Generación de tejido miocárdico humano en 3D mediante escritura por electrohilado de fusión de andamios de policaprolactona y células cardíacas derivadas de hiPSC

Resumen

Se presenta un método reproducible para generar tejidos miocárdicos en 3D combinando andamios de escritura por electrohilatura por fusión (MEW), policaprolactona (PCL) e hidrogeles de fibrina con cardiomiocitos y fibroblastos derivados de hiPSC. Esta técnica ofrece un control preciso sobre la arquitectura del andamio y se puede aplicar en pruebas preclínicas de medicamentos y modelado de enfermedades cardíacas.

Resumen

El desarrollo de tejidos cardíacos humanos funcionales es muy prometedor para avanzar en aplicaciones en la detección de fármacos, el modelado de enfermedades y la medicina regenerativa. Este protocolo describe la fabricación escalonada de tejidos miocárdicos en 3D con mimetismo avanzado de la estructura cardíaca nativa mediante la combinación de andamios de policaprolactona (PCL) con hidrogeles de fibrina y células cardíacas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC). El proceso consiste en incrustar una mezcla de cardiomiocitos (hiPSC-CM) y fibroblastos cardíacos (hiPSC-CF) dentro de una matriz de fibrina para crear minitejidos, con soporte estructural proporcionado por andamios generados por MEW. Estos andamios fibrilares se fabrican a micro y nanoescala, lo que permite un control preciso sobre la arquitectura de la fibra, que desempeña un papel clave en la organización de la distribución y alineación de las células. Mientras tanto, la matriz de fibrina promueve la viabilidad celular e imita el entorno extracelular. La caracterización de los tejidos generados revela sarcómeros bien organizados dentro de los hiPSC-CM, junto con una actividad contráctil estable. Los tejidos muestran un batido espontáneo consistente tan pronto como dos días después de la siembra, con una funcionalidad sostenida en el tiempo. La combinación de hiPSC-CF con hiPSC-CM mejora la integridad estructural de los tejidos al tiempo que apoya la viabilidad celular a largo plazo. Este enfoque ofrece un método reproducible, adaptable y escalable para crear modelos biomiméticos de tejido cardíaco, proporcionando una plataforma versátil para pruebas preclínicas de fármacos, estudios mecanicistas de enfermedades cardíacas y posibles terapias regenerativas.

Introducción

La fabricación de tejidos funcionales de ingeniería cardíaca humana es muy prometedora para aplicaciones de alto impacto. Estos abarcan desde el desarrollo de modelos de cardiotoxicidad de fármacos y enfermedades cardíacas humanas hasta la generación de tejidos terapéuticos de tamaños relevantes¹. A pesar de que los últimos 15 años han sido testigos de avances significativos en el campo, la fabricación de miocardio humano altamente mimético se ve actualmente frustrada por las dificultades para reproducir la compleja organización estructural y mecánica de su contraparte natural².

Desde el punto de vista biológico, la revolucionaria tecnología de reprogramación celular abrió la posibilidad de desarrollar células terapéuticas específicas para cada paciente. En la actualidad, las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) son la única fuente de cardiomiocitos humanos en un contexto personalizado. Se puede obtener un alto rendimiento de cardiomiocitos siguiendo protocolos de diferenciación robustos ^3,4. Una cuestión clave es el grado de maduración, ya que los cardiomiocitos derivados de hiPSC humanos (hiPSC-CM) utilizados actualmente muestran un fenotipo inmaduro en condiciones convencionales de diferenciación 2D⁵. Esto está ligado al hecho de que la organización estructural del tejido cardíaco es muy compleja, absolutamente diferente a los cultivos 2D convencionales. Además, el miocardio está compuesto por diferentes células cardiovasculares, incluyendo no miocitos como los fibroblastos cardíacos, el músculo liso y las células endoteliales, dispuestas ordenadamente a través de una estructura 3D específica, lo que permite un bombeo eficiente de la sangre ^6,7. Por lo tanto, se necesitan minitejidos cardíacos humanos altamente estructurados compuestos por todos los tipos principales de células para generar tejidos biomiméticos fisiológicamente relevantes.

La aplicación de nuevos enfoques de biofabricación puede romper este estancamiento. Entre ellas, la escritura por electrohilado fundido (MEW), una tecnología avanzada de impresión 3D es capaz de proporcionar una alta precisión y resolución. En MEW, se utiliza un campo eléctrico para depositar un polímero fundido en forma de fibras en el rango de tamaño de la celda, un orden de magnitud menor que la impresión 3D convencional de modelado por deposición fundida (FDM), lo que da como resultado estructuras de andamio altamente definidas ^8,9. MEW ha demostrado ser capaz de traducir un complejo diseño in silico en una matriz impresa y ajustar las propiedades físicas en 3D para que coincidan con las del tejido cardíaco¹⁰. Utilizando la tecnología MEW, es posible imprimir mallas poliméricas con diferentes formas y estructuras que, combinadas con hidrogeles blandos amigables con las células, generan tejidos compuestos que imitan el entorno micro y macromecánico del miocardio adulto nativo^11,12. Se ha demostrado que la modificación del diseño del andamio MEW 3D altera la funcionalidad resultante (transitorios de calcio)¹⁰, estableciendo las bases para comprender la relación forma-función en este prometedor sistema de ingeniería 3D.

Aquí, se proporciona un protocolo detallado para la fabricación de mini tejidos cardíacos contráctiles humanos a partir de hiPSC-CM y fibroblastos cardíacos derivados de iPSC humanos (hiPSC-CF) y su combinación dentro de un hidrogel de fibrina reforzado con estructuras impresas en MEW en 3D. La adición de fibroblastos ha sido ampliamente utilizada en diferentes sistemas de ingeniería 3D para mejorar la supervivencia de las hiPSC-CMs y mantener la estructura de los tejidos, pero su uso en sistemas 3D-MEW aún no se ha explorado¹³. La tecnología descrita aquí proporciona una plataforma versátil para los investigadores que buscan desarrollar modelos precisos de tejido cardíaco con aplicaciones como la comprensión de los mecanismos de la enfermedad, la toxicología preclínica y el cribado de fármacos. Este modelo es adecuado para evaluar la cardiotoxicidad de fármacos establecidos como las antraciclinas (por ejemplo, doxorrubicina), los inhibidores de la tirosina cinasa y las terapias emergentes como las células T con receptor de antígeno quimérico (CAR-T), que se han asociado con la disfunción cardíaca¹⁴. Además, el modelo tiene un potencial significativo en el avance de la medicina regenerativa al permitir la prueba de biomateriales, biotintas y terapias basadas en células destinadas a mejorar la función cardíaca y restaurar el tejido miocárdico en afecciones como el infarto de miocardio.

Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Configuración de medios y reactivos

1. Pre-recubrimiento de placas de cultivo celular
   1. Preparar las alícuotas de las acciones de Matrigel Growth Factor Reduced (MGFr). Descongele un vial de MGFr durante la noche en el refrigerador con hielo. En una campana estéril, utilizando puntas refrigeradas y manteniendo la culata y los tubos en hielo en todo momento, realice alícuotas de volumen adecuado diluyendo la culata 1:1 en frío RPMI 1640 L-glutamina (RPMI).
      NOTA: Para el cultivo de hiPSC y la siembra de cardiomiocitos hiPSC (hiPSC-CMs), se utilizan diferentes diluciones de MGFr. La dilución del recubrimiento MGFr para hiPSC varía según la línea celular específica. Sin embargo, una vez que se alcanza la etapa de cardiomiocitos, se utiliza la dilución 1:80 independientemente de la línea celular.
   2. Para el recubrimiento de placas de cultivo celular, descongele lentamente el número requerido de alícuotas de MGFr en hielo y diluya aún más en RPMI frío, 1:180 para el cultivo de hiPSC (100 μL de MGFr en 9 mL de RPMI) y 1:80 para el rerecubrimiento de hiPSC-CM (100 μL de MGFr en 4 mL de RPMI).
      1. Agregue inmediatamente el MGFr diluido a un volumen de 1 mL por pocillo para placas de 6 pocillos (mantenimiento de hiPSC) y 0,5 mL por pocillo para placas de 12 pocillos (rechapado de hiPSC-CM). Guarde las placas a 4 °C antes de usarlas (hasta 1 semana).
         NOTA: Las placas recubiertas de MGFr deben calentarse a 37 °C durante 30 minutos antes de la siembra de las células. Antes de colocar las células, aspire el líquido de la placa recubierta de MGFr.
   3. Para el cultivo de hiPSC-CFs, recubrir los matraces T75 o T175 con gelatina al 0,1% durante al menos 15 min a temperatura ambiente (RT) antes de su uso, a un volumen de 5 mL para los matraces T75 o de 10 mL para los matraces T175. Después de la incubación, aspire el líquido antes de la siembra de las células.
2. Medios de cultivo celular
   1. Para el cultivo de hiPSC, utilice Complete Essential 8 Medium (E8 medium) añadiendo Essential 8 Supplement (50x) a Essential 8 Basal Medium.
   2. Para la diferenciación de cardiomiocitos, prepare:
      1. RPMI/B27 sin insulina (medio -INS): Mezclar 500 mL de RPMI y 10 mL de B27 sin suplemento de insulina; RPMI/B27 (B27 medio): Mezclar 500 mL de RPMI y 10 mL de suplemento de B27.
   3. Para la purificación de cardiomiocitos (medio lactato), agregue 2 mL de lactato 1 M en 500 mL de RPMI 1640 sin glucosa. El medio puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
   4. Para el replanteo de cardiomiocitos (medio de replaticación), complemente el medio B27 con un 10% de reposición de suero knock-out (KSR) y 10 μM de Y27.
      NOTA: KSR es una formulación definida y sin suero que reemplaza a FBS en los protocolos de cultivo ESC e iPSC.
   5. Para la diferenciación y el mantenimiento de los fibroblastos (día 11 en adelante), prepare el medio de crecimiento de fibroblastos 3 (FGM3) completo según las especificaciones del fabricante. Añada su paquete de suplementos (0,1 mL/mL de suero fetal de ternero, 5 μg/mL de insulina humana recombinante y 1 ng/mL de factor de crecimiento básico de fibroblastos humanos, FGF2) al medio basal FGM3.
      NOTA: Para promover la proliferación de fibroblastos, se recomienda aumentar la concentración de FGF2 a 10 ng/mL.
   6. Para la generación y el uso de mantenimiento de tejido cardíaco en 3D, prepare:
      1. Medio de generación de tejidos: Suplemento del medio B27 con 1% de penicilina/estreptomicina (P/S), 10% de KSR y 10 μM de Y27. Medio de mantenimiento de tejidos: Prepare medio B27 con 1% de P/S y aprotinina (0,1% (peso/vol); 33 μg/mL).
         NOTA: La aprotinina permite la integridad del gel de fibrina durante el tiempo de cultivo, evitando su degradación y manteniendo las células dentro del hidrogel. Por lo tanto, es muy recomendable que se agregue al medio el mismo día que se genera el tejido.
3. Soluciones madre de moléculas pequeñas y factores de crecimiento
   1. CHIR-99021 (CHIR): Para el inhibidor de GSK3 y el activador de señalización de Wnt, prepare una solución madre de 10 mM disolviéndola en DMSO. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
      NOTA: Las líneas hiPSC pueden responder al tratamiento CHIR de manera diferente. Es posible que sea necesario optimizar la concentración de CHIR. Se recomienda una prueba CHIR de 6-10 μM.
   2. C59, inhibidor de Wnt: Prepare una solución madre de 10 mM disolviéndola en DMSO. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
   3. Y-27632, inhibidor de ROCK (Y27): Prepare un stock de 10 mM disolviéndolo en DMSO. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de 1 mes. La concentración final depende del tipo de célula objetivo. Utilice 2 μM (1/5000) para hiPSC y 10 μM (1/1000) para hiPSC-CM, hiPSC-CF y generación de tejidos.
      NOTA: Y27 promueve la supervivencia celular al suprimir la muerte celular en suspensión durante el desprendimiento. Úselo al cosechar para evitar la muerte celular excesiva.
   4. Ácido retinoico: Preparar una solución madre de 30 mM disolviéndola en cloroformo. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de 2 años.
   5. FGF2 (Factor de Crecimiento de Fibroblastos Humanos Recombinante, también FGF-b, promueve la proliferación de fibroblastos): Preparar una solución madre de 50 μg/mL disolviéndola en agua estéril. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
   6. SB431542 (SB), inhibidor de señalización de TGFß1: Prepare una solución madre de 10 mM disolviéndola en DMSO. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
      NOTA: Añádalo al medio de fibroblastos para mantener el estado de FQ y prevenir la transición de miofibroblastos (el fenotipo patológico que surge durante la fibrosis) en el cultivo 2D.
4. Soluciones madre para hidrogel de fibrina
   1. Fibrinógeno: Prepare una solución madre de 200 mg/mL. Primero, muela los grumos de fibrinógeno hasta convertirlos en un polvo fino usando herramientas estériles dentro de una campana celular. Agregue una solución tibia de NaCl al 0,9% (peso/vol) y manténgala a 37 °C hasta que se disuelva por completo. Almacene las alícuotas a -80 °C hasta un año; a 4 °C durante 1 semana.
      NOTA: Debido a su viscosidad a 4 °C, descongélelo y manténgalo en RT en algún momento antes de la etapa de generación de tejido para que pueda pipetearse con precisión. Si una alícuota no se puede pipetear fácilmente cuando se reutiliza, se recomienda desecharla y utilizar una nueva.
   2. Trombina: Preparar una solución madre de 100 U/mL disolviendo trombina en agua estéril al 60% de PBS + 40%. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de un año a 4 °C durante un máximo de 6 meses.
      NOTA: Antes de usarlo, descongélelo y manténgalo en hielo hasta que se complete el paso de generación de tejido.
   3. Aprotinina: Prepare una solución madre de 33 mg/mL disolviendo aprotinina en agua estéril (100 mg de polvo en 3,04 mL de agua). Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de un año.
5. Soluciones para el análisis
   1. Tampón FACS (citometría celular): Prepare una solución de PBS (libre de Mg²⁺ y Ca²⁺) más 2,5 mM de EDTA y 5% (v/v) de FBS.

2. Cultura y paso de la iPSC humana

NOTA: Los procedimientos reportados aquí se han realizado con varias líneas sanas de hiPSC, incluyendo UCSFi001-A (macho, amable regalo del Profesor Bruce Conklin, Institutos David J. Gladstone), ESi044-A (macho), ESi007-A (hembra) y ESi044-C (hembra) y ESi107-A (línea enferma femenina de amiloidosis cardíaca) con adaptaciones menores relacionadas con el medio de cultivo de hiPSC, la dilución de paso y la concentración de CHIR. Su protocolo contiene los detalles específicos del uso de UCSFi001-A. Todas las incubaciones de cultivos celulares en este protocolo se realizan a 37 °C, 5% de CO₂ y 96% de humedad.

1. Línea de cultivo hiPSC en placas de 6 pocillos prerrevestidas MGFr 1:180. Manténgalos en el medio E8 para garantizar la pluripotencia.
   NOTA: Para evitar la diferenciación espontánea, es fundamental evitar el crecimiento excesivo de las culturas. Por lo tanto, realice el paso de hiPSC cuando las células sean 80%-90% confluentes.
2. Para el paso de las células, aspirar el medio viejo, lavar los pocillos dos veces con 1 mL de solución de EDTA 0,5 mM diluida en PBS (libre de Mg²⁺- y Ca²⁺) por pocillo, e incubar durante 7 min en EDTA/PBS a RT para interrumpir las adherencias intercelulares.
3. Aspirar el EDTA/PBS y recolectar las células, separándolas mediante un pipeteo vigoroso con una micropipeta de 1000 μL con 1 mL de medio E8 sobre la superficie del pocillo hasta que se desprendan las células. Recójalos en un tubo de centrífuga estéril.
   NOTA: Evite pipetear más de 10-15 veces, ya que aumentará la muerte por hiPSC.
4. A partir de este volumen, realice diluciones 1:15-1:20 y siembre las células en placas de 6 pocillos recubiertas con MGF en medio E8 + 2 μM de Y27. Mantenga Y27 solo las primeras 24 horas después de la siembra para evitar toxicidad por sobreexposición.
   NOTA: Ajuste la proporción de división para otras líneas de hiPSC para mantener las células indiferenciadas y en una morfología saludable durante 4-5 días.
5. Después de 24 h, aspire el medio viejo y agregue un medio E8 fresco a temperatura ambiente suficiente para dos días (generalmente 3-4 mL). Después de eso, cambie el medio cada día durante 3-4 días.
   NOTA: La frecuencia de paso depende de cada línea celular; Evita alcanzar el 100% de confluencia. Las hiPSCs deben crecer en colonias grandes, planas y compactas con geometría poligonal, bordes suavizados y una alta relación núcleo/citoplasma.

3. Diferenciación de cardiomiocitos humanos

NOTA: Para la generación de cardiomiocitos a partir de hiPSCs (hiPSC-CMs), el protocolo descrito se basa en la metodología de diferenciación monocapa utilizada por Lian et ^al.3,15 y Burridge et ^al.4. Con un mantenimiento adecuado, hiPSC se puede diferenciar en 30 pasos consecutivos con una alta eficiencia de diferenciación. Los signos de comportamiento anormal se detectan por diferenciación espontánea o fallo consecutivo de más de 4 diferenciaciones. Se recomiendan controles regulares, incluidas pruebas de micoplasma.

1. Para iniciar la diferenciación cardíaca, recoja las hiPSC con una confluencia del 80%-90% como se describe en el paso de la célula anterior (paso 2). Celdas de siembra en placas de 12 pocillos recubiertas con MGFr 1:180 ajustando las diluciones divididas para lograr monocapas de celdas compactas al 90% de confluencia después de 48-72 h de siembra. Para esta línea celular, haga diluciones 1:10, y las células lograrán la confluencia a las 72 h. Cambie el medio E8 diariamente.
   NOTA: en este protocolo, las diluciones se han ajustado por volumen, no por número de células, para evitar la variabilidad dependiente del usuario. Si el estado de monocapa no se alcanza dentro de las 72 h posteriores al recubrimiento, es muy probable que el proceso de diferenciación no tenga éxito. En tal caso, es aconsejable descartar el intento y reiniciar, asegurando una eficiencia de paso óptima.
2. Cuando las monocapas se estabilizan, comienza el proceso de diferenciación, considerado a partir de ahora como el día 0. A continuación, cambie el medio a medio -INS suplementado con 8 μM de CHIR, el activador de señalización Wnt, e incube la placa durante 24 h a 37 °C (1 mL por pocillo).
   NOTA: Valore la concentración de CHIR entre 6-12 μM para cada línea de iPSC para una inducción eficiente del mesodermo. En este paso, se espera un alto nivel de muerte celular, siendo una señal de un proceso óptimo.
3. Día 1: Al día siguiente, aspire el medio de cada pocillo y lave las células con RPMI sin suplementos (0,5 ml por pocillo). A continuación, añadir 1,5 mL de medio -INS fresco e incubar las células durante 2 días.
   NOTA: Los pasos de lavado se realizan durante todos los cambios de medios para eliminar los desechos, las células muertas y los residuos de suplementos.
4. Día 3: Para inducir la especificación del linaje cardíaco, reemplace el medio con 1,5 mL de medio -INS suplementado con 5 μM de inhibidor de Wnt C59 durante 48 h.
   NOTA: Aquí, se forma el complejo GSK3 y la ß-catenina se degrada, lo que da lugar al linaje mesodérmico cardíaco. También se observa cierta muerte celular después de este paso.
5. Día 5: Lavar y reemplazar con medio -INS fresco durante 48 h a un volumen de 1,5 mL por pocillo, para promover la expansión de los progenitores cardíacos.
6. Día 7: A partir de este día, las células se mantienen en el medio B27, con cambio de medio cada 2-3 días.
   NOTA: Ajuste las cantidades de medio a 2.5 mL por pocillo para omitir el cambio de medio durante el fin de semana, pero solo una vez que se haya alcanzado este estado. Normalmente, las hiPSC-CM comienzan a latir espontáneamente en los días 7-9. Primero, la contracción se observará como grupos aislados y descoordinados, pero en unos pocos días, los cultivos de alta pureza deberían formar una monocapa de batido uniforme.
7. Una vez obtenidas, estas monocapas contráctiles (generalmente en el día 10) se someten a un proceso de selección metabólica que consta de 2 ciclos de 72 h en medio lactato separados por una etapa de resiembra para eliminar las células no cardiomiocitos y enriquecer la pureza del cultivo.
8. Día 10, primer paso de purificación (^1º Lactato): Lavar las células batidoras con medio Lactato (0,5 mL por pocillo) e incubarlas con 1 mL por pocillo de medio Lactato durante 72 h.
   NOTA: El paso de lavado debe realizarse con medio Lactato o con el RPMI 1640 basal sin glucosa para eliminar completamente todos los restos del medio glucosa anterior (B27).
9. Día 13: Lavar y dejar que las células se recuperen de la primera ronda de purificación con 1,5 mL por pocillo de medio B27 durante 2 días.
10. Día 15 (paso de reenchapado): Entre los dos ciclos de purificación, disociar las monocapas lavándolas con EDTA/PBS e incubando con TrypLE durante 10 min a 37 °C (0,5 mL por pocillo).
    NOTA: El tiempo de incubación depende de cada línea celular.
11. Separe las células con una micropipeta de 1000 μL y recupérelas con 0,5 mL por pocillo de medio B27 suplementado con 10% de KSR (v/v) en un tubo de centrífuga estéril.
    NOTA: Los cardiomiocitos son sensibles al esfuerzo cortante y al pipeteo fuerte, así que trate de evitar los pasos repetidos de pipeteo. Otras opciones para una disociación de hiPSC-CM de menor daño podrían ser el uso de TrypLE 10x o colagenasa con DNasa. Optimice el tiempo de incubación para garantizar que sea suficiente para el desprendimiento de células sin causar daño celular ni requerir un pipeteo excesivo, lo que podría comprometer la integridad de las células.
12. Centrifugar 10 min a 100 x g en RT y replatearlos en placas de 12 pocillos recubiertas con MGFr 1:80 con medio de recubrimiento. Siembrórelos en 1 mL por pocillo.
    NOTA: Esto eliminará el exceso de células muertas y la matriz depositada durante la diferenciación, ya que estas pueden tener un impacto negativo en la generación de tejido.
13. Día 16: Después de 24 h de reenchapado, retire Y27 y KSR y mantenga las células en el medio B27 antes del siguiente paso de purificación (generalmente 48-72 h).
14. Día 18: Segunda etapa de purificación (^2º Lactato). Al igual que en el primer ciclo, lavar e incubar las células con medio de lactato durante 72 h (1 mL por pocillo).
    NOTA: Los ciclos de purificación pueden mejorar la pureza del cultivo hasta en un 30%, como se observa en el análisis de citometría de flujo del marcador de cardiomiocitos cTNT (troponina T cardíaca) (no mostrado). Este proceso reduce principalmente los fibroblastos y la contaminación restante por hiPSC. Aunque no se ha determinado el nivel de pureza mínimo aceptable requerido para continuar con la generación de tejido sin comprometer el rendimiento, se recomienda utilizar cultivos con una pureza de al menos 85%-90%. Este nivel de pureza favorece la mejora de la adhesión de los cardiomiocitos, aumenta la resistencia contráctil del tejido final y favorece la reproducibilidad entre experimentos.
15. Día 21: Una vez finalizada la purificación del lactato, mantener los cardiomiocitos purificados en el medio B27 hasta su uso, con cambios frecuentes de medio (cada 2-3 días).
    NOTA: El retraso en el uso disminuirá el rendimiento de las celdas, ya que serán más difíciles de separar. De ahí que sea recomendable utilizarlos entre el día en que se finaliza la segunda purificación de lactato y menos de una semana adicional.

4. Diferenciación de fibroblastos cardíacos humanos

NOTA: Para obtener fibroblastos cardíacos humanos (hiPSC-CFs) a partir de hiPSCs, el siguiente protocolo se basa en la metodología de dos fases utilizada por Zhang et ^al.16. El primer paso es obtener células epicárdicas (hiPSC-EpiCs) mediante la reactivación de la vía de señalización Wnt después de la inducción del mesodermo cardiogénico. A continuación, los hiPSC-EpiCs se exponen a inhibidores del desarrollo vascular y FGF2 para obtener fibroblastos cardíacos en 18 días.

1. Asegure el mantenimiento, la cosecha y la densidad de siembra de hiPSC como se describe en el protocolo de diferenciación de hiPSC-CM. Cultive hiPSCs en placas de 12 pocillos recubiertas de MGFr 1:180 para iniciar la diferenciación.
2. Cuando se logren monocapas compactas de hiPSC (Día 0), agregue medio -INS suplementado con 5 μM de CHIR (1,5 mL por pocillo) durante 48 h.
   NOTA: Valore la concentración de CHIR para cada línea de hiPSC para una inducción eficiente del mesodermo.
3. Día 2: Aspirar y desechar el medio, lavar las celdas con RPMI y reemplazarlo con 1,5 mL de medio -INS fresco durante 24 h.
   NOTA: Al igual que en el protocolo hiPSC-CMs, enjuague las celdas durante cualquier cambio de medio; Dependiendo de cada paso, utilice el medio basal no suplementado correspondiente.
4. Día 3: Incubar las células con medio -INS que contenga 5 μM de C59 (inhibidor de Wnt) durante 48 h (1,5 mL por pocillo).
5. Día 5: Para el replateado de las células mesodérmicas cardíacas, separar las células lavándolas con EDTA/PBS e incubándolas con TrypLE durante 5 min a 37 °C (0,5 mL por pocillo). Recoja las células en 0,5 mL por pocillo de medio basal Advance DMEM (ADMEM) y centrifugue durante 5 min a 300 x g a RT.
6. Siembre en placas de 12 pocillos prerrevestidas con MGFr 1:180 MGFr (1 mL por pocillo) a una densidad de 20.000 células/^cm2. Para el reenchapado, use ADMEM suplementado con 5 μM de CHIR, 2 μM de ácido retinoico, 10% KSR (v/v) y 10 μM de Y27.
7. Día 6: A las 24 h después del reenchapado, refresque el medio para eliminar Y27 y disminuir el KSR al 2%. Mantener las mismas concentraciones de CHIR y ácido retinoico durante 48 h más para lograr el desarrollo de un fenotipo epicárdico.
8. Día 8: Cultivo de células con ADMEM suplementado más 2% de KSR durante 72 h para promover la generación de monocapas epicárdicas.
   NOTA: Las hiPSC-EpiCs parecen ser células grandes planas o de forma cúbica agrupadas en colonias individuales. En este momento, al realizar las primeras rondas de diferenciación, los marcadores típicos de las células epicárdicas como WT1 (antígeno nuclear), ZO1 (antígeno de membrana citoplasmática) y TCF21 (antígeno citoplasmático) podrían analizarse mediante FACS (citometría de células de flujo) o IF (tinción de inmunofluorescencia) (no mostrado).
9. Día 11: Para replantear las células epicárdicas, disociar el lavado de hiPSC-EpiCs con EDTA/PBS e incubar con TrypLE durante 5 min a 37 °C (0,5 mL por pocillo). Recoja las células en medio FGM3 (0,5 mL por pocillo) y centrifugue durante 5 min a 300 x g en RT.
10. Replatee hiPSC-EpiCs en placas de 12 pocillos recubiertas de gelatina al 0,1% a una densidad celular de 10.000 células/^cm2. Utilice el medio FGM3 suplementado con 10 μM de SB (un inhibidor de la señalización de TGFß1 para evitar la transición de miofibroblastos, generalmente durante el cultivo en plástico) y 10 μM de Y27 (solo durante las primeras 24 h).
11. Al día siguiente, refrescar el medio fibroblasto (FGM3 + 10 μM de SB) cada 2 días hasta obtener hiPSC-CFs, haciendo un total de alrededor de 18 días para todo el proceso.
    NOTA: los hiPSC-CF deben presentar una morfología en forma de huso. En este caso, la expresión del marcador de fibroblastos DDR2 debe analizarse mediante técnicas FACS e IF (ver pasos 7.1-7.2).
12. Una vez que el cultivo de hiPSC-CFs es confluente, realice pasajes celulares 1:3 en matraces de gelatina T75 o T175 prerrecubiertos. Las células alcanzan el 90% de confluencia en 4-6 días aproximadamente. Para separar las hiPSC-CF, utilice el protocolo de recolección de TrypLE descrito para el replateado de hiPSC-EpiCs; aquí, no se requiere Y27 para el paso.
13. Mantener las hiPSC-CF en medio FGM3 + 10 μM de SB hasta su uso o congelarlas a paso bajo a una densidad celular de 1-3 millones de células por criotubo.
    NOTA: Se recomienda mantener las hiPSC-CF durante un máximo de 6 pasos antes de descongelar nuevas células, ya que cuando se cultivan en matraces de plástico a largo plazo, las células comienzan a diferenciarse en un fenotipo de miofibroblastos más contráctil.

5. Fabricación de andamios de escritura por electrohilatura fundida (MEW)

NOTA: Este protocolo utiliza homopolímero de poli ε-caprolactona (PCL) de grado médico para imprimir andamios fibrilares, utilizando una impresora MEW especialmente diseñada para este propósito por QUT, Queensland University of Technology¹⁰.

1. Prepare un material de polímero PCL para la impresión. Cargue los gránulos de PCL en una jeringa Luer-lock de plástico de 3 ml unida a una aguja de 23 G y derrítalos a 80 °C durante 2 h en el horno, presionando suavemente el pistón para eliminar las burbujas mientras se funde el polímero. Prepare varias jeringas y guárdelas en RT, ya que el PCL se solidifica rápidamente.
2. El día de la impresión, introduzca la jeringa dentro de la cámara de calentamiento y conéctela a una tubería de suministro N₂ presurizada. Encienda el equipo MEW, ajuste los reguladores de temperatura a 80/65 °C (cámara/boquilla) y mantenga la jeringa durante 30 minutos para garantizar la fusión adecuada del polímero.
3. Debajo de la jeringa, se encuentra la placa colectora, motorizada y móvil en las direcciones XY mediante un software compatible (Mach3). Mueva la placa colectora (control de cursores de computadora) hasta que el cabezal de impresión se coloque en un borde de la placa o en cualquier ubicación deseada, y ajuste la distancia entre la cámara de calentamiento y la placa colectora (distancia del colector) manualmente a 10 mm (plano Z).
   NOTA: Esta distancia debe probarse experimentalmente para alcanzar un diámetro de fibra determinado. Cuanto más corta sea la distancia del colector, más gruesa será la fibra y viceversa.
4. Cierre la puerta del equipo, que conecta automáticamente el suministro de campo eléctrico. Ajuste el voltaje a 7 kV y la presión N₂ a 2 bares para que pueda extruir a través de la punta de 23 G al imprimir.
   NOTA: Al suministrar un alto voltaje, se crea una diferencia de potencial entre la punta de la jeringa y la placa colectora (hecha de acero inoxidable). Luego, la gota acumulada en la boquilla por la presión suministrada se carga electrostáticamente, generando el cono de Taylor, que se dirige hacia la placa colectora. El voltaje y la presión se pueden ajustar para modificar las dimensiones finales de la fibra. Los parámetros de alta presión extruirán fibras más gruesas, lo que requerirá un mayor voltaje para estabilizar la fibra. El software se basa en el control numérico por computadora (CNC), por lo que las geometrías del andamio se escriben como un código G y se alimentan al programa, que controla el movimiento X-Y y la velocidad del motor de la placa del colector. Por lo tanto, antes de imprimir los andamios definitivos, se recomienda imprimir cualquier código G como paso previo para obtener un chorro estable que construya fibras definidas sin ningún aspecto de enrollamiento o latigazo. Para ello, optimice los parámetros mediante pequeños cambios cada vez, es decir, 0,1 bar para la presión del aire, 0,1 kV para la tensión y 60-100 mm/min para la velocidad del colector; esto asegurará un comportamiento de cono de Taylor del chorro.
5. Seleccione el código G diseñado en el software para imprimir andamios con una geometría de patrón cuadrado. Este código G de ejemplo imprime mallas cuadradas de 15 capas de 6 cm x 6 cm con poros de forma cuadrada de 0,5 mm x 0,5 mm.
6. Para imprimir fibras depositadas con precisión (es decir, fibras superpuestas), ajuste la velocidad del colector a 1080 mm/min.
   NOTA: Ajuste los parámetros de voltaje, presión, velocidad del colector y distancia del colector en cada equipo MEW para definir diámetros de fibra precisos (μm). Más allá de la influencia de los parámetros mencionados anteriormente, el aumento de la velocidad del colector da como resultado fibras más delgadas, mientras que la disminución produce fibras más gruesas. La configuración de parámetros en este protocolo permite la impresión de fibras con diámetros de 10-15 micras.
7. Presione el botón START en el software para comenzar a imprimir. Retire con cuidado el andamio del colector una vez finalizada la impresión.
   NOTA: Para facilitar el manejo del andamio después de la impresión, se recomienda imprimirlo en una pieza de vidrio más grande que el andamio, asegurada a la base del colector con cinta adhesiva.
8. Corta la malla impresa con un punzón de 6 mm de diámetro para obtener los andamios finales para la fabricación de tejidos.
9. Como las mallas de PCL son altamente hidrofóbicas, trátelas durante 5 minutos con plasma de_O2/Argón para aumentar su hidrofilicidad y promover la interacción con la fibrina y las células.
   NOTA: Opcionalmente, un tratamiento de 0,1 N de NaOH durante 15 min, seguido de lavados extensos de PBS, también funciona.
10. Esterilizar las mallas por inmersión en etanol al 70% durante 30 min, lavar abundantemente con agua destilada estéril durante 30 min, y dejar secar.
    NOTA: Realice este proceso en una placa de Petri estéril y dentro de una capucha estéril. No seque completamente las mallas hasta que se utilicen para evitar su adherencia a la placa y la consiguiente deformación.

6. Generación y mantenimiento de minitejidos de fibrina

NOTA: La generación de minitejidos miocárdicos humanos en 3D se basa en la encapsulación de células cardíacas derivadas de hiPSC dentro de hidrogeles de fibrina combinados con andamios MEW que proporcionan soporte fibrilar. El siguiente protocolo ha sido adaptado de los enfoques de diseño de ingeniería utilizados por Breckwoldt et ^al.17 y Ronaldson-Bouchard et ^al.18.

1. Separe hiPSC-CM como se describe anteriormente en el paso de replateado (3.10-3.11) del protocolo de diferenciación de hiPSC-CM (recolección de TrypLE). Vuelva a suspender el pellet de células en el medio de generación de tejidos para contar las células en la cámara de Neubauer.
2. Separe los hiPSC-CF como en el paso de recolección de hiPSC-CM con TrypLE. Utilice 3 mL de TrypLE para los matraces T75, 5 mL para los matraces T175 y el mismo volumen para inactivar la incubación de TrypLE. Finalmente resuspender el pellet celular en el Medio de Generación de Tejidos, al igual que para los CMs, ya que van a ser mezclados y cultivados en el mismo medio.
3. Cuente las celdas en una cámara de Neubauer. Calcula el número total exacto de células necesarias para sembrar todos los tejidos.
   NOTA: Este protocolo emplea 1 millón de células por tejido, que consta de un 80% de CM y un 20% de CF, es decir, 800.000 CM y 200.000 CF. Otras cantidades, como totales de 1,5 y 3 millones por tejido, también se pueden lograr con la práctica.
4. Mezcle y pegue las celdas totales necesarias en un tubo nuevo (Cell Mix), 5 min a 300 x g en RT. Asegúrese de que el pellet esté completamente seco y manténgalo en hielo hasta la siembra. Calcule el volumen total de hidrogel requerido para sembrar todos los tejidos.
   NOTA: Este protocolo requiere 35 μL por tejido (para un tamaño de andamio de 6 mm de diámetro) hasta una densidad final cercana a los 30 millones de células/mL, pero se puede aumentar, como ya se mencionó en el paso 6.4 anterior. Cada hidrogel de fibrina consta de 6 mg/mL de fibrinógeno más 5 U/mL de trombina junto con el Medio de Generación de Tejidos, en el que se resuspenden las células. Para un hidrogel de 35 μL, la relación fibrinógeno/trombina es de 1,05 μL/1,8 μL. Se recomienda un 10% más de volumen final de hidrogel para evitar la pérdida de volumen debido a errores de pipeteo. Ejemplo: para 10 tejidos, resuspender las células en 350 μL + 10%, es decir, 385 μL como volumen final total.
5. Vuelva a suspender la mezcla celular en el volumen requerido del medio de generación de tejidos. Mezclar con cuidado, evitando la formación de burbujas.
   NOTA: Para 10 tejidos, resuspender 10 millones de células (80 CMs:20 CFs) en 374,5 μL de Medio de Generación de Tejidos (volumen total de hidrogeles menos la cantidad total de fibrinógeno requerida para los tejidos totales, es decir, 10,5 μL).
6. Agregue el volumen requerido de fibrinógeno y mezcle con cuidado. Para 10 tejidos, agregue 10,5 μL de fibrinógeno a la mezcla de células, generando la mezcla de hidrogel. Manténgalo en RT.
   NOTA: Es esencial evitar el pipeteo excesivamente repetido para que las fuerzas de cizallamiento no afecten a la viabilidad de los hiPSC-CM. Se recomienda cortar un trozo de la punta de la pipeta con un bisturí estéril y luego volver a suspender la mezcla de hidrogel con él para reducir el daño por cizallamiento.
7. Para evitar la adhesión de la fibrina a la placa, siembre la mezcla de hidrogel en una superficie de politetrafluoroetileno (PTFE). Pipetear la mitad del volumen de un pañuelo (17,5 μL), que quedará en forma de gota, y hacerlo para el número total de tejidos.
   NOTA: No haga más de 10 pañuelos a la vez, ya que pueden secarse.
8. Coloque un andamio PCL encima de cada gota y agregue el volumen restante (17,5 μL). Asegúrese de que el andamio esté completamente sumergido.
   NOTA: Esté preparado para pipetear con ambas manos, ya que la reacción es muy rápida. Un pañuelo a la vez.
9. Añada la cantidad necesaria de trombina (1,8 μL) con la mano no dominante y mezcle rápidamente el hidrogel con la mano dominante (pipeteando al menos 2-3 veces).
   NOTA: Mezclar preferiblemente pipeteando menos del volumen total, para evitar la formación de burbujas (30 μL). Si se forma una burbuja de aire, pínchela rápidamente con una aguja.
10. Repite el paso anterior para cada pañuelo.
    NOTA: Es recomendable practicar esta técnica sin células hasta asegurar una buena manipulación.
11. Incubar los tejidos a 37 °C durante 1 h para completar la polimerización de la fibrina.
12. Tome suavemente cada tejido por el borde con pinzas estériles y colóquelos en placas de 12 pocillos con 2 mL por pocillo del medio de generación de tejidos suplementado con 33 μg/mL de aprotinina. Coloque un pañuelo por pocillo.
    NOTA: No los recoja por el centro del hidrogel para que las células puedan dañarse por la fuerza mecánica. Si es necesario, use una espátula.
13. Incubar los tejidos durante 24 h a 37 °C.
    NOTA: Es fundamental mantener la aprotinina en el medio de cultivo de tejidos desde el día de la generación, ya que se ha observado que omitir la aprotinina durante las primeras 24 h, aunque se añada más tarde, provoca un desprendimiento parcial de las células de la malla y el hidrogel. Esto compromete la cobertura celular completa necesaria para la integridad del tejido final.
14. Al día siguiente, refresque el medio con 2 mL del medio de mantenimiento de tejidos, eliminando los residuos de KSR e Y27. Cambia el medio cada dos días a partir de ahí.

7. Análisis sistemático del potencial de diferenciación cardíaca de la función hiPSC y minitisular

1. Análisis de citometría de flujo
   NOTA: Las células se analizan utilizando la modalidad de citometría "Clasificación celular activada por fluorescencia" (FACS) para determinar la eficiencia de la diferenciación de hiPSC. Todos los pasos se realizan en condiciones de temperatura ambiente.
   1. Disociar los cultivos celulares en suspensión unicelular (recolección de TrypLE), tanto los hiPSC-CM como los CF por separado.
   2. Vuelva a suspender el pellet a 250.000 células/mL en tampón FACS y dispense al menos 1 mL por tubo. Incubar durante 30 minutos para evitar la unión de anticuerpos inespecíficos.
   3. Centrifugar las células a 300 x g en RT durante 5 min y desechar el sobrenadante.
      NOTA: Todos los pasos de centrifugación se realizan en estas condiciones.
   4. Para detectar antígenos intracelulares, fije y permeabilice las membranas celulares con un kit de permeabilización celular. En primer lugar, incubar las células con Reactive A (Fix) durante 30 min y centrifugar (como en el paso 7.1.3).
   5. A continuación, incube las células con B reactivo (Perm) más el anticuerpo primario durante 30 minutos. Utilice 100 μL de reactivo por tubo.
      1. En el caso de las células fluorescentes agudas, utilice el anticuerpo cTNT de ratón (troponina T cardíaca, marcador de MC) con una dilución de 1/200. En el caso de las hiPSC-CF, utilice un anticuerpo DDR2 de ratón (receptor de colágeno, marcador de FQ) con una dilución de 1/500.
         NOTA: Para detener todas las reacciones, agregue 1 mL de tampón FACS a cada tubo antes de la centrifugación.
   6. Incubar durante 15 min con el anticuerpo secundario Alexa-Fluor 488 anti-ratón diluido 1/100 en tampón FACS.
   7. Lavar 3 veces con PBS, centrifugando entre lavados (siguiendo las mismas condiciones que en el paso 7.1.3), y finalmente resuspender el pellet celular en 400 μL de PBS. Analizar en un citómetro o un dispositivo similar.
2. Análisis de tinción de inmunofluorescencia (IF)
   1. Para cultivos de células cardíacas en 2D, siembre ambos tipos de células por separado en un sistema de pocillo de cámara de cultivo prerrecubierto con portaobjetos de gelatina 1:80 MGFr o 0,1%. Placa de aproximadamente 80.000 células/^cm2 para alcanzar una confluencia de células suficiente para el análisis. En el caso de los mini pañuelos 3D, transfiéralos suavemente con pinzas a un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
   2. Deseche el medio celular y lave las células o tejidos con PBS dos veces. Fijar las muestras con formalina al 10% (v/v) en RT; 15 min para la cámara de portaobjetos y 1 h para los mini pañuelos.
      PRECAUCIÓN: La formalina es peligrosa si se inhala y debe manipularse en una campana extractora.
   3. Deseche el tampón de fijación y lave 5 min con PBS tres veces. Almacene las muestras a 4 °C en PBS hasta su uso.
   4. Para permeabilizar la membrana celular, incubar las células con Triton X-100 (v/v) al 0,1% durante 10 min o tejidos 3D con Tween-20 al 1% durante 15 min a RT. Luego, lave 5 min con PBS tres veces.
   5. Para reducir las uniones de anticuerpos inespecíficos, tratar las muestras con una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 3% (v/v) durante 30 min en RT.
   6. Prepare soluciones primarias de anticuerpos en PBS más 1% de BSA para bloquear uniones no específicas e incubarlas durante la noche a 4 °C.
      1. En el caso de las hiPSC-CM 2D, utilice una dilución de 1/400 del anticuerpo anticardíaco α-ACTN (actinina sarcomérica) para ratones. En el caso de las hiPSC-CF 2D, utilice una dilución de 1/500 del anticuerpo anti-DDR2 en ratones. En el caso de los tejidos 3D, combine los dos anticuerpos específicos de CM y CF.
   7. Al día siguiente, aspire la solución de anticuerpos y realice 3 lavados con PBS a RT, de 5 min cada uno.
   8. Diluir los anticuerpos secundarios (Alexa-Fluor 488 y Alexa-Fluor 594) a 1/200 e incubar durante 1 h en RT en la oscuridad para identificar los anticuerpos primarios de ratón y conejo, respectivamente. Repita el lavado de PBS tres veces.
   9. Para contrarrestar la tinción de los núcleos, incubar las muestras con una dilución de 1/500 de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 20 min a RT en la oscuridad. Repita el lavado con PBS tres veces y almacene las muestras a 4 °C en PBS.
   10. Examine las muestras con un microscopio confocal, adquiera imágenes y procéselas con un software adecuado, como Fiji.
   11. En el caso de los mini pañuelos 3D, transfiéralos cuidadosamente con PBS entre dos cubreobjetos de vidrio para permitir una buena imagen.
       NOTA: Se recomienda un objetivo de inmersión en aceite de 40x o superior para obtener imágenes de pila Z a alta resolución.
3. Análisis de viabilidad celular
   NOTA: El ensayo Alamar Blue (AB) se utiliza para medir la actividad metabólica celular, que está directamente relacionada con la viabilidad celular en mini tejidos cardíacos 3D. Realice todo el proceso protegiendo las muestras de la luz y en condiciones estériles.
   1. Prepare una solución AB al 10% (v/v) en medio RPMI 1640 sin rojo fenol (ya que podría interferir con la medición colorimétrica).
   2. Transfiera con cuidado los minitejidos cardíacos a una placa de 48 pocillos con pinzas estériles. Incubar las construcciones con 300 μL de solución AB por tejido durante 1 h 30 min (tiempo de ajuste experimental) a 37 °C.
      NOTA: A medida que las células reducen la resazurina a través de la acción de las enzimas metabólicas, se generará un cambio de color en el medio de cultivo, que se medirá por espectrofotometría a 570 nm y 600 nm.
   3. Para la medición, recoja 100 μL por tejido de la solución AB metabolizada en una placa de 96 pocillos y lea las absorbancias.
      NOTA: Las muestras se pueden cultivar después de este análisis cambiando el medio a Medio de mantenimiento de tejido una vez más.
4. Análisis de contracción
   NOTA: Los minitejidos cardíacos comienzan a latir espontáneamente, generalmente 1-2 días después de la generación del tejido.
   1. Mida manualmente la frecuencia de batido observando los tejidos bajo el microscopio óptico (latidos/min). Si se miden muchos pañuelos al mismo tiempo, mantenga las placas calientes antes de cada lectura.
      NOTA: A medida que disminuye la temperatura, la tasa de batido también comienza a disminuir.
   2. Para una evaluación prolongada de la contractilidad cardíaca, obtenga videos de microscopía óptica de los tejidos latidos. A 4x para capturar un plano más grande o a 10x desde diferentes áreas de tejido. Graba alrededor de 30 s por video (al menos 3 tiempos).
   3. Utilice una velocidad de fotogramas de al menos 30 fotogramas por segundo y guarde el vídeo en formato .AVI.
      NOTA: Aquí, los vídeos se han analizado con un algoritmo de puntos de seguimiento personalizado desarrollado para MATLAB¹⁰. Con este método, se puede obtener la velocidad de contracción, el desplazamiento máximo de contracción (amplitud) y la dirección de contracción para cada video.
   4. Ejecute directamente el algoritmo en MATLAB para los vídeos contenidos en la carpeta de análisis. Proporcionará automáticamente un documento de Excel de resultados con los valores de velocidad de contracción por fotograma, amplitud de contracción por fotograma, ángulo de contracción (dirección) y sus respectivas desviaciones estándar¹⁰.
   5. Multiplique "Velocidad de contracción por fotograma" por la resolución de la cámara (μm/píxel) y por la velocidad de fotogramas de la cámara (fotogramas/s). Esto dará el valor final de la velocidad de contracción (μm/s).
   6. Multiplique 'Amplitud de contracción por fotograma' por la resolución de la cámara (μm/píxel), y esto dará el valor final de la amplitud de contracción (μm).
      NOTA: Sería posible analizar la cinética de contracción con más profundidad utilizando un software como MUSCLEMOTION, como se discutió en otro lugar ^19,20. La configuración de imágenes debe capturar al menos 60 fotogramas/s para su análisis con el software.

Resultados

Caracterización de células cardíacas derivadas de hiPSC 2D
Con el fin de generar tejidos cardíacos multifenotípicos, las hiPSC-CM y las hiPSC-CF se diferencian y caracterizan in vitro de forma independiente. Con la optimización adecuada y un mantenimiento estricto, el siguiente protocolo dará como resultado un rendimiento de hiPSC-CMs de más del 80% alrededor del día 9 de diferenciación, dando lugar a células batientes espontáneas (

Discusión

Para generar un modelo de minitejido cardíaco compuesto en 3D que replique las características nativas del miocardio humano, se deben tener en cuenta varios factores esenciales. Estos se pueden agrupar en tres puntos principales: (1) optimizar el rendimiento y la pureza de las células para la fabricación de tejidos, (2) imprimir el andamio fibrilar para imitar el mecanoentorno 3D y (3) integrar el hidrogel de fibrina en el proceso de fabricación.

Algunos ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide 8 Well chamber coverslip (IbiTreat)	IBIDI	80826
0.1% Gelatin Solution (Embryomax)	Merck Millipore	ES-006-B
10% formalin	Sigma Aldrich	HT501128
12-well plates	Costar/Corning	3513
6-well plates	Costar/Corning	3506
Advanced DMEM 1x (ADMEM)	Gibco	12491015
Aprotinin from bovine lung	Sigma Aldrich	A1153
B-27 SUPLEMENT, PLUS INSULIN (50x)	Life Technologies	A317504044
B27 SUPPLEMENT, MINUS INSULIN (50x)	Life Technologies	A1895601
Biopsy punch (6mm diameter)	Medical	BP-60F
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A9647
CHIR-99021	AXON MEDCHEM	AXON1386
Confocal Laser Scanning Microscope	Zeiss	LSM 800
Culture flask 175 cm	Greiner Bio-One	660175
Culture flask 75 cm	Falcon	353136
Cytometer	Beckman Coulter	CytoFlex
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21202
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-21207
DPBS (Mg2+, Ca2+ free)	Gibco	A314190094
EDTA 0.5M pH 8.0	Life Technologies	AM9260G
ESSENTIAL 8 MEDIUM KIT	Life Technologies	A1517001
FGF2 (Recombinant Human FGF-basic 154 a.a.)	Peprotech	100-18B
Fibrinogen from bovine plasma	Sigma Aldrich	F8630
Fibroblast Growth Medium 3 KIT (FGM3)	PromoCell	C-23130
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828028
Lactate (Sodium L-lactate)	Sigma Aldrich	71718
Matrigel Growth Factor Reduced (MGFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354230
MEW 23-G needle	Nordson	7018302
MEW printer	QUT, Queensland University of Technology
MEW syringe	Nordson	7012072
Mouse Anti-Cardiac Troponin T Monoclonal Antibody	Invitrogen	MA5-12960
Mouse Anti-DDR2 monoclonal antibody	Sigma Aldrich	SAB5300116
Mouse Anti-α-actinin (sarcomeric) Monoclonal Antibody	Sigma Aldrich	A7811
PENICILLIN - STREPTOMYCIN	Life Technologies	15140122
Poly ε-caprolactone (PCL), medical grade	Corbion	PURASORB® PC 12
Rabbit Anti-Vimentin Recombinant Monoclonal Antibody [EPR3776] - Cytoskeleton Marker	Abcam	Ab29547
Retinoic Acid	Sigma Aldrich	R2625
ROCK inhibitor Y-27632 (10mg)	Fisher Scientific	HB2297
RPMI 1640 (L-glutamine)	Gibco	21875034
RPMI 1640 (no phenol red)	Gibco	32404014
RPMI no glucose	Gibco	11879020
SB431542	SELLECK CHEMICALS	S1067
Spectrophotometer	BMG Labtech	SPECTROstar Nano
Thrombin (human alpha thrombin, Factor IIa)	Enzyme Research Lab	HT 1002a
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
TrypLE Express	Life Technologies	12604021
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287
Wnt-C59	AXON MEDCHEM	AXON2287