使用聚己内酯支架和 hiPSC 衍生的心肌细胞的熔融静电纺丝写入生成 3D 人体心肌组织

摘要

提出了一种可重复的方法，将熔融静电纺丝书写 （MEW） 聚己内酯 （PCL） 支架和纤维蛋白水凝胶与 hiPSC 衍生的心肌细胞和成纤维细胞相结合来生成 3D 心肌组织。该技术提供了对支架结构的精确控制，可应用于临床前药物检测和心脏病建模。

摘要

功能性人类心脏组织的开发为推进药物筛选、疾病建模和再生医学中的应用带来了巨大的前景。该方案描述了通过将熔融静电纺丝书写 （MEW） 聚己内酯 （PCL） 支架与纤维蛋白水凝胶和人诱导多能干细胞 （hiPSC） 衍生的心肌细胞相结合，逐步制造具有天然心脏结构高级模拟的 3D 心肌组织。该过程包括将心肌细胞 （hiPSC-CM） 和心脏成纤维细胞 （hiPSC-CF） 的混合物嵌入纤维蛋白基质中，以产生微型组织，并由 MEW 生成的支架提供结构支持。这些纤维支架在微米到纳米尺度上制造，允许精确控制纤维结构，这在组织细胞分布和对齐中起着关键作用。同时，纤维蛋白基质促进细胞活力并模拟细胞外环境。生成组织的表征揭示了 hiPSC-CMs 内组织良好的肌节，以及稳定的收缩活性。早在播种后两天，组织就表现出一致的自发跳动，并随着时间的推移具有持续的功能。hiPSC-CF 与 hiPSC-CMs 的组合增强了组织的结构完整性，同时支持长期细胞活力。这种方法为创建仿生心脏组织模型提供了一种可重复、适应性强且可扩展的方法，为临床前药物测试、心脏病的机制研究和潜在的再生疗法提供了一个多功能平台。

引言

功能性人体心脏工程组织的制造在高影响应用中前景广阔。这些研究范围从建模药物、心脏毒性和人类心脏病的开发到相关大小的治疗组织的生成¹。尽管过去 15 年见证了该领域的重大进展，但高度模拟的人类心肌的制造目前因难以再现其自然心肌的复杂结构和机械组织而受阻²。

在生物学方面，革命性的细胞重编程技术为开发患者特异性治疗细胞开辟了可能性。目前，人诱导多能干细胞 （hiPSC） 是个性化环境中人心肌细胞的唯一来源。遵循稳健的分化方案后，可以获得高产量的心肌细胞 ^3,4。一个关键问题是成熟程度，因为目前使用的人 hiPSC 衍生的心肌细胞 （hiPSC-CM） 在常规 2D 分化条件下表现出未成熟表型⁵。这与心脏组织的结构组织非常复杂有关，与传统的 2D 培养完全不同。此外，心肌由不同的心血管细胞组成，包括非肌细胞，如心脏成纤维细胞、平滑肌和内皮细胞，通过特定的 3D 结构有序排列，从而实现高效的血液泵送 ^6,7。因此，需要由所有主要细胞类型组成的高度结构化的人类心脏微型组织来产生生理相关的仿生组织。

新型生物制造方法的应用可以打破这一僵局。其中，熔融静电纺丝书写 （MEW） 是一种先进的 3D 打印技术，能够提供高精度和分辨率。在 MEW 中，使用电场将熔融聚合物以纤维形式沉积在电池的尺寸范围内，比传统的熔融沉积建模 （FDM） 3D 打印小一个数量级，从而产生高度定义的支架结构 ^8,9。MEW 已被证明能够将计算机设计的复合物转化为打印矩阵，并在 3D 中调整物理特性以匹配心脏组织^{的物理特性 10}。使用 MEW 技术，可以打印具有不同形状和结构的聚合物网片，这些网片与软细胞友好型水凝胶相结合，生成模拟天然成人心肌的微观和宏观机械环境的复合组织^11,12。修改 MEW 3D 支架的设计已被证明会改变由此产生的功能（钙瞬变）¹⁰，为理解这个有前途的 3D 工程系统上的形状-功能关系奠定了基础。

这里提供了详细的方案，用于从 hiPSC-CMs 和人 iPSC 衍生的心脏成纤维细胞 （hiPSC-CFs） 制造收缩性人心脏微型组织，以及它们在用 3D MEW 打印结构增强的纤维蛋白水凝胶中的组合。成纤维细胞的添加已广泛用于不同的 3D 工程系统，以提高 hiPSC-CMs 存活并维持组织结构，但尚未探索其在 3D-MEW 系统中的应用¹³。这里描述的技术为旨在开发准确心脏组织模型的研究人员提供了一个多功能平台，其应用包括了解疾病机制、临床前毒理学和药物筛选。该模型适用于评估已建立药物的心脏毒性，例如蒽环类药物（例如阿霉素）、酪氨酸激酶抑制剂和新兴疗法，如嵌合抗原受体 T （CAR-T） 细胞，这些药物与功能障碍有关¹⁴。此外，该模型通过测试生物材料、生物墨水和基于细胞的疗法，旨在改善心肌梗塞等情况下的心脏功能和恢复心肌组织，在推进再生医学方面具有巨大潜力。

研究方案

本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 培养基和试剂设置

1. 细胞培养板的预包被
   1. 制备基质胶生长因子降低 （MGFr） 原液等分试样。将一小瓶 MGFr 在冰箱中加冰解冻过夜。在无菌罩中，使用冷藏尖端并始终将原液和试管置于冰上，通过在冷 RPMI 1640 L-谷氨酰胺 （RPMI） 中以 1：1 稀释原液来制作合适体积的等分试样。
      注：对于 hiPSC 培养和 hiPSC 心肌细胞 （hiPSC-CM） 的接种，使用不同稀释度的 MGFr。hiPSC 的 MGFr 涂层稀释度因特定细胞系而异。然而，一旦达到心肌细胞阶段，无论细胞系如何，都使用 1：80 稀释。
   2. 对于包被细胞培养板，在冰上缓慢解冻所需数量的 MGFr 等分试样，并在冷 RPMI 中进一步稀释它们，hiPSC 培养为 1：180（9 mL RPMI 中为 100 μL MGFr）和 hiPSC-CMs 重新接种为 1：80（4 mL RPMI 中为 100 μL MGFr）。
      1. 立即添加稀释的 MGFr，体积为每孔 1 mL（对于 6 孔板）（hiPSC 维持），对于 12 孔板（hiPSC-CMs 重新接种），每孔体积为 0.5 mL。使用前将板储存在 4 °C（最多 1 周）。
         注意：在细胞接种前，MGFr包被的板应在37°C下加热30分钟。在铺板细胞之前，从 MGFr 包被的板中吸出液体。
   3. 对于 hiPSC-CFs 培养，使用前在室温 （RT） 下用 0.1% 明胶包被 T75 或 T175 培养瓶至少 15 分钟，T75 培养瓶的体积为 5 mL，T175 培养瓶的体积为 10 mL。孵育后，在细胞接种前吸出液体。
2. 细胞培养基
   1. 对于 hiPSC 培养，通过将 Essential 8 添加剂 （50x） 添加到 Essential 8 基础培养基中，使用 Complete Essential 8 培养基（E8 培养基）。
   2. 对于心肌细胞分化，准备：
      1. 不含胰岛素的 RPMI/B27（-INS 培养基）：混合 500 mL RPMI 和 10 mL B27，不含胰岛素补充剂;RPMI/B27（B27 培养基）：混合 500 mL RPMI 和 10 mL B27 补充剂。
   3. 对于心肌细胞纯化（乳酸培养基），将 2 mL 1 M 乳酸添加到 500 mL 无葡萄糖 RPMI 1640 中。培养基可在 4 °C 下储存长达 1 个月。
   4. 对于心肌细胞重新接种（重新接种培养基），用 10% 敲除血清替代物 （KSR） 和 10 μM Y27 补充 B27 培养基。
      注：KSR 是一种成分明确的无血清制剂，可替代 ESC 和 iPSC 培养方案中的 FBS。
   5. 对于成纤维细胞分化和维持（第 11 天以后），请按照制造商的规定制备完整的成纤维细胞生长培养基 3 （FGM3）。将其补充剂包（0.1 mL/mL 胎牛血清、5 μg/mL 重组人胰岛素和 1 ng/mL 人碱性成纤维细胞生长因子 FGF2）添加到 FGM3 基础培养基中。
      注：为了促进成纤维细胞增殖，建议将 FGF2 浓度增加到 10 ng/mL。
   6. 对于 3D 心脏组织的生成和维持，请准备：
      1. 组织生成培养基：在 B27 培养基中补充 1% 青霉素/链霉素 （P/S）、10% KSR 和 10 μM Y27。组织维持培养基：制备含 1% P/S 和抑肽酶（0.1% （wt/vol;33 μg/mL）的 B27 培养基。
         注：抑肽酶在培养期间允许纤维蛋白凝胶完整性，防止其降解并维持水凝胶内的细胞。因此，强烈建议在组织生成当天将其添加到培养基中。
3. 小分子和生长因子储备液
   1. CHIR-99021 （CHIR）：对于 GSK3 抑制剂和 Wnt 信号转导激活剂，通过将 10 mM 储备液溶解在 DMSO 中来制备该溶液。将等分试样在 -20 °C 下储存长达 6 个月。
      注意：hiPSC 系对 CHIR 处理的反应可能不同。可能需要优化 CHIR 浓度。建议使用 6-10 μM CHIR 检测。
   2. C59，Wnt 抑制剂：将 10 mM 储备液溶解在 DMSO 中，制备该溶液。将等分试样在 -20 °C 下储存长达 6 个月。
   3. Y-27632，ROCK 抑制剂 （Y27）：将 10 mM 原液溶解在 DMSO 中，制备 10 mM 原液。将等分试样在 -20 °C 下储存长达 1 个月。最终浓度取决于目标细胞类型。对于 hiPSC，使用 2 μM （1/5000），对于 hiPSC-CM、HIPSC-CF 和组织生成，使用 10 μM （1/1000）。
      注：Y27 通过抑制分离过程中悬浮液中的细胞死亡来促进细胞存活。收获时使用，以避免细胞过度死亡。
   4. 视黄酸：将 30 mM 储备液溶解在氯仿中，制备该溶液。将等分试样在 -20 °C 下储存长达 2 年。
   5. FGF2（重组人成纤维细胞生长因子，也称为 FGF-b，可促进成纤维细胞增殖）：将 50 μg/mL 的储备液溶解在无菌水中，制备该溶液。将等分试样在 -20 °C 下储存长达 6 个月。
   6. SB431542 （SB），TGFß1 信号转导抑制剂：将 10 mM 储备液溶解在 DMSO 中，制备该溶液。将等分试样在 -20 °C 下储存长达 6 个月。
      注：将其添加到成纤维细胞培养基中以维持 CFs 状态并防止 2D 培养中的肌成纤维细胞转化（纤维化过程中出现的病理表型）。
4. 纤维蛋白水凝胶的储备液
   1. 纤维蛋白原：制备 200 mg/mL 储备液。首先，在细胞罩内使用无菌工具将纤维蛋白原块研磨成细粉。加入温热的 0.9% （wt/vol） NaCl 溶液，并将其保持在 37 °C 直至完全溶解。将等分试样在 -80 °C 下储存长达一年;在 4 °C 下放置 1 周。
      注意：由于其在 4 °C 时的粘度，请在组织生成步骤之前的某个时间将其解冻并保持在 RT 下，以便准确移液。如果等分试样在重复使用时不容易移液，建议丢弃并使用新的。
   2. 凝血酶：通过将凝血酶溶解在无菌 60% PBS + 40% 水中来制备 100 U/mL 储备溶液。将等分试样在 -20 °C 下储存长达 1 年，在 4 °C 下保存长达 6 个月。
      注意：使用前，请解冻并将其保存在冰上，直到组织生成步骤完成。
   3. 抑肽酶：将抑肽酶溶于无菌水中（100 mg 粉末溶于 3.04 mL 水中），制备 33 mg/mL 储备液。将等分试样在 -20 °C 下储存长达一年。
5. 分析解决方案
   1. FACS 缓冲液（细胞细胞术）：制备 PBS 溶液（不含 Mg²⁺ 和 Ca²⁺）加 2.5 mM EDTA 和 5% （v/v） FBS。

2. 人 iPSC 培养和传代

注：此处报告的程序已使用几种 hiPSC 系进行，包括 UCSFi001-A（雄性，Bruce Conklin 教授、David J. Gladstone 研究所的善意馈赠）、ESi044-A（雄性）、ESi007-A（雌性）和 ESi044-C（雌性）健康系和 ESi107-A（心脏淀粉样变性女性患病系）与 hiPSC 培养基、传代稀释和 CHIR 浓度有关的微小调整。其协议包含特定于 UCSFi001-A 使用的详细信息。该方案中的所有细胞培养孵育均在 37 °C、5% CO₂ 和 96% 湿度条件下进行。

1. 在 1：180 MGFr 预包被的 6 孔板上培养 hiPSC 系。将它们维持在 E8 培养基上以确保多能性。
   注：为了防止自发分化，避免培养物过度生长至关重要。因此，当细胞汇合 80%-90% 时进行 hiPSC 传代。
2. 对于细胞传代，吸出旧培养基，用 1 mL 用 PBS（不含 Mg²⁺- 和 Ca²⁺-）稀释的 0.5 mM EDTA 溶液洗涤孔两次，并在室温下在 EDTA/PBS 中孵育 7 分钟以破坏细胞间粘附。
3. 吸出 EDTA/PBS 并收获细胞，用 1000 μL 微量移液管和 1 mL E8 培养基在孔表面用力移液分离细胞，直至细胞分离。将它们收集在无菌离心管中。
   注意：避免移液超过 10-15 次，因为这会增加 hiPSC 死亡。
4. 从该体积中，制成 1：15-1：20 稀释液，并将细胞接种在 E8 培养基 + 2 μM Y27 中的 MGF 包被的 6 孔板上。仅在播种后的前 24 小时保持 Y27，以避免过度暴露的毒性。
   注意：调整其他 hiPSC 系的分裂比率，以保持细胞未分化且形态健康 4-5 天。
5. 24 小时后，吸出旧培养基并加入足够两天的新鲜室温 E8 培养基（通常为 3-4 mL）。之后，每天更换培养基 3-4 天。
   注：传代频率取决于每种细胞系;避免达到 100% 的汇合度。hiPSC 应在大、扁平和紧凑的集落中生长，具有多边形几何形状、平滑的边缘和高细胞核/细胞质比率。

3. 人心肌细胞分化

注：对于从 hiPSC （hiPSC-CM） 产生心肌细胞，所描述的方案基于 Lian 等人 ^3,15 和 Burridge 等人 ⁴ 使用的单层分化方法。通过适当的维护，hiPSC 可以在 30 次连续传代中以高分化效率进行分化。通过自发分化或超过 4 次分化的连续失败来检测异常行为的迹象。建议定期对照，包括支原体检测。

1. 为了启动心脏分化，如上述细胞传代步骤（步骤 2）中所述，以 80%-90% 汇合度收获 hiPSC。将细胞接种在 1：180 MGFr 包被的 12 孔板中，调整分流稀释度，以在接种 48-72 小时后以 90% 的汇合度获得紧凑的细胞单层。对于该细胞系，按 1：10 稀释，细胞将在 72 小时达到汇合。每天更换 E8 培养基。
   注意：在本方案中，稀释度已按体积调整，而不是按细胞数量调整，以避免用户依赖性变化。如果在电镀后 72 小时内未达到单层状态，则分化过程很可能不会成功。在这种情况下，建议放弃尝试并重新启动，以确保最佳的传代效率。
2. 当单层稳定时，分化过程开始，此后视为第 0 天。然后，将培养基更换为补充有 8 μM CHIR（Wnt 信号激活剂）的 -INS 培养基，并在 37 °C（每孔 1 mL）下孵育板 24 小时。
   注意：将每个 iPSC 线的 CHIR 浓度滴定在 6-12 μM 之间，以实现高效的中胚层诱导。在此步骤中，预计细胞死亡水平很高，这是最佳过程的标志。
3. 第 1 天：第二天，从每个孔中吸出培养基，并用不含补充剂的 RPMI（每孔 0.5 mL）洗涤细胞。然后，加入 1.5 mL 新鲜的 -INS 培养基，将细胞孵育 2 天。
   注：在所有培养基更换期间执行洗涤步骤，以去除碎片、死细胞和补充剂残留物。
4. 第 3 天：为了诱导心脏谱系规格，用 1.5 mL 补充有 5 μM Wnt 抑制剂 C59 的 -INS 培养基替换培养基 48 小时。
   注意：在这里，GSK3 复合物形成，β-catenin 降解，导致心脏中胚层谱系。在此步骤后也可以观察到一些细胞死亡。
5. 第 5 天：洗涤并更换为新鲜的 -INS 培养基 48 小时，体积为每孔 1.5 mL，以促进心脏祖细胞的扩增。
6. 第 7 天：从这一天开始，细胞维持在 B27 培养基中，每 2-3 天更换一次培养基。
   注：将培养基数量调整为每孔 2.5 mL，以跳过在周末更换培养基，但前提是达到此状态。正常情况下，hiPSC-CMs 在第 7-9 天开始自发跳动。首先，收缩将观察到为孤立和不协调的簇，但在几天内，高纯度培养物应形成均匀的跳动单层。
7. 一旦获得，这些收缩单层（通常在第 10 天）进行代谢选择过程，该过程包括在乳酸培养基中 2 个 72 小时的循环，通过重新接种步骤分离，以消除非心肌细胞并富集培养物的纯度。
8. 第 10 天，第一个纯化步骤（^{第 1 个} 乳酸）：用乳酸培养基（每孔 0.5 mL）洗涤跳动的细胞，并与每孔 1 mL 的乳酸培养基一起孵育 72 小时。
   注：洗涤步骤必须使用乳酸培养基或不含基础葡萄糖的 RPMI 1640 完成，以完全去除先前葡萄糖培养基 （B27） 的所有痕迹。
9. 第 13 天：用每孔 1.5 mL 的 B27 培养基洗涤并让细胞从第一轮纯化中恢复 2 天。
10. 第 15 天（重新电镀步骤）：在两个纯化周期之间，通过用 EDTA/PBS 洗涤并与 TrypLE 在 37 °C（每孔 0.5 mL）孵育 10 分钟来解离单层。
    注意：孵育时间取决于每个细胞系。
11. 使用 1000 μL 微量移液器分离细胞，并在无菌离心管中用每孔 0.5 mL 补充有 10% KSR （v/v） 的 B27 培养基回收细胞。
    注：心肌细胞对剪切应力和强移液敏感，因此请尽量避免重复移液步骤。低损伤 hiPSC-CM 解离的其他选择可能是使用 TrypLE 10x 或含 DNase 的胶原酶。优化孵育时间，确保其足以分离细胞，而不会造成细胞损伤或需要过度移液，这可能会损害细胞完整性。
12. 在 RT 下以 100 x g 离心 10 分钟，然后用重新电镀培养基将它们重新接种在 1：80 MGFr 包被的 12 孔板中。以每孔 1 mL 的浓度接种它们。
    注：这将去除分化过程中沉积的多余死细胞和基质，因为这些细胞和基质稍后会对组织生成产生负面影响。
13. 第 16 天：重新接种 24 小时后，去除 Y27 和 KSR，并在下一个纯化步骤（通常为 48-72 小时）之前将细胞保存在 B27 培养基中。
14. 第 18 天：第二个纯化步骤（^{第 2 个} 乳酸）。与第一个循环一样，用乳酸培养基洗涤细胞并孵育 72 小时（每孔 1 mL）。
    注：纯化循环可将培养物纯度提高多达 30%，如心肌细胞标志物 cTNT（心肌肌钙蛋白 T）的流式细胞术分析所观察到的那样（未显示）。该过程主要减少成纤维细胞和剩余的 hiPSC 污染。虽然尚未确定在不影响产量的情况下进行组织生成所需的最低可接受纯度水平，但建议使用纯度至少为 85%-90% 的培养物。这种纯度水平有助于改善心肌细胞附着，增强最终组织的收缩强度，并支持实验之间的可重复性。
15. 第 21 天：乳酸纯化完成后，将纯化的心肌细胞维持在 B27 培养基中直至使用，并频繁更换培养基（每 2-3 天）。
    注意：延迟使用会降低细胞产量，因为它们更难分离。因此，建议在第二次乳酸纯化完成当天和另外一周之间使用它们。

4. 人心脏成纤维细胞分化

注：为了从 hiPSC 获得人心脏成纤维细胞 （hiPSC-CFs），以下方案基于 Zhang 等人 ¹⁶ 使用的两阶段方法。第一步是在心源性中胚层诱导后通过重新激活 Wnt 信号通路获得心外膜细胞 （hiPSC-EpiCs）。然后，将 hiPSC-EpiC 暴露于血管发育抑制剂和 FGF2 下，在 18 天内获得心脏成纤维细胞。

1. 确保 hiPSC 维持、收获和接种密度，如 hiPSC-CMs 分化方案中所述。在 1：180 MGFr 包被的 12 孔板上培养 hiPSC 以开始分化。
2. 当达到紧凑的 hiPSC 单层时（第 0 天），加入补充有 5 μM CHIR（每孔 1.5 mL）的 -INS 培养基 48 小时。
   注意：滴定每个 hiPSC 线的 CHIR 浓度以实现高效的中胚层诱导。
3. 第 2 天：吸出并丢弃培养基，用 RPMI 洗涤细胞，然后用 1.5 mL 新鲜的 -INS 培养基替换 24 小时。
   注：与 hiPSC-CMs 方案一样，在更换任何培养基期间冲洗细胞;根据每个步骤，使用相应的未补充基础培养基。
4. 第 3 天：将细胞与含有 5 μM C59（Wnt 抑制剂）的 -INS 培养基孵育 48 小时（每孔 1.5 mL）。
5. 第 5 天：对于心脏中胚层细胞的重新接种，通过用 EDTA/PBS 洗涤并与 TrypLE 在 37 °C（每孔 0.5 mL）孵育 5 分钟来分离细胞。将细胞收集在每孔 0.5 mL 的 Advance DMEM 基础培养基 （ADMEM） 中，并在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。
6. 将它们以 20,000 个细胞/cm² 的密度接种在 1：180 MGFr 预包被的 12 孔板（每孔 1 mL）中。对于重新电镀，使用补充有 5 μM CHIR、2 μM 视黄酸、10% KSR （v/v） 和 10 μM Y27 的 ADMEM。
7. 第 6 天：重新电镀后 24 小时，刷新培养基以去除 Y27 并将 KSR 降低至 2%。保持相同的 CHIR 和视黄酸浓度 48 小时以上，以实现心外膜表型的发展。
8. 第 8 天：补充 ADMEM 加 2% KSR 的细胞培养 72 小时，以促进心外膜单层的产生。
   注：hiPSC-EpiC 似乎是扁平或立方体形状的大细胞，分组为单个菌落。此时，当进行第一轮分化时，典型的心外膜细胞标志物，如 WT1（核抗原）、ZO1（细胞质膜抗原）和 TCF21（细胞质抗原）可以通过 FACS（流式细胞术）或 IF（免疫荧光染色）（未显示）。
9. 第 11 天：为了重新接种心外膜细胞，用 EDTA/PBS 洗涤解离 hiPSC-EpiC，并在 37 °C（每孔 0.5 mL）下与 TrypLE 孵育 5 分钟。在 FGM3 培养基（每孔 0.5 mL）中收集细胞，并在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。
10. 将 hiPSC-EpiC 以 10,000 个细胞/cm² 的细胞密度重新接种在 0.1% 明胶包被的 12 孔板中。使用补充有 10 μM SB（一种 TGFß1 信号抑制剂，以避免肌成纤维细胞转化，通常在塑料上培养期间）和 10 μM Y27（仅在前 24 小时）的 FGM3 培养基。
11. 第二天，每 2 天刷新一次成纤维细胞培养基（FGM3 + 10 μM SB），直到获得 hiPSC-CFs，整个过程总共需要 18 天左右。
    注意：hiPSC-CF 应呈现纺锤形形态。在这里，应通过 FACS 和 IF 技术分析成纤维细胞标志物 DDR2 的表达（参见步骤 7.1-7.2）。
12. 一旦 hiPSC-CFs 培养物汇合，在明胶预包被的 T75 或 T175 培养瓶中进行 1：3 的细胞传代。细胞在大约 4-6 天内达到 90% 汇合。要分离 hiPSC-CFs，请使用针对 hiPSC-EpiCs 重新接种描述的 TrypLE 收获方案;在这里，Y27 不需要通过。
13. 将 hiPSC-CF 维持在 FGM3 培养基 + 10 μM SB 中直至使用，或以每管 1-300 万个细胞的细胞密度以低传代方式冷冻。
    注：建议在解冻新细胞之前将 hiPSC-CF 维持最多 6 次传代，因为在塑料瓶中长期培养时，细胞开始分化为更具收缩性的肌成纤维细胞表型。

5. 熔融静电纺丝书写 （MEW） 支架的制造

注意：该协议使用医用级聚 ε-己内酯 （PCL） 均聚物打印纤维支架，使用昆士兰科技大学 QUT 专门为此目的设计的 MEW 打印机¹⁰。

1. 准备用于打印的 PCL 聚合物原液。将 PCL 颗粒装入连接到 23 G 针头的 3 mL 塑料 Luer-lock 注射器中，并在 80 °C 下在烘箱中熔化 2 小时，轻轻按压活塞以去除聚合物熔化时的任何气泡。准备几个注射器并将它们储存在 RT 中，因为 PCL 会迅速凝固。
2. 打印当天，将注射器引入加热室并将其连接到加压的 N₂ 供应管上。打开 MEW 设备，将温度调节器设置为 80/65 °C（腔室/喷嘴），并将注射器保持 30 分钟以确保聚合物正确熔化。
3. 注射器下方有收集板，可通过兼容的 （Mach3） 软件在 XY 方向上电动和移动。移动收集板（计算机光标控制），直到打印头放置在板的一个边缘或任何所需位置，然后手动将加热室和收集板之间的距离（收集器距离）调整到 10 mm（Z 平面）。
   注意：必须对该距离进行实验测试，以获得给定的纤维直径。收集器距离越短，纤维越粗， 反之亦然。
4. 关闭设备门，它会自动连接电场电源。将电压设置为 7 kV，将 N₂ 压力设置为 2 巴，以便在打印时可以通过 23 G 尖端挤出。
   注：通过提供高电压，在注射器尖端和集电板（由不锈钢制成）之间产生电位差。然后，通过提供的压力积聚在喷嘴上的液滴带静电，产生泰勒锥，该锥体驱动到收集板。可以调整电压和压力以修改最终纤维尺寸。高压参数会挤出较粗的纤维，需要增加电压来稳定纤维。该软件基于计算机数控 （CNC），因此脚手架几何形状被写入 G 代码并馈送到程序，该程序控制 X-Y 运动和收集板电机的速度。因此，在打印最终支架之前，建议在前面一步打印任何 G 代码，以获得稳定的射流，从而构建确定的纤维，而不会出现任何盘绕或搅打外观。为此，每次通过小幅变化来优化参数，即气压 0.1 bar，电压 0.1 kV，集电极速度 60-100 mm/min;这将确保射流的泰勒锥行为。
5. 在软件中选择设计的 G 代码 ，以打印具有方形图案几何形状的脚手架。此示例 G 代码打印 6 cm x 6 cm 的 15 层方形网格，方形孔为 0.5 mm x 0.5 mm。
6. 要打印精确沉积的纤维（即重叠的纤维），请将收集器速度调整为 1080 mm/min。
   注意：调整每个 MEW 设备上的电压、压力、收集器速度和收集器距离参数，以定义精确的纤维直径 （μm）。除了前面提到的参数的影响之外，提高集热器速度会导致纤维更细，而减小集热器速度会产生更粗的纤维。该协议中的参数设置可以打印直径为 10-15 微米的纤维。
7. 按软件中的 START 按钮开始打印。打印完成后，小心地从收集器中取出脚手架。
   注意：为了在打印后更轻松地处理脚手架，建议将其打印在大于脚手架的玻璃片上，并用胶带固定在收集器底座上。
8. 用直径为 6 mm 的冲头切割打印的网眼，以获得用于组织制造的最终支架。
9. 由于 PCL 网片具有高度疏水性，因此用 O₂/氩等离子体处理它们 5 分钟，以增加其亲水性并促进与纤维蛋白和细胞的相互作用。
   注：可选地，将 0.1 N NaOH 处理 15 分钟，然后进行广泛的 PBS 洗涤，也有效。
10. 将网片浸入 70% 乙醇中 30 分钟，用无菌蒸馏水充分洗涤 30 分钟，然后晾干。
    注意：在无菌培养皿和无菌罩内进行此过程。在使用网格之前，不要将网格完全干燥，以避免它们粘附在板上并导致变形。

6. 纤维蛋白微型组织的生成和维持

注意：人心肌 3D 微型组织的生成依赖于 hiPSC 衍生的心肌细胞在纤维蛋白水凝胶中的封装，并与提供纤维支撑的 MEW 支架相结合。以下协议改编自 Breckwoldt 等人 ¹⁷ 和 Ronaldson-Bouchard 等人 ¹⁸ 使用的工程设计方法。

1. 如上所述在 hiPSC-CMs 分化方案（TrypLE 收获）的重新电镀步骤 （3.10-3.11） 中分离 hiPSC-CM。将细胞沉淀重悬于组织生成培养基中，以计数 Neubauer 腔室中的细胞。
2. 如使用 TrypLE 的 hiPSC-CMs 收获步骤中的那样，分离 hiPSC-CFs。T75 使用 3 mL TrypLE，T175 培养瓶使用 5 mL，灭活 TrypLE 孵育使用相同体积。最后，将细胞沉淀重悬于组织生成培养基中，与 CM 一样，因为它们将在同一培养基中混合和培养。
3. 在 Neubauer 室中计数细胞。计算接种所有组织所需的确切细胞总数。
   注意：该方案每个组织使用 100 万个细胞，由 80% CM 和 20% CF 组成，即 800,000 个 CM 和 200,000 个 CF。其他数量，例如每个组织的总数为 1.5 和 300 万个，也可以通过练习实现。
4. 在新管（Cell Mix）中混合并沉淀所需的总细胞，在 RT 下以 300 x g 的速度沉淀 5 分钟。确保沉淀完全干燥并将其放在冰上直至接种。计算接种所有组织所需的水凝胶总体积。
   注：该方案要求每个组织 35 μL（对于直径为 6 mm 的支架尺寸）至接近 3000 万个细胞/mL 的最终密度，但可以增加，如上文步骤 6.4 中所述。每个纤维蛋白水凝胶由 6 mg/mL 纤维蛋白原和 5 U/mL 凝血酶以及组织生成培养基组成，其中细胞被重悬。对于 35 μL 水凝胶，纤维蛋白原/凝血酶比值为 1.05 μL/1.8 μL。建议额外添加 10% 的最终体积的水凝胶，以避免因移液错误而导致的体积损失。示例：对于 10 个组织，将细胞重悬于 350 μL + 10% 中，即 385 μL 的总最终体积。
5. 将 细胞混合物 重悬于所需体积的组织生成培养基中。小心混合，避免形成气泡。
   注：对于 10 个组织，将 1000 万个细胞（80 CM：20 CF）重悬于 374.5 μL 组织生成培养基（水凝胶总体积减去总组织所需的纤维蛋白原总量，即 10.5 μL）中。
6. 加入所需体积的纤维蛋白原并小心混合。对于 10 个组织，向 Cell Mix 中加入 10.5 μL 纤维蛋白原，生成 水凝胶混合物。把它放在 RT 里。
   注意：必须避免过度重复移液，以免剪切力影响 hiPSC-CMs 活力。建议用无菌手术刀从移液器吸头的尖端切下一块，然后用它重悬水 凝胶混合物 以减少剪切损伤。
7. 为避免纤维蛋白粘附在板上，将 Hydrogel Mix 接种在聚四氟乙烯 （PTFE） 表面。移液管组织体积的一半 （17.5 μL），该组织将保持为液滴，并对组织总数进行移液。
   注意：一次制作不超过 10 张纸巾，因为它们会变干。
8. 在每滴液的顶部放置 PCL 支架，并添加剩余体积 （17.5 μL）。确保脚手架完全浸入水中。
   注意：请准备好用双手移液，因为反应非常快。一次一张纸巾。
9. 用非惯用手加入所需量的凝血酶 （1.8 μL），并与惯用手快速混合水凝胶（至少移液 2-3 次）。
   注：最好通过移液小于总体积的移液进行混匀，以避免形成气泡 （30 μL）。如果形成气泡，请用针快速刺破。
10. 对每个组织重复上一步。
    注意：建议在没有细胞的情况下练习这种技术，直到确保良好的处理。
11. 将组织在 37 °C 下孵育 1 小时以完成纤维蛋白聚合。
12. 用无菌镊子轻轻地捡起每个组织的边缘，并将它们放入 12 孔板中，每孔 2 mL 组织生成培养基，补充有 33 μg/mL 抑肽酶。每孔放置一个组织。
    注意：不要通过水凝胶的中心拾取它们，以免细胞被机械力损坏。如有必要，请使用抹刀。
13. 将组织在 37 °C 下孵育 24 小时。
    注意：从生成之日起，将抑肽酶维持在组织培养基中至关重要，因为已经观察到在前 24 小时内省略抑肽酶，即使后来添加，也会导致细胞部分脱离网状物和水凝胶。这损害了最终组织完整性所需的完全细胞覆盖。
14. 第二天，用 2 mL 组织维持培养基刷新培养基，去除 KSR 和 Y27 残基。从那时起，每隔一天更换一次培养基。

7. hiPSC 心脏分化电位和小组织功能的系统分析

1. 流式细胞术分析
   注：使用“荧光激活细胞分选”（FACS） 细胞术模式分析细胞，以确定 hiPSC 分化的效率。所有步骤均在室温条件下进行。
   1. 将细胞培养物解离成单细胞悬液（TrypLE 收获），分别分离 hiPSC-CM 和 CF。
   2. 在 FACS 缓冲液中以 250,000 个细胞/mL 的浓度重悬沉淀，每管至少分配 1 mL。孵育 30 分钟以避免非特异性抗体结合。
   3. 在 RT 下以 300 x g 离心细胞 5 分钟，弃去上清液。
      注：所有离心步骤均在这些条件下进行。
   4. 为了检测细胞内抗原，使用细胞透化试剂盒固定和透化细胞膜。首先，将细胞与反应性 A （Fix） 孵育 30 分钟并离心（如步骤 7.1.3 所示）。
   5. 然后，将细胞与反应性 B （Perm） 和一抗一起孵育 30 分钟。每管使用 100 μL 反应性。
      1. 对于 hiPSC-CM，使用 1/200 稀释度的小鼠 cTNT 抗体（心脏 T 肌钙蛋白，CM 标志物）。对于 hiPSC-CFs，使用 1/500 稀释度的小鼠 DDR2 抗体（胶原受体、CF 标志物）。
         注：要终止所有反应，请在离心前向每个试管中加入 1 mL FACS 缓冲液。
   6. 用在 FACS 缓冲液中以 1/100 稀释的抗小鼠 Alexa-Fluor 488 二抗孵育 15 分钟。
   7. 用 PBS 洗涤 3 次，在洗涤之间离心（遵循与步骤 7.1.3 相同的条件），最后将细胞沉淀重悬于 400 μL PBS 中。在细胞仪或类似设备中分析。
2. 免疫荧光染色分析 （IF）
   1. 对于 2D 心脏细胞培养物，将两种细胞类型分别接种在 1：80 MGFr 或 0.1% 明胶预包被的基于载玻片的培养室孔系统上。铺板约 80,000 个细胞/cm² ，以达到足够的细胞汇合度以进行分析。对于 3D 迷你组织，用镊子轻轻地将其转移到 2 mL 微量离心管中。
   2. 丢弃细胞培养基，用 PBS 洗涤细胞或组织两次。在 RT 下用 10% 福尔马林 （v/v） 固定样品;载玻片室 15 分钟，微型组织 1 小时。
      注意：福尔马林吸入是危险的，必须在通风橱中处理。
   3. 弃去固定缓冲液，用 PBS 洗涤 5 分钟，三次。将样品在 4 °C 的 PBS 中储存直至使用。
   4. 为了透化细胞膜，在 RT 下将细胞与 0.1% Triton X-100 （v/v） 孵育 10 分钟或将 3D 组织与 1% Tween-20 孵育 15 分钟。然后，用 PBS 洗涤 5 分钟，三次。
   5. 为了减少非特异性抗体结合，在 RT 下用 3% （v/v） 牛血清白蛋白 （BSA） 溶液处理样品 30 分钟。
   6. 在 PBS 加 1% BSA 中制备一抗溶液以阻断非特异性结合并在 4 °C 下孵育过夜。
      1. 对于 2D hiPSC-CM，使用 1/400 稀释的抗心脏 α-ACTN（肌节肌动蛋白）小鼠抗体。对于 2D hiPSC-CFs，使用 1/500 稀释的抗 DDR2 小鼠抗体。对于 3D 组织，将两种 CM 和 CF 特异性抗体混合使用。
   7. 第二天，吸出抗体溶液，并在 RT 下用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
   8. 以 1/200 稀释二抗（Alexa-Fluor 488 和 Alexa-Fluor 594），并在黑暗中在 RT 下孵育 1 小时，以分别鉴定小鼠和兔一抗。重复 PBS 洗涤 3 次。
   9. 为了复染细胞核，将样品与 1/500 稀释的 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 在 RT 下在黑暗中孵育 20 分钟。重复 PBS 洗涤 3 次，并将样品在 4 °C 的 PBS 中储存。
   10. 用共聚焦显微镜检查样品，获取图像，并使用合适的软件（如 Fiji）对其进行处理。
   11. 对于 3D 迷你组织，用 PBS 在两个玻璃盖玻片之间小心地转移它们，以实现良好的成像。
       注意：建议使用 40 倍油浸或更高的物镜，以获得高分辨率的 Z 轴堆栈图像。
3. 细胞活力分析
   注：Alamar Blue 测定法 （AB） 用于测量细胞代谢活性，这与 3D 心脏微型组织中的细胞活力直接相关。执行整个过程，保护样品避光和在无菌条件下。
   1. 在不含酚红的 RPMI 1640 培养基中制备 10% （v/v） AB 溶液（因为它可能会干扰比色测量）。
   2. 用无菌镊子小心地将心脏微型组织转移到 48 孔板中。将构建体与每个组织 300 μL AB 溶液在 37 °C 下孵育 1 小时 30 分钟（根据实验调整时间）。
      注：当细胞通过代谢酶的作用还原刃天青时，培养基中会产生颜色变化，这将通过 570 nm 和 600 nm 分光光度法测量。
   3. 为了进行测量，在 96 孔板中收集每个组织 100 μL 的代谢 AB 溶液并读取吸光度。
      注：在此分析后，可以通过再次将培养基更换为组织维持培养基来培养样品。
4. 收缩分析
   注意：心脏小组织通常在组织生成后 1-2 天开始自发跳动。
   1. 通过在光学显微镜下观察组织（心跳/分钟）来手动测量跳动频率。如果同时测量许多组织，请在每次读数前保持板温暖。
      注意：随着温度的降低，打浆率也开始降低。
   2. 对于扩展的心脏收缩力评估，获取跳动组织的光学显微镜视频。以 4 倍捕获更大的平面，或以 10 倍从不同的组织区域捕获。每个视频录制大约 30 秒（至少 3 个节拍）。
   3. 使用至少 30 帧/秒的帧速率，并以 .AVI 格式保存视频。
      注意：在这里，视频是使用为 MATLAB¹⁰ 开发的定制跟踪点算法进行分析的。使用这种方法，可以获得每个视频的收缩速度、收缩最大位移（幅度）和收缩方向。
   4. 直接在 MATLAB 中对 analysis 文件夹中包含的视频运行算法。它将自动提供一个 Results Excel 文档，其中包含每帧收缩速度、每帧收缩幅度、收缩角度（方向）及其各自的标准偏差¹⁰ 的值。
   5. 将“每帧收缩速度”乘以相机分辨率 （μm/pixel） 和相机帧速率 （frames/s）。这将给出收缩速度的最终值 （μm/s）。
   6. 将“每帧收缩幅度”乘以相机分辨率 （μm/pixel），这将得到收缩幅度的最终值 （μm）。
      注意：可以使用 MUSCLEMOTION 等软件更深入地分析收缩动力学，如其他地方^19,20 所述。成像设置必须捕获至少 60 帧/秒，以便使用软件进行分析。

结果

2D hiPSC 来源的心肌细胞的表征
为了产生多表型心脏组织，hiPSC-CMs 和 hiPSC-CFs 在体外独立分化和表征。通过适当的优化和严格的维护，以下方案将导致 hiPSC-CMs 在分化第 9 天左右的产量超过 80%，从而产生自发跳动的细胞（图 1A）。此外，通过代谢选择进行的纯度富集在很大程度上消除了非 hiPSC-CM，导致培养物由超过 90% 的细胞组?...

讨论

要生成复制人类心肌天然特征的 3D 复合心脏微型组织模型，必须考虑几个基本因素。这些可以分为三个要点：（1） 优化用于组织制造的细胞的产量和纯度，（2） 打印纤维支架以模拟 3D 机械环境，以及 （3） 将纤维蛋白水凝胶集成到制造过程中。

确保成功分化过程的一些关键步骤包括通过防止汇合度超过 90% 来维持 hiPSC 的多能性特性，优化传代时 ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide 8 Well chamber coverslip (IbiTreat)	IBIDI	80826
0.1% Gelatin Solution (Embryomax)	Merck Millipore	ES-006-B
10% formalin	Sigma Aldrich	HT501128
12-well plates	Costar/Corning	3513
6-well plates	Costar/Corning	3506
Advanced DMEM 1x (ADMEM)	Gibco	12491015
Aprotinin from bovine lung	Sigma Aldrich	A1153
B-27 SUPLEMENT, PLUS INSULIN (50x)	Life Technologies	A317504044
B27 SUPPLEMENT, MINUS INSULIN (50x)	Life Technologies	A1895601
Biopsy punch (6mm diameter)	Medical	BP-60F
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A9647
CHIR-99021	AXON MEDCHEM	AXON1386
Confocal Laser Scanning Microscope	Zeiss	LSM 800
Culture flask 175 cm	Greiner Bio-One	660175
Culture flask 75 cm	Falcon	353136
Cytometer	Beckman Coulter	CytoFlex
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21202
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-21207
DPBS (Mg2+, Ca2+ free)	Gibco	A314190094
EDTA 0.5M pH 8.0	Life Technologies	AM9260G
ESSENTIAL 8 MEDIUM KIT	Life Technologies	A1517001
FGF2 (Recombinant Human FGF-basic 154 a.a.)	Peprotech	100-18B
Fibrinogen from bovine plasma	Sigma Aldrich	F8630
Fibroblast Growth Medium 3 KIT (FGM3)	PromoCell	C-23130
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828028
Lactate (Sodium L-lactate)	Sigma Aldrich	71718
Matrigel Growth Factor Reduced (MGFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354230
MEW 23-G needle	Nordson	7018302
MEW printer	QUT, Queensland University of Technology
MEW syringe	Nordson	7012072
Mouse Anti-Cardiac Troponin T Monoclonal Antibody	Invitrogen	MA5-12960
Mouse Anti-DDR2 monoclonal antibody	Sigma Aldrich	SAB5300116
Mouse Anti-α-actinin (sarcomeric) Monoclonal Antibody	Sigma Aldrich	A7811
PENICILLIN - STREPTOMYCIN	Life Technologies	15140122
Poly ε-caprolactone (PCL), medical grade	Corbion	PURASORB® PC 12
Rabbit Anti-Vimentin Recombinant Monoclonal Antibody [EPR3776] - Cytoskeleton Marker	Abcam	Ab29547
Retinoic Acid	Sigma Aldrich	R2625
ROCK inhibitor Y-27632 (10mg)	Fisher Scientific	HB2297
RPMI 1640 (L-glutamine)	Gibco	21875034
RPMI 1640 (no phenol red)	Gibco	32404014
RPMI no glucose	Gibco	11879020
SB431542	SELLECK CHEMICALS	S1067
Spectrophotometer	BMG Labtech	SPECTROstar Nano
Thrombin (human alpha thrombin, Factor IIa)	Enzyme Research Lab	HT 1002a
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
TrypLE Express	Life Technologies	12604021
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287
Wnt-C59	AXON MEDCHEM	AXON2287