro Vertiefung und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300 x g bei RT.
6. Aussaat in 1:180 MGFr vorbeschichteten 12-Well-Platten (1 mL pro Well) mit einer Dichte von 20.000 Zellen/cm². Für die Neubeschichtung ist ADMEM zu verwenden, das mit 5 μM CHIR, 2 μM Retinsäure, 10 % KSR (v/v) und 10 μM Y27 ergänzt wird.
7. Tag 6: 24 Stunden nach der Neubeschichtung das Medium auffrischen, um Y27 zu entfernen und die KSR auf 2 % zu verringern. Halten Sie die gleichen CHIR- und Retinsäurekonzentrationen für weitere 48 Stunden aufrecht, um die Entwicklung eines epikardialen Phänotyps zu erreichen.
8. Tag 8: Kultivierung von Zellen mit ADMEM, supplementiert plus 2% KSR für 72 Stunden, um die Bildung von epikardialen Monoschichten zu fördern.
   HINWEIS: hiPSC-EpiCs scheinen flache oder würfelförmige große Zellen zu sein, die in einzelnen Kolonien gruppiert sind. Zu diesem Zeitpunkt, bei der Durchführung der ersten Differenzierungsrunden, könnten typische Epikardzellmarker wie WT1 (nukleäres Antigen), ZO1 (zytoplasmatisches Membranantigen) und TCF21 (zytoplasmatisches Antigen) mittels FACS (Durchflusszellzytometrie) oder IF (Immunfluoreszenzfärbung) (nicht gezeigt) analysiert werden.
9. Tag 11: Zur Replattierung der Epikardzellen hiPSC-EpiCs mit EDTA/PBS dissoziieren und 5 min bei 37 °C (0,5 mL pro Well) mit TrypLE inkubieren. Sammeln Sie die Zellen in FGM3-Medium (0,5 mL pro Well) und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300 x g bei RT.
10. HiPSC-EpiCs werden in 0,1 % gelatinebeschichteten 12-Well-Platten mit einer Zelldichte von 10.000 Zellen/^cm2 neu plattiert. Verwenden Sie FGM3-Medium, das mit 10 μM SB (einem TGFß1-Signalinhibitor zur Vermeidung eines Myofibroblastenübergangs, normalerweise während der plastischen Kultur) und 10 μM Y27 (nur für die ersten 24 Stunden) ergänzt wird.
11. Am folgenden Tag wird das Fibroblastenmedium (FGM3 + 10 μM SB) alle 2 Tage aufgefrischt, bis die hiPSC-CFs erhalten sind, was insgesamt etwa 18 Tage für den gesamten Prozess ergibt.
    HINWEIS: hiPSC-CFs sollten eine spindelförmige Morphologie aufweisen. Hierbei sollte die Expression des Fibroblastenmarkers DDR2 mittels FACS- und IF-Techniken analysiert werden (siehe Schritte 7.1-7.2).
12. Sobald die hiPSC-CFs-Kultur konfluent ist, führen Sie 1:3 Zellpassagen in gelatinevorbeschichteten T75- oder T175-Kolben durch. Die Zellen erreichen in etwa 4-6 Tagen eine Konfluenz von 90%. Um hiPSC-CFs abzulösen, verwenden Sie das TrypLE-Harvesting-Protokoll, das für die HiPSC-EpiCs-Replatintierung beschrieben ist. hier ist Y27 für den Durchgang nicht erforderlich.
13. Bewahren Sie hiPSC-CFs bis zu ihrer Verwendung in FGM3-Medium + 10 μM SB auf oder frieren Sie sie bei geringer Passage bei einer Zelldichte von 1-3 Millionen Zellen pro Kryoröhrchen ein.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, hiPSC-CFs vor dem Auftauen neuer Zellen maximal 6 Passagen lang aufzubewahren, da sich die Zellen bei langfristiger Kultivierung in Plastikkolben in einen kontraktileren Myofibroblasten-Phänotyp zu differenzieren beginnen.

5. Herstellung von MEW-Gerüsten (Melt Electrospinning Writing)

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet medizinisches Poly ε-Caprolacton (PCL)-Homopolymer zum Drucken von fibrillären Gerüsten unter Verwendung eines MEW-Druckers, der speziell für diesen Zweck von QUT, Queensland University of Technology¹⁰, entwickelt wurde.

1. Bereiten Sie ein PCL-Polymermaterial für den Druck vor. Geben Sie das PCL-Granulat in eine 3-ml-Luer-Lock-Kunststoffspritze, die an einer 23-g-Nadel befestigt ist, und schmelzen Sie es bei 80 °C für 2 h im Ofen, wobei Sie vorsichtig auf den Kolben drücken, um alle Blasen zu entfernen, während das Polymer geschmolzen wird. Bereiten Sie mehrere Spritzen vor und lagern Sie sie bei RT, da sich PCL schnell verfestigt.
2. Führen Sie die Spritze am Tag des Drucks in die Heizkammer ein und schließen Sie sie an eine unter Druck stehende N₂ -Zuleitung an. Schalten Sie MEW-Geräte ein, stellen Sie die Temperaturregler auf 80/65 °C (Kammer/Düse) ein und bewahren Sie die Spritze 30 Minuten lang auf, um ein ordnungsgemäßes Schmelzen des Polymers zu gewährleisten.
3. Unter der Spritze befindet sich die Kollektorplatte, die motorisiert und durch eine kompatible (Mach3) Software in XY-Richtung beweglich ist. Bewegen Sie die Kollektorplatte (Steuerung der Computercursor), bis der Druckkopf auf einer Kante der Platte oder an einer beliebigen Stelle platziert wird, und stellen Sie den Abstand zwischen der Heizkammer und der Kollektorplatte (Kollektorabstand) manuell auf 10 mm (Z-Ebene) ein.
   HINWEIS: Dieser Abstand muss experimentell getestet werden, um einen bestimmten Faserdurchmesser zu erreichen. Je kürzer der Kollektorabstand, desto dicker die Faser und umgekehrt.
4. Schließen Sie die Tür des Geräts, die automatisch die Stromversorgung des elektrischen Feldes verbindet. Stellen Sie die Spannung auf 7 kV und den Druck N₂ auf 2 bar ein, damit sie beim Drucken durch die 23-G-Spitze extrudiert werden kann.
   HINWEIS: Durch die Zufuhr einer hohen Spannung entsteht eine Potentialdifferenz zwischen der Spitze der Spritze und der Auffangplatte (aus Edelstahl). Dann wird der Tropfen, der sich durch den zugeführten Druck an der Düse ansammelt, elektrostatisch aufgeladen, wodurch der Taylor-Kegel erzeugt wird, der auf die Kollektorplatte zusteuert. Spannung und Druck können abgestimmt werden, um die endgültigen Faserabmessungen zu ändern. Hochdruckparameter extrudieren dickere Fasern, die eine erhöhte Spannung erfordern, um die Faser zu stabilisieren. Die Software basiert auf der Computer Numerical Control (CNC), d.h. Gerüstgeometrien werden als G-Code geschrieben und dem Programm zugeführt, das die X-Y-Bewegung und die Drehzahl des Kollektorplattenmotors steuert. Daher wird empfohlen, vor dem Drucken der endgültigen Gerüste einen beliebigen G-Code als vorherigen Schritt zu drucken, um einen stabilen Strahl zu erhalten, der definierte Fasern ohne Wickeln oder Peitschen bildet. Optimieren Sie dazu die Parameter jedes Mal durch kleine Änderungen, d.h. 0,1 bar für den Luftdruck, 0,1 kV für die Spannung und 60-100 mm/min für die Kollektorgeschwindigkeit; Dies gewährleistet ein Taylor-Kegel-Verhalten des Jets.
5. Wählen Sie den entworfenen G-Code in der Software aus, um Gerüste mit einer quadratischen Mustergeometrie zu drucken. In diesem Beispiel-G-Code werden 15-lagige quadratische Maschen von 6 cm x 6 cm mit quadratischen Poren von 0,5 mm x 0,5 mm gedruckt.
6. Um präzise abgeschiedene Fasern (d. h. überlappende Fasern) zu drucken, stellen Sie die Kollektorgeschwindigkeit auf 1080 mm/min ein.
   HINWEIS: Passen Sie die Parameter für Spannung, Druck, Kollektorgeschwindigkeit und Kollektorabstand an jedem MEW-Gerät an, um genaue Faserdurchmesser (μm) zu definieren. Abgesehen vom Einfluss der zuvor genannten Parameter führt die Erhöhung der Kollektorgeschwindigkeit zu dünneren Fasern, während eine Verringerung zu dickeren Fasern führt. Die Parametereinstellungen in diesem Protokoll ermöglichen das Drucken von Fasern mit Durchmessern von 10-15 Mikrometern.
7. Drücken Sie die START-Taste in der Software, um den Druckvorgang zu starten. Entfernen Sie das Gerüst vorsichtig aus dem Auffangbehälter, nachdem der Druck abgeschlossen ist.
   HINWEIS: Um die Handhabung des Gerüsts nach dem Drucken zu erleichtern, wird empfohlen, es auf ein Glasstück zu drucken, das größer als das Gerüst ist und mit Klebeband an der Auffangbasis befestigt ist.
8. Schneiden Sie das bedruckte Netz mit einem Stempel mit einem Durchmesser von 6 mm ab, um die endgültigen Gerüste für die Gewebeherstellung zu erhalten.
9. Da PCL-Netze stark hydrophob sind, behandeln Sie sie 5 Minuten lang mit O₂/Argon-Plasma, um ihre Hydrophilie zu erhöhen und die Interaktion mit Fibrin und Zellen zu fördern.
   HINWEIS: Optional funktioniert auch eine 0,1 N NaOH-Behandlung für 15 Minuten, gefolgt von ausgiebigen PBS-Waschungen.
10. Sterilisieren Sie die Netze durch Eintauchen in 70%iges Ethanol für 30 Minuten, waschen Sie sie 30 Minuten lang ausgiebig mit sterilem destilliertem Wasser und lassen Sie sie trocknen.
    HINWEIS: Führen Sie diesen Vorgang in einer sterilen Petrischale und in einer sterilen Haube durch. Trocknen Sie die Netze nicht vollständig aus, bis sie verwendet werden, um ihre Haftung an der Platte und die daraus resultierende Verformung zu vermeiden.

6. Erzeugung und Erhaltung von Fibrin-Minigewebe

HINWEIS: Die Erzeugung von humanem myokardialen 3D-Minigewebe beruht auf der Verkapselung von hiPSC-abgeleiteten Herzzellen in Fibrin-Hydrogelen in Kombination mit MEW-Gerüsten, die fibrilläre Unterstützung bieten. Das folgende Protokoll wurde von den technischen Designansätzen von Breckwoldt et ^al.17 und Ronaldson-Bouchard et ^al.18 adaptiert.

1. Die hiPSC-CMs werden wie oben im Replating-Schritt (3.10-3.11) des hiPSC-CMs-Differenzierungsprotokolls (TrypLE-Harvesting) beschrieben abgelöst. Resuspendieren Sie das Zellpellet im Tissue Generation Medium, um die Zellen in der Neubauer-Kammer zu zählen.
2. Trennen Sie hiPSC-CFs wie im Harvesting-Schritt von hiPSC-CMs mit TrypLE. Verwenden Sie 3 ml TrypLE für T75, 5 ml für T175-Kolben und das gleiche Volumen für die Inaktivierung der TrypLE-Inkubation. Zum Schluss resuspendieren Sie das Zellpellet in Gewebegenerationsmedium, wie bei CMs, da sie gemischt und im selben Medium kultiviert werden.
3. Zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Kammer. Berechnen Sie die genaue Gesamtzahl der Zellen, die benötigt werden, um alle Gewebe zu säen.
   HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet 1 Million Zellen pro Gewebe, bestehend aus 80% CMs und 20% CFs, d.h. 800.000 CMs und 200.000 CFs. Auch andere Größen, wie z. B. Gesamtmengen von 1,5 und 3 Millionen pro Gewebe, sind mit Übung erreichbar.
4. Mischen und pelletieren Sie die benötigten Gesamtzellen in einem neuen Rohr (Cell Mix), 5 min bei 300 x g bei RT. Stellen Sie sicher, dass das Pellet vollständig trocken ist und bewahren Sie es bis zur Aussaat auf Eis auf. Berechnen Sie das Gesamtvolumen des Hydrogels, das für die Aussaat aller Gewebe erforderlich ist.
   HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert 35 μl pro Gewebe (für eine Gerüstgröße von 6 mm Durchmesser) bis zu einer Enddichte von fast 30 Millionen Zellen/ml, kann aber erhöht werden, wie bereits in Schritt 6.4 oben erwähnt. Jedes Fibrin-Hydrogel besteht aus 6 mg/ml Fibrinogen plus 5 U/ml Thrombin zusammen mit dem Tissue Generation Medium, in dem die Zellen resuspendiert werden. Für ein 35-μl-Hydrogel beträgt das Fibrinogen/Thrombin-Verhältnis 1,05 μl/1,8 μl. Es wird ein zusätzliches Endvolumen von 10 % Hydrogel empfohlen, um Volumenverluste aufgrund von Pipettierfehlern zu vermeiden. Beispiel: Für 10 Gewebe resuspendieren Sie die Zellen in 350 μl + 10 %, d. h. 385 μl als Gesamtendvolumen.
5. Resuspendieren Sie den Zellmix in der erforderlichen Menge des Gewebegenerationsmediums. Vorsichtig mischen, dabei Blasenbildung vermeiden.
   HINWEIS: Für 10 Gewebe resuspendieren Sie 10 Millionen Zellen (80 CMs: 20 CFs) in 374,5 μl Gewebegenerationsmedium (Gesamtvolumen der Hydrogele abzüglich der Gesamtmenge an Fibrinogen, die für das Gesamtgewebe erforderlich ist, d. h. 10,5 μl).
6. Fügen Sie die erforderliche Menge Fibrinogen hinzu und mischen Sie vorsichtig. Für 10 Gewebe fügen Sie dem Zellmix 10,5 μl Fibrinogen hinzu, wodurch der Hydrogel-Mix entsteht. Behalten Sie es bei RT.
   HINWEIS: Es ist wichtig, übermäßig wiederholtes Pipettieren zu vermeiden, damit die Scherkräfte die Lebensfähigkeit der hiPSC-CM nicht beeinträchtigen. Es wird empfohlen, mit einem sterilen Skalpell ein Stück von der Spitze der Pipettenspitze abzuschneiden und dann den Hydrogel-Mix damit wieder zu resuspendieren, um Scherschäden zu reduzieren.
7. Um ein Anhaften von Fibrin an der Platte zu vermeiden, säen Sie Hydrogel Mix in eine Oberfläche aus Polytetrafluorethylen (PTFE). Pipettieren Sie die Hälfte des Volumens eines Gewebes (17,5 μl), das als Tropfen übrig bleibt, und tun Sie dies für die Gesamtzahl der Gewebe.
   HINWEIS: Machen Sie nicht mehr als 10 Taschentücher auf einmal, da diese austrocknen können.
8. Platzieren Sie ein PCL-Gerüst auf jedem Tropfen und fügen Sie das verbleibende Volumen (17,5 μl) hinzu. Stellen Sie sicher, dass das Gerüst vollständig eingetaucht ist.
   HINWEIS: Bereiten Sie sich auf das Pipettieren mit beiden Händen vor, da die Reaktion sehr schnell ist. Ein Taschentuch nach dem anderen.
9. Geben Sie die erforderliche Menge Thrombin (1,8 μl) mit Ihrer nicht-dominanten Hand hinzu und mischen Sie das Hydrogel schnell mit der dominanten Hand (mindestens 2-3 Mal pipettieren).
   HINWEIS: Mischen Sie vorzugsweise durch Pipettieren von weniger als dem Gesamtvolumen, um Blasenbildung (30 μl) zu vermeiden. Wenn sich eine Luftblase bildet, stechen Sie diese schnell mit einer Nadel ein.
10. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt für jedes Gewebe.
    HINWEIS: Es ist ratsam, diese Technik ohne Zellen zu üben, bis eine gute Handhabung gewährleistet ist.
11. Inkubieren Sie das Gewebe 1 h lang bei 37 °C, um die Fibrinpolymerisation abzuschließen.
12. Nehmen Sie jedes Gewebe vorsichtig mit einer sterilen Pinzette am Rand auf und legen Sie es in 12-Well-Platten mit 2 mL pro Well des Tissue Generation Medium, ergänzt mit 33 μg/ml Aprotinin. Legen Sie ein Taschentuch pro Vertiefung.
    HINWEIS: Nehmen Sie sie nicht in der Mitte des Hydrogels auf, da die Zellen durch mechanische Kraft beschädigt werden können. Verwenden Sie bei Bedarf einen Spatel.
13. Inkubieren Sie das Gewebe 24 Stunden lang bei 37 °C.
    HINWEIS: Es ist wichtig, Aprotinin ab dem Tag der Erzeugung im Gewebekulturmedium zu halten, da beobachtet wurde, dass das Weglassen von Aprotinin während der ersten 24 Stunden, auch wenn es später hinzugefügt wird, zu einer teilweisen Zellablösung vom Netz und Hydrogel führt. Dies beeinträchtigt die vollständige Zellabdeckung, die für die Integrität des endgültigen Gewebes erforderlich ist.
14. Am nächsten Tag frischen Sie das Medium mit 2 ml des Gewebeerhaltungsmediums auf und entfernen Sie KSR- und Y27-Rückstände. Wechseln Sie von da an jeden zweiten Tag das Medium.

7. Systematische Analyse des kardialen Differenzierungspotenzials von hiPSC und Mini-Gewebefunktion

1. Durchflusszytometrische Analyse
   HINWEIS: Die Zellen werden mit der Zytometriemodalität "Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung" (FACS) analysiert, um die Effizienz der hiPSC-Differenzierung zu bestimmen. Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt.
   1. Dissoziieren Sie Zellkulturen in Einzelzellsuspensionen (TrypLE-Ernte), sowohl hiPSC-CMs als auch CFs separat.
   2. Resuspendieren Sie das Pellet bei 250.000 Zellen/ml in FACS-Puffer und geben Sie mindestens 1 mL pro Röhrchen ab. 30 Minuten inkubieren, um eine unspezifische Antikörperbindung zu vermeiden.
   3. Zellen bei 300 x g bei RT für 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
      HINWEIS: Alle Zentrifugationsschritte werden unter diesen Bedingungen durchgeführt.
   4. Um intrazelluläre Antigene nachzuweisen, fixieren und permeabilisieren Sie Zellmembranen mit einem Zellpermeabilisierungskit. Zuerst werden die Zellen 30 min lang mit Reactive A (Fix) inkubiert und zentrifugiert (wie in Schritt 7.1.3).
   5. Inkubieren Sie dann die Zellen mit Reactive B (Perm) plus dem primären Antikörper für 30 Minuten. Verwenden Sie 100 μl reaktives Gefäß pro Röhrchen.
      1. Für hiPSC-CM verwenden Sie den Maus-cTNT-Antikörper (kardiales T-Troponin, CM-Marker) in einer Verdünnung von 1/200. Für hiPSC-CF verwenden Sie Maus-DDR2-Antikörper (Kollagenrezeptor, Marker für CF) in einer Verdünnung von 1/500.
         HINWEIS: Um alle Reaktionen zu stoppen, geben Sie vor der Zentrifugation 1 ml FACS-Puffer in jedes Röhrchen.
   6. 15 Minuten lang mit Anti-Maus-Sekundärantikörper Alexa-Fluor 488 inkubieren, der 1/100 in FACS-Puffer verdünnt ist.
   7. Waschen Sie 3 Mal mit PBS, zentrifugieren Sie zwischen den Waschgängen (unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 7.1.3) und resuspendieren Sie schließlich das Zellpellet in 400 μl PBS. Analyse in einem Zytometer oder einem ähnlichen Gerät.
2. Immunfluoreszenz-Färbeanalyse (IF)
   1. Für 2D-Herzzellkulturen säen Sie beide Zelltypen separat auf einem 1:80 MGFr oder 0,1 % Gelatine vorbeschichteten Kulturkammer-Well-System auf Objektträgerbasis. Plattieren Sie ca. 80.000 Zellen/^cm2 , um eine ausreichende Zellkonfluenz für die Analyse zu erreichen. Übertragen Sie 3D-Minigewebe vorsichtig mit einer Pinzette in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   2. Entsorgen Sie das Zellmedium und waschen Sie Zellen oder Gewebe zweimal mit PBS. Fixieren Sie die Proben mit 10% Formalin (v/v) bei RT; 15 min für die Objektträgerkammer und 1 h für Mini-Taschentücher.
      ACHTUNG: Formalin ist gefährlich, wenn es eingeatmet wird, und muss in einem Abzug gehandhabt werden.
   3. Entsorgen Sie den Fixierungspuffer und waschen Sie ihn 5 min lang dreimal mit PBS. Lagern Sie die Proben bis zu ihrer Verwendung bei 4 °C in PBS.
   4. Um die Zellmembran zu permeabilisieren, inkubieren Sie die Zellen 10 min lang mit 0,1 % Triton X-100 (v/v) oder 3D-Gewebe mit 1 % Tween-20 für 15 min bei RT. Dann 5 Minuten dreimal mit PBS waschen.
   5. Um unspezifische Antikörperbindungen zu reduzieren, behandeln Sie die Proben 30 Minuten lang mit einer 3%igen (v/v) Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung bei RT.
   6. Bereiten Sie primäre Antikörperlösungen in PBS plus 1 % BSA vor, um unspezifische Bindungen zu blockieren, und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C.
      1. Verwenden Sie für 2D-hiPS-CMs eine 1/400-Verdünnung des Anti-kardialen α-ACTN-Antikörpers (sarkomerisches Actinin) aus der Maus. Verwenden Sie für 2D-hiPSC-CFs eine 1/500-Verdünnung des Anti-DDR2-Maus-Antikörpers. Kombinieren Sie für 3D-Gewebe die beiden CM- und CF-spezifischen Antikörper.
   7. Am nächsten Tag aspirieren Sie die Antikörperlösung und führen 3 Waschgänge mit PBS bei RT durch, jeweils 5 Minuten.
   8. Die Sekundärantikörper (Alexa-Fluor 488 und Alexa-Fluor 594) bei 1/200 verdünnen und 1 h bei RT im Dunkeln inkubieren, um die Primärantikörper von Maus bzw. Kaninchen zu identifizieren. Wiederholen Sie die PBS-Wäsche dreimal.
   9. Um die Zellkerne gegenzufärben, inkubieren Sie die Proben mit einer Verdünnung von 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) von 1/500 für 20 min bei RT im Dunkeln. Wiederholen Sie den PBS-Waschgang dreimal und lagern Sie die Proben bei 4 °C in PBS.
   10. Untersuchen Sie die Proben mit einem Konfokalmikroskop, nehmen Sie Bilder auf und bearbeiten Sie diese mit geeigneter Software wie z.B. Fiji.
   11. Übertragen Sie 3D-Mini-Gewebe vorsichtig mit PBS zwischen zwei Glasdeckgläsern, um eine gute Bildgebung zu ermöglichen.
       HINWEIS: Ein Objektiv mit 40-facher Ölimmersion oder höher wird empfohlen, um Z-Stapel-Bilder mit hoher Auflösung zu erhalten.
3. Analyse der Zellviabilität
   HINWEIS: Der Alamar Blue Assay (AB) wird verwendet, um die metabolische Aktivität der Zellen zu messen, die in direktem Zusammenhang mit der Zellviabilität in 3D-kardialen Minigeweben steht. Führen Sie den gesamten Prozess unter Lichtschutz und unter sterilen Bedingungen durch.
   1. Bereiten Sie eine 10%ige (v/v) AB-Lösung in RPMI 1640 Medium ohne Phenolrot vor (da dies die kolorimetrische Messung beeinträchtigen könnte).
   2. Übertragen Sie kardiale Minigewebe vorsichtig mit einer sterilen Pinzette auf eine 48-Well-Platte. Inkubieren Sie Konstrukte mit 300 μl AB-Lösung pro Gewebe für 1 h 30 min (Zeit experimentell anpassen) bei 37 °C.
      HINWEIS: Wenn Zellen Resazurin durch die Wirkung von Stoffwechselenzymen reduzieren, wird eine Farbänderung im Kulturmedium erzeugt, die durch Spektrophotometrie bei 570 nm und 600 nm gemessen wird.
   3. Sammeln Sie zur Messung 100 μl der metabolisierten AB-Lösung pro Gewebe in einer 96-Well-Platte und lesen Sie die Absorptionen ab.
      HINWEIS: Nach dieser Analyse können Proben kultiviert werden, indem das Medium erneut auf Gewebeerhaltungsmedium umgestellt wird.
4. Analyse der Kontraktion
   HINWEIS: Kardiale Minigewebe beginnen spontan zu schlagen, normalerweise 1-2 Tage nach der Gewebebildung.
   1. Messen Sie die Schwebungsfrequenz manuell, indem Sie das Gewebe unter dem Lichtmikroskop beobachten (Schläge/min). Wenn viele Gewebe gleichzeitig gemessen werden, halten Sie die Platten vor jeder Messung warm.
      HINWEIS: Wenn die Temperatur sinkt, beginnt auch die Schlaggeschwindigkeit abzunehmen.
   2. Für eine erweiterte Beurteilung der kardialen Kontraktilität erhalten Sie optische Mikroskopievideos des schlagenden Gewebes. Bei 4x, um eine größere Ebene zu erfassen, oder bei 10x, um verschiedene Gewebebereiche zu erfassen. Nehmen Sie ca. 30 s pro Video auf (mindestens 3 Beats).
   3. Verwenden Sie eine Bildrate von mindestens 30 Bildern/s und speichern Sie das Video in .AVI Format.
      HINWEIS: Hier wurden die Videos mit einem speziell für MATLAB¹⁰ entwickelten Tracking-Point-Algorithmus analysiert. Mit dieser Methode können die Kontraktionsgeschwindigkeit, die maximale Kontraktionsverschiebung (Amplitude) und die Kontraktionsrichtung für jedes Video ermittelt werden.
   4. Führen Sie den Algorithmus direkt in MATLAB für die Videos aus, die im Analyseordner enthalten sind. Es wird automatisch ein Excel-Ergebnisdokument mit den Werten der Kontraktionsgeschwindigkeit pro Frame, der Kontraktionsamplitude pro Frame, des Kontraktionswinkels (Richtung) und der jeweiligen Standardabweichungen¹⁰ bereitgestellt.
   5. Multiplizieren Sie "Kontraktionsgeschwindigkeit pro Frame" mit der Kameraauflösung (μm/Pixel) und mit der Kamerabildrate (Frames/s). Dadurch erhält man den Endwert der Kontraktionsgeschwindigkeit (μm/s).
   6. Multiplizieren Sie "Kontraktionsamplitude pro Frame" mit der Kameraauflösung (μm/Pixel), und dies ergibt den Endwert der Kontraktionsamplitude (μm).
      HINWEIS: Es wäre möglich, die Kontraktionskinetik mit einer Software wie MUSCLEMOTION eingehender zu analysieren, wie an anderer Stelle diskutiert ^19,20. Das Imaging-Setup muss mindestens 60 Bilder/s für die Analyse mit der Software erfassen.

Ergebnisse

Charakterisierung von 2D-hiPSC-abgeleiteten Herzzellen
Um multiphänotypisches kardiales Gewebe zu erzeugen, werden hiPSC-CMs und hiPSC-CFs unabhängig voneinander differenziert und in vitro charakterisiert. Bei entsprechender Optimierung und strikter Pflege führt das folgende Protokoll zu einer hiPSC-CMs-Ausbeute von über 80% um den 9. Tag der Differenzierung, was zu spontan schlagenden Zellen führt (Abbildung 1A). Darüber h...

Diskussion

Um ein 3D-Komposit-Kardio-Minigewebemodell zu generieren, das die nativen Eigenschaften des menschlichen Myokards repliziert, müssen mehrere wesentliche Faktoren berücksichtigt werden. Diese lassen sich in drei Hauptpunkte unterteilen: (1) Optimierung der Ausbeute und Reinheit der Zellen für die Gewebeherstellung, (2) Drucken des fibrillären Gerüsts, um die 3D-Mechano-Umgebung nachzuahmen, und (3) Integration des Fibrin-Hydrogels in den Herstellungsprozess.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide 8 Well chamber coverslip (IbiTreat)	IBIDI	80826
0.1% Gelatin Solution (Embryomax)	Merck Millipore	ES-006-B
10% formalin	Sigma Aldrich	HT501128
12-well plates	Costar/Corning	3513
6-well plates	Costar/Corning	3506
Advanced DMEM 1x (ADMEM)	Gibco	12491015
Aprotinin from bovine lung	Sigma Aldrich	A1153
B-27 SUPLEMENT, PLUS INSULIN (50x)	Life Technologies	A317504044
B27 SUPPLEMENT, MINUS INSULIN (50x)	Life Technologies	A1895601
Biopsy punch (6mm diameter)	Medical	BP-60F
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A9647
CHIR-99021	AXON MEDCHEM	AXON1386
Confocal Laser Scanning Microscope	Zeiss	LSM 800
Culture flask 175 cm	Greiner Bio-One	660175
Culture flask 75 cm	Falcon	353136
Cytometer	Beckman Coulter	CytoFlex
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21202
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-21207
DPBS (Mg2+, Ca2+ free)	Gibco	A314190094
EDTA 0.5M pH 8.0	Life Technologies	AM9260G
ESSENTIAL 8 MEDIUM KIT	Life Technologies	A1517001
FGF2 (Recombinant Human FGF-basic 154 a.a.)	Peprotech	100-18B
Fibrinogen from bovine plasma	Sigma Aldrich	F8630
Fibroblast Growth Medium 3 KIT (FGM3)	PromoCell	C-23130
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828028
Lactate (Sodium L-lactate)	Sigma Aldrich	71718
Matrigel Growth Factor Reduced (MGFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354230
MEW 23-G needle	Nordson	7018302
MEW printer	QUT, Queensland University of Technology
MEW syringe	Nordson	7012072
Mouse Anti-Cardiac Troponin T Monoclonal Antibody	Invitrogen	MA5-12960
Mouse Anti-DDR2 monoclonal antibody	Sigma Aldrich	SAB5300116
Mouse Anti-α-actinin (sarcomeric) Monoclonal Antibody	Sigma Aldrich	A7811
PENICILLIN - STREPTOMYCIN	Life Technologies	15140122
Poly ε-caprolactone (PCL), medical grade	Corbion	PURASORB® PC 12
Rabbit Anti-Vimentin Recombinant Monoclonal Antibody [EPR3776] - Cytoskeleton Marker	Abcam	Ab29547
Retinoic Acid	Sigma Aldrich	R2625
ROCK inhibitor Y-27632 (10mg)	Fisher Scientific	HB2297
RPMI 1640 (L-glutamine)	Gibco	21875034
RPMI 1640 (no phenol red)	Gibco	32404014
RPMI no glucose	Gibco	11879020
SB431542	SELLECK CHEMICALS	S1067
Spectrophotometer	BMG Labtech	SPECTROstar Nano
Thrombin (human alpha thrombin, Factor IIa)	Enzyme Research Lab	HT 1002a
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
TrypLE Express	Life Technologies	12604021
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287
Wnt-C59	AXON MEDCHEM	AXON2287