Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

التجميع في الجسم الحي هو طريقة استنساخ مستقلة عن الربط تعتمد على إنزيمات إصلاح الحمض النووي الجوهرية في البكتيريا لتجميع شظايا الحمض النووي عن طريق إعادة التركيب المتماثل. هذا البروتوكول فعال من حيث الوقت والتكلفة ، حيث يلزم وجود عدد قليل من الكواشف ، ويمكن أن تصل كفاءة الاستنساخ إلى 99٪.

Abstract

التجميع في الجسم الحي (IVA) هي طريقة استنساخ جزيئي تستخدم الإنزيمات الجوهرية الموجودة في البكتيريا التي تعزز إعادة التركيب بين الجزيئات لشظايا الحمض النووي لتجميع البلازميدات. تعمل هذه الطريقة عن طريق تحويل شظايا الحمض النووي بمناطق من 15-50 نقطة أساس من التماثل إلى سلالات الإشريكية القولونية المختبرية شائعة الاستخدام وتستخدم البكتيريا مسار الإصلاح المستقل عن RecA لتجميع شظايا الحمض النووي في بلازميد. هذه الطريقة أكثر سرعة وفعالية من حيث التكلفة من العديد من طرق الاستنساخ الجزيئي التي تعتمد على التجميع المختبري للبلازميدات قبل التحول إلى سلالات الإشريكية القولونية. وذلك لأن الطرق في المختبر تتطلب شراء إنزيمات متخصصة وأداء تفاعلات إنزيمية متسلسلة تتطلب حضانات. ومع ذلك ، على عكس الطرق المختبرية ، لم يثبت تجريبيا أن IVA يقوم بتجميع البلازميدات الخطية. هنا نشارك بروتوكول IVA الذي يستخدمه مختبرنا لتجميع البلازميدات بسرعة واستنساخ شظايا الحمض النووي بين البلازميدات ذات الأصول المختلفة للنسخ المتماثل وعلامات مقاومة المضادات الحيوية.

Introduction

يشمل الاستنساخ الجزيئي سلسلة من التقنيات المختبرية اللازمة لإنتاج البلازميدات التي تحتوي على حمض نووي مؤتلفمحدد 1. غالبا ما تعمل هذه التقنيات المنتشرة في كل مكان كعنق زجاجة في سير العمل التجريبي2. تعتمد العديد من تقنيات الاستنساخ الجزيئي على تجميع شظايا الحمض النووي في المختبر باستخدام سلسلة من التفاعلات الأنزيمية قبل التحول إلى سلالة مضيفة (على سبيل المثال ، الإشريكية القولونية DH5a) للتضخيم3،4،5،6،7. كما هو الحال في المختبر تعتمد طرق تجميع البلازميد على الإنزيمات ، يمكن أن يكون شراء الإنزيمات أو تنقيتها مكلفا ويستغرق وقتا طويلا.

التجميع في الجسم الحي (IVA) هي طريقة استنساخ جزيئي تعتمد على إعادة التركيب بين الجزيئات لشظايا الحمض النووي في مضيف مناسب8،9،10،11،12. كان أساس هذه الطريقة هو الملاحظة القائلة بأن سلالات استنساخ recA شائعة الاستخدام من بكتريا قولونية يمكن أن تتوسط إعادة التركيب بين الجزيئات لبرايمر أحادي الشريطة مع بلازميد مشقوق بواسطة إنزيمات التقييد13. تم وصف استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتوليد نهايات الحمض النووي المتماثلة لتجميع البلازميد في بكتريا قولونية في التسعينيات وسميت هذه الطريقة بإعادة التركيب PCR3،14. تم الإبلاغ عن كفاءة إعادة التركيب PCR بحوالي 50٪ 14. ومع ذلك ، لم يتم اعتماد هذه الطريقة على نطاق واسع ، على الأرجح بسبب التكلفة العالية للبادئات وخطر إدخال طفرات غير مرغوب فيها باستخدام بوليميرات منخفضة الدقة لتضخيم شظايا الحمض النووي الكبيرة. كانت هذه العيوب كبيرة في التسعينيات ويمكن تجنبها باستخدام طرق الاستنساخ في المختبر مثل الاستنساخ بوساطة إنزيم التقييد.

في السنوات الأخيرة ، انخفضت تكلفة البادئات ، وزادت البوليميرات التجارية الجديدة من دقة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). نتيجة لذلك ، تمت إعادة النظر في تفاعل البوليميراز المتسلسل لإعادة التركيب كتقنية استنساخ جزيئي سريعة وفعالة من حيث التكلفة وأعيد تسميتها باسم IVA2،9،15،16. مع زيادة الجدوى ، تم استكشاف IVA بشكل أكبر ، وتم تحسين الطريقة للوصول إلى كفاءات استنساخ تصل إلى 99٪ 16. حددت التحسينات ميزات الحمض النووي المتماثل ، مثل عدد أزواج القواعد ودرجة حرارة الانصهار ، والتي تزيد من كفاءة إعادة التركيب في الجسم الحي 2،16. أظهر مزيد من التحليل أنه يمكن تجميع ما يصل إلى 6 شظايا من الحمض النووي تتراوح من 150 نقطة أساس إلى 7 كيلو بايت بكفاءة بواسطة IVA15. بالإضافة إلى ذلك ، استخدمت مجموعتنا مؤخرا IVA لتجميع سلسلة بلازميد مع أشرطة مقاومة مختلفة للمضادات الحيوية وأصول النسخالمتماثل 17. في هذه الدراسة ، كان استنساخ IVA عالي الكفاءة (71-100٪) مع اختبار عدد قليل من المستنسخة لكل بلازميد (ن = 2) 17. نصف هنا بروتوكول IVA الذي يستخدمه مختبرنا.

Protocol

1. تصميم الاشعال أو شظايا الحمض النووي ذات النهايات المتجانسة

  1. استخدم برنامج معالجة النصوص أو برنامج تحليل الحمض النووي المتخصص لتجميع البلازميد المطلوب بشكل مصطنع.
    ملاحظة: غالبا ما يكون من المفيد ترميز أجزاء الحمض النووي بالألوان من مصادر مختلفة وتسليط الضوء على المناطق المتجانسة التي سيتم استخدامها في خطوات التجميع النهائية. بالإضافة إلى ذلك ، من المفيد أيضا ترميز الحمض النووي المتماثل بالألوان لضمان التجميع الاتجاهي.
  2. صمم بادئات ترتبط بكل جزء من الحمض النووي وتحتوي على 15-50 نقطة أساس من تسلسل الحمض النووي المتماثل (الشكل 1) 2،15.
    1. لزيادة كفاءة IVA ، تأكد من أن شظايا الحمض النووي المتماثلة لها درجات حرارة انصهار تتراوح من 47 إلى 52 درجة مئوية2.
      ملاحظة: يمكن تحديد درجة حرارة الانصهار باستخدام البرنامج عبر الإنترنت18 أو الصيغة: درجة حرارة الانصهار = 64.9 + 41 * (nG + nC - 16.4) / (nA + nT + nG + nC) ، حيث n = عدد G أو C أو A أو T في التسلسل6،19.
    2. تجنب البادئات ذات التسلسلات المتكررة للغاية مثل CATCATCATCATCATCAT التي تشفر لعلامة HIS لأنها يمكن أن تسبب عدم الاستقرار20. إذا كانت هناك حاجة إلى تسلسل نهائي للأحماض الأمينية المتكررة لتطبيقات مثل إدخال علامة poly-HIS ، فاستخدم أكواد بديلة مثل CATCACCATCATCACCAC لتقليل تكرار تسلسل الحمض النووي.
      ملاحظة: يمكن طلب الاشعال من أي بائع مفضل. إذا كان سيتم تصنيع شظايا الحمض النووي ، فيجب دمج النهايات المتجانسة في جزء الحمض النووي المركب.

2. تضخيم منتجات الحمض النووي التي تحتوي على نهايات متجانسة

  1. عزل الحمض النووي البلازميد أو قوالب الحمض النووي الجيني باستخدام مجموعات عزل الحمض النووي القياسية المتوفرة تجاريا أو التحلل القلوي6،17.
  2. استخدم قالب الحمض النووي (من الخطوة 2.1) والبادئات التي تحتوي على مناطق متجانسة (الخطوة 1.2) في تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل مع بوليميراز عالي الدقة متاح تجاريا. للحد من ترحيل قالب الحمض النووي في التفاعلات النهائية ، استخدم كمية منخفضة من قالب الحمض النووي (20 pg-1 ng) في كل تفاعل. راجع توصيات الشركة المصنعة لمكونات خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاصة بالإنزيم وشروط دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل الموصى بها. تابع تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
    1. قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (50 ميكرولتر) لتضخيم شظايا الحمض النووي الموضحة في الشكل 2 لتحتوي على 100 ميكرومتر من dNTPs ، و 0.2 ميكرومتر من كل برايمر DNA ، وقالب الحمض النووي (50 بيكوغرام من pSU19 و 1 نانوغرام من pSU18mCherry) ، 1x خليط عازل لتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR يحتوي على Mg2+ (التركيز النهائي 2 ملليمتر) ، و 1 U من بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة.
    2. استخدم برنامج ركوب الدراجات PCR لتضخيم pSU19 و mCherry (الشكل 2). اضبط خطوة التمسخ الأولية على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، متبوعة ب 10 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 55 درجة مئوية -0.5 درجة مئوية لكل دورة لمدة 15 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، ثم 20 دورة إضافية من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 50 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. أكمل دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل بخطوة تمديد نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: إذا كان سيتم تضخيم العمود الفقري للبلازميد ، فاضبط كمية قالب الحمض النووي بناء على الوزن الجزيئي: مع ~ 20 بيكوغرام / 1 كيلو بايت من الحمض النووي البلازميد لكل 50 ميكرولتر من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (50 بيكوغرام من الحمض النووي ل pSU19 (كما هو موضح)). بالإضافة إلى ذلك ، اضبط دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتقليل عدد الطفرات التي يتم إدخالها أثناء التضخيم: لتضخيم العمود الفقري للبلازميد ، يكفي ما لا يقل عن 20-25 دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل .
  3. بمجرد اكتمال تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإزالة كمية (2 ميكرولتر) من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ودمجها مع صبغة التحميل (إلى تركيز 1x) ، وافصل شظايا الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز21. استخدم الأشعة فوق البنفسجية (UV) أو مصباح LED لتصور شظايا الحمض النووي التي هاجرت في هلام الاغاروز. حدد ما إذا كانت منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل فريدة من نوعها وقارن المنتجات بسلم الحمض النووي للتحقق مما إذا كانت الوزن الجزيئي المتوقع (الشكل 2). إذا لم يتم تصور أي منتجات PCR بالوزن الجزيئي الصحيح ، فراجع توصيات الشركة المصنعة لتحسين تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
    ملاحظة: عندما لا تكون منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل فريدة من نوعها ولكن هناك جزء وفير من الحمض النووي يتوافق مع الوزن الجزيئي المتوقع ، يمكن تجنب تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الإضافي.
  4. إذا كانت هناك العديد من شظايا الحمض النووي الموجودة في هلام الاغاروز ، فقم باستئصال جزء الحمض النووي المقابل للوزن الجزيئي المتوقع من هلام الاغاروز واستخدم مجموعة استخراج هلام الاغاروز لاستعادة جزء الحمض النووي.
  5. لإزالة الحمض النووي الميثيلي للقالب من تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أضف 1 ميكرولتر من DpnI مباشرة إلى أنبوب التفاعل. احتضان التفاعلات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى ليلة وضحاها.
    ملاحظة: يوصى بشدة بهذه الخطوة الاختيارية للحد من كمية الحمض النووي للقالب الذي يتم ترحيله في التفاعلات النهائية. ومع ذلك ، يمكن تخطي هذه الخطوة إذا تم استخدام تركيزات منخفضة جدا من قالب الحمض النووي في تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
  6. استخدم مجموعة تنقية الحمض النووي لإزالة الإنزيمات المتبقية والأملاح وثنائيات التمهيدي وغيرها من منتجات الحمض النووي الجزيئي المنخفضة غير المرغوب فيها الناتجة عن المقايسات الأنزيمية.
    ملاحظة: يمكن تخطي الخطوات 2.1-2.6 إذا تم تصنيع شظايا الحمض النووي.
  7. حدد تركيز الحمض النووي لشظايا الحمض النووي المنقى عن طريق قياس الطيف الضوئي أو تقدير الهلام.

3. IVA (الشكل 3)

  1. احسب كمية الحمض النووي المطلوبة لكل تفاعل IVA (يوصى باستخدام 25-50 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد). استخدم كميات أعلى من الحمض النووي البلازميد للبلازميدات ذات الوزن الجزيئي الأعلى (على سبيل المثال ، بالنسبة للبلازميدات التي تبلغ 2.3 كيلو بايت في الثانية ، استخدم 25 نانوغرام من البلازميد ، ولكن عندما تكون البلازميدات 9 كيلو بايت ، استخدم 50 نانوغرام في كل تفاعل). احسب حجم إدخال الحمض النووي اللازم للتفاعل ؛ استخدم نسبة مولارية 1: 3 أو 1: 5 من البلازميد: أدخل الحمض النووي.
    ملاحظة: يمكن استخدام الآلات الحاسبة الحيوية عبر الإنترنت أو الصيغ الواردة أدناه لحساب الكمية المولية لجزء من الحمض النووي مزدوج الشريطة وتحديد النسبة المولية لكل جزء من الحمض النووي.
    نستخدم الصيغة التالية لحساب الكمية المولية لجزء الحمض النووي مزدوج الشريطة: pmol = (الوزن بالنانوغرام) × 1,000 / (أزواج القواعد × 650 دالتون). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن حساب النسب المولية من خلال: إدراج الكتلة (g) = نسبة الإدخال / البلازميد المطلوبة × كتلة البلازميد (g) × نسبة الإدخال إلى أطوال البلازميد6.
  2. اجمع بين الحجم المحسوب للبلازميد وأدخل الحمض النووي في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل مبرد مسبقا واستمر في وضع الثلج.
  3. نقل البلازميد وإدخال خليط الحمض النووي من الخطوة 3.2 إلى حصة (25-100 ميكرولتر) من الإشريكية القولونية المذابة الكفاءة كيميائيا (على سبيل المثال الإشريكية القولونية DH5a ؛22).
    ملاحظة: يعتمد حجم الخلايا المختصة المستخدمة على حجم البلازميد وإدخال خليط الحمض النووي. يجب ألا يتجاوز هذا الخليط 10٪ من حجم الخلايا المختصة.
  4. المضي قدما في تحويل الصدمة الحرارية23.
    1. احتضان خليط الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا والحمض النووي على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    2. انقله إلى حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، ثم انقل الأنبوب إلى الثلج لمدة دقيقتين.
    3. انقل LB بشكل معقم إلى الأنبوب لتكوين الحجم إلى 1 مل.
    4. انقل حجم 1 مل إلى أنبوب زراعة زجاجي وضعه في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية ، 220 دورة في الدقيقة أو درجة الحرارة الموصى بها لاستعادة السلالة البكتيرية و / أو البلازميد (النطاق النموذجي من 25 درجة مئوية إلى 37 درجة مئوية) والسماح بإنتاج علامة اختيار المضادات الحيوية المشفرة بالبلازميد.
  5. بعد أن تتعافى الخلايا لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة ، قم بإيداع كمية (100 ميكرولتر من 1,000 ميكرولتر) من تفاعل التحويل على وسائط الانتقاء الصلبة واستخدم موزعا للخلايا المعقمة لتفريق الكمية عبر لوحة ثقافة الأجار. اجمع باقي الخلايا المحولة عن طريق الطرد المركزي (13,000 × جم لمدة دقيقة واحدة) ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من الوسائط المعقمة ، وقم بإيداعها في وسائط الاختيار الصلبة على النحو الوارد أعلاه. اترك السائل يمتص في وسائط صلبة لمدة 30 دقيقة ، اقلب ألواح الثقافة. ووضعها في حاضنة طوال الليل عند درجة الحرارة الموصى بها للسلالة البكتيرية و / أو البلازميد.

4. فحص تجميع البلازميد الصحيح

  1. بعد الحضانة (الخطوة 3.5) ، قم بإزالة ألواح الاستزراع من الحاضنة وتعداد المستعمرات عن طريق العد المباشر إذا كان هناك العديد من المستعمرات البكتيرية المعزولة في كل لوحة استزراع. حدد عدة مستعمرات (1-10) للفحص لتحديد ما إذا كانت تحتوي على البلازميد المجمع المطلوب.
    1. نقل وسائط النمو المعقمة المكملة بالمضادات الحيوية المناسبة إلى أنابيب زراعة معقمة (زجاج أو بلاستيك). تلقيح وسائط الثقافة عن طريق لمس مستعمرة واحدة بإبرة أو حلقة نقل معقمة ونقل الخلايا إلى وسائط أنبوب الثقافة بإبرة النقل. ضع أنابيب الاستزراع في حاضنة اهتزاز واحتضانها لمدة 16-18 ساعة عند درجة الحرارة الموصى بها للسلالة البكتيرية و / أو البلازميد (النطاق النموذجي من 25 درجة مئوية إلى 37 درجة مئوية).
  2. في اليوم التالي ، قم بعزل الحمض النووي البلازميد من المزارع البكتيرية عن طريق التحلل القلوي6 أو باستخدام مجموعة عزل البلازميد المتاحة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. حدد ما إذا كانت البلازميدات مجمعة بشكل صحيح.
    1. تحديد تركيز الحمض النووي للبلازميدات المعزولة عن طريق القياس الطيفي أو تقدير الهلام.
    2. استخدم كمية (50-150 نانوغرام) من الحمض النووي البلازميد لتفاعل هضم تقييد التشخيص (الحجم النهائي 10 ميكرولتر). حدد إنزيمات التقييد بناء على المكان الذي يتوقع أن تشق فيه الحمض النووي البلازميد المجمع.
      ملاحظة: نوصي بتفاعلين منفصلين: (1) معالجة الحمض النووي البلازميد بإنزيم تقييد من المتوقع أن يشق البلازميد في موقع واحد و (2) معالجة الحمض النووي البلازميدي بإنزيمين مقيدين من المتوقع أن يستئصال كل أو جزء من جزء الحمض النووي المدخل. إنزيمات التقييد متوفرة تجاريا ويجب استخدامها باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    3. بمجرد اكتمال تفاعل إنزيم التقييد ، ادمج مع صبغة التحميل (إلى تركيز 1x) ، وقم بتحميل الخليط بالكامل على هلام الاغاروز ، وافصل شظايا الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز21. استخدم مصباح الأشعة فوق البنفسجية أو LED لتصور شظايا الحمض النووي التي هاجرت في هلام الاغاروز. قارن شظايا الحمض النووي المحظورة بسلم الوزن الجزيئي لتحديد ما إذا كانت هي الوزن الجزيئي المتوقع (الشكل 4). لاحظ البلازميدات ذات أنماط تقييد الإنزيم المتوقعة (تسمى المستنسخة الإيجابية) ؛ تخلص من الأنابيب التي تحتوي على البلازميدات التي لا تحتوي على نمط التقييد المتوقع (تسمى المستنسخة السلبية).
  4. للتأكد من أن المستنسخة الإيجابية لها تسلسل النيوكليوتيدات المتوقع ، أرسل حصة من استنساخ البلازميد الإيجابي للتسلسل.
    ملاحظة: يوصى بتسلسل البلازميد الكامل (على سبيل المثال ، تسلسل المسام النانوية).

النتائج

في هذه المخطوطة ، كمثال على استخدام IVA ، اتبعنا سير عمل IVA المقدم لإعادة استنساخ إطار القراءة المفتوح mCherry في موقع الاستنساخ المتعدد للبلازميد pSU19 لإنشاء بلازميد مطابق ل pSU19mCherry (الشكل 3) 17. تم تصميم البادئات المناسبة ل IVA بناء على خطوتي البروتوك...

Discussion

الخطوة الأكثر أهمية لاستنساخ IVA الناجح هي جزء الحمض النووي وتصميم التمهيدي. تتحسن كفاءة IVA بشكل كبير عندما يتم تصميم الأجزاء المتجانسة بحيث لا يقل طولها عن 15 نقطة أساس مع درجة حرارة انصهار تبلغ حوالي 47-52 درجة مئوية. تم نشر دراسة مفصلة تستكشف تحسين تصميم جزء IVA16

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

يتم تمويل HGB من خلال منح كندا للخريجين - برنامج الماجستير من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) وجائزة الدكتوراه للعميد (جامعة ساسكاتشوان). تم دعم هذا العمل من خلال منحة NSERC Discovery (RGPIN-2021-03066) ، وصناديق بدء التشغيل (إلى أبراج بحيرات جميرا) من جامعة ساسكاتشوان ومؤسسة جون آر إيفانز الكندية للابتكار صندوق قادة جون آر إيفانز (المنحة رقم 42269 إلى أبراج بحيرات جميرا). يشكر المؤلفون السيد إريك تومبس على تقديم صورة لقياس الحمض النووي عن طريق التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb Plus DNA ladderFroggaBioDM015-R500DNA molecular weight marker
AccuReady M Single Channel 0.5-10 µLBulldog BioBPP020Pipettes for transferring liquid
AccuReady M Single Channel Pipettor KitBulldog BioBPK100Pipettes for transferring liquid
AgarBioShop CanadaAGR003.1Solidifying agent for growth medium
AgaroseBiobasicD0012Make agarose gels for DNA electrophoresis
Biometra TOne Analytikjena846-2-070-301Thermocycler
Caps for glass culture tubesFisher Scientific14-957-91Reusable caps for glass culture tubes
DNA primersIntegrated DNA TechnologiesN/ABind and amplify template DNA in PCR reaction
DpnI New England BiolabsR0176SCleave methylated template DNA following PCR amplification
EcoRINew England BiolabsR3101LRestriction enzyme, comes with appropriate buffer
Eppendorf microtubes 1.5 mLSarstedt72.690.300Microtube, 1.5 mL, conical base, PP, attached flat cap, molded graduations and frosted writing space
Ethidium bromideFisher ScientificAAL0748203DNA visualization/intercalating agent, toxic
EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Miniprep KitBiobasicBS614Isolate plasmid DNA from overnight bacterial cultures
GelDoc Go-Gel systemBio-Rad12009077Imaging DNA gels
Glass culture tubesFisher Scientific14-925EGlass culture tubes
myGel Mini Electrophoresis SystemSigma-AldrichZ742288System used for gel electrophoresis
NanoDrop OneThermo FisherND-ONE-WDetermine DNA concentration
PCR Clean Up for DNA SequencingBiobasicBT5100Purify PCR products 
Petri dishSarstedt82.1473.011Petri dish 92 x 16 mm, PS, transparent, with ventilation cams
Pipette tip, 1000 µLSarstedt70.305Pipette tips for 100-1000 µL
Pipette tip, 2.5 µLSarstedt70.3010.265Pipette tips for up to 2.5 µL
Pipette tip, 20 µLSarstedt70.3020.200Pipette tips for up to 20 µL
Pipette tip, 200 µLSarstedt70.3030.020Pipette tips for 1-200 µL
Salt (NaCl)Fisher ScientificS271-10Component of bacterial growth medium (10 g/L)
Single 0.2 mL PCR tubes with flat capFroggaBioTF-1000PCR tubes
Tryptone (Bacteriological)BioShop CanadaTRP402.5Component of bacterial growth medium (10 g/L)
VeriFi DNA polymerasePCR BiosystemsPB10.42-01High fidelity polymerase, the PCR buffer containing Mg2+ and dNTPs is provided with purchase
Xba INew England BiolabsR0145SRestriction enzyme, comes with appropriate buffer
Yeast extractBioShop CanadaYEX401.205Component of bacterial growth medium (5 g/L)

References

  1. Bertero, A., Brown, S., Vallier, L. Methods of cloning. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Chapter 2, 19-39 (2017).
  2. Garcia-Nafria, J., Watson, J. F., Greger, I. H. IVA cloning: A single-tube universal cloning system exploiting bacterial in vivo assembly. Sci Rep. 6, 27459 (2016).
  3. Bubeck, P., Winkler, M., Bautsch, W. Rapid cloning by homologous recombination in vivo. Nucleic Acids Res. 21 (15), 3601-3602 (1993).
  4. Avilan, L. Assembling multiple fragments: the Gibson assembly. Methods Mol Biol. 2633, 45-53 (2023).
  5. Stukenberg, D., et al. The Marburg Collection: A Golden Gate DNA assembly framework for synthetic biology applications in Vibrio natriegens. ACS Synth Biol. 10 (8), 1904-1919 (2021).
  6. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).
  7. Engler, C., Marillonnet, S. Golden Gate cloning. Methods Mol Biol. 1116, 119-131 (2014).
  8. Ma, H., Kunes, S., Schatz, P. J., Botstein, D. Plasmid construction by homologous recombination in yeast. Gene. 58 (2-3), 201-216 (1987).
  9. Cao, P., Wang, L., Zhou, G., Wang, Y., Chen, Y. Rapid assembly of multiple DNA fragments through direct transformation of PCR products into E. coli and Lactobacillus. Plasmid. 76, 40-46 (2014).
  10. Conley, E. C., Saunders, V. A., Saunders, J. R. Deletion and rearrangement of plasmid DNA during transformation of Escherichia coli with linear plasmid molecules. Nucleic Acids Res. 14 (22), 8905-8917 (1986).
  11. Conley, E. C., Saunders, V. A., Jackson, V., Saunders, J. R. Mechanism of intramolecular recyclization and deletion formation following transformation of Escherichia coli with linearized plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 14 (22), 8919-8932 (1986).
  12. Sung, W. L., Zahab, D. M. Site-specific recombination directed by single-stranded crossover linkers: specific deletion of the amino-terminal region of the beta-galactosidase gene in pUC plasmids. DNA. 6 (4), 373-379 (1987).
  13. Mandecki, W. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 83 (19), 7177-7181 (1986).
  14. Jones, D. H., Howard, B. H. A rapid method for recombination and site-specific mutagenesis by placing homologous ends on DNA using polymerase chain reaction. Biotechniques. 10 (1), 62-66 (1991).
  15. Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5alpha-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), e0137466 (2015).
  16. Chen, F., et al. Simplified plasmid cloning with a universal MCS design and bacterial in vivo assembly. BMC Biotechnol. 21 (1), 24 (2021).
  17. Braun, H. G., Kanwal, N., Rivera Lopez, L. F., Thomassin, J. L. Generation of a plasmid series for rapid sub-cloning and use in various Enterobacteriaceae. J Biosci Bioeng. 138 (6), 478-487 (2024).
  18. Kibbe, W. A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Res. 35 (Web Server issue), W43-W46 (2007).
  19. Wallace, R. B., et al. Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch. Nucleic Acids Res. 6 (11), 3543-3557 (1979).
  20. Bzymek, M., Lovett, S. T. Instability of repetitive DNA sequences: The role of replication in multiple mechanisms. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (15), 8319-8325 (2001).
  21. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  22. Sambrook, J., Russell, D. W. The inoue method for preparation and transformation of competent E. coli: "ultra-competent" cells. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  23. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  24. Fürste, J. P., et al. Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a multi-host-range tacP expression vector. Gene. 48 (1), 119-131 (1986).
  25. Bäumler, A. J., et al. Identification of a new iron regulated locus of Salmonella typhi. Gene. 183 (1-2), 207-213 (1996).
  26. Godiska, R., et al. Linear plasmid vector for cloning of repetitive or unstable sequences in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 38 (6), e88 (2010).
  27. Watson, J. F., Garcia-Nafria, J. In vivo DNA assembly using common laboratory bacteria: A re-emerging tool to simplify molecular cloning. J Biol Chem. 294 (42), 15271-15281 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

IVA RecA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved