Utilisation de l’assemblage in vivo pour la construction de plasmides à haut rendement

Résumé

L’assemblage in vivo est une méthode de clonage indépendante de la ligature qui s’appuie sur des enzymes de réparation de l’ADN intrinsèques aux bactéries pour assembler des fragments d’ADN par recombinaison homologue. Ce protocole est à la fois rapide et économique, car peu de réactifs sont nécessaires et l’efficacité du clonage peut atteindre 99 %.

Résumé

L’assemblage in vivo (IVA) est une méthode de clonage moléculaire qui utilise des enzymes intrinsèques présentes dans les bactéries qui favorisent la recombinaison intermoléculaire de fragments d’ADN pour assembler des plasmides. Cette méthode fonctionne en transformant des fragments d’ADN avec des régions d’homologie de 15 à 50 pb en souches d’Escherichia coli de laboratoire couramment utilisées et les bactéries utilisent la voie de réparation indépendante de RecA pour assembler les fragments d’ADN en un plasmide. Cette méthode est plus rapide et plus rentable que de nombreuses méthodes de clonage moléculaire qui reposent sur l’assemblage in vitro de plasmides avant leur transformation en souches d’E. coli . En effet, les méthodes in vitro nécessitent l’achat d’enzymes spécialisées et la réalisation de réactions enzymatiques séquentielles nécessitant des incubations. Cependant, contrairement aux méthodes in vitro , il n’a pas été démontré expérimentalement que l’IVA assemble des plasmides linéaires. Ici, nous partageons le protocole IVA utilisé par notre laboratoire pour assembler rapidement des plasmides et sous-cloner des fragments d’ADN entre des plasmides ayant différentes origines de réplication et marqueurs de résistance aux antibiotiques.

Introduction

Le clonage moléculaire englobe une série de techniques de laboratoire nécessaires pour produire des plasmides contenant de l’ADN recombinant spécifique¹. Ces techniques omniprésentes agissent souvent comme un goulot d’étranglement dans le flux de travail expérimental². De nombreuses techniques de clonage moléculaire reposent sur l’assemblage de fragments d’ADN in vitro à l’aide d’une série de réactions enzymatiques avant la transformation en souche hôte (par exemple, Escherichia coli DH5a) pour l’amplification 3,4,5,6,7. Comme les méthodes d’assemblage de plasmides in vitro reposent sur des enzymes, l’achat ou la purification d’enzymes peut être à la fois coûteux et chronophage.

L’assemblage in vivo (IVA) est une méthode de clonage moléculaire qui repose sur la recombinaison intermoléculaire de fragments d’ADN dans un hôte approprié 8,9,10,11,12. La base de cette méthode était l’observation que les souches ^{de clonage} recA couramment utilisées d’E. coli pouvaient médier la recombinaison intermoléculaire d’une amorce simple brin avec un plasmide clivé par des enzymes de restriction¹³. L’utilisation de la PCR pour générer des extrémités d’ADN homologues pour l’assemblage de plasmides chez E. coli a été décrite dans les années 1990 et cette méthode a été nommée PCR de recombinaison ^3,14. L’efficacité de la PCR de recombinaison était d’environ 50 %¹⁴. Cependant, cette méthode n’a pas été largement adoptée, probablement en raison du coût élevé des amorces et du risque d’introduire des mutations indésirables à l’aide de polymérases basse fidélité pour amplifier de gros fragments d’ADN. Ces inconvénients étaient importants dans les années 1990 et pouvaient être évités en utilisant des méthodes de clonage in vitro telles que le clonage médié par des enzymes de restriction.

Ces dernières années, le coût des amorces a diminué et de nouvelles polymérases commerciales ont augmenté la fidélité de l’amplification par PCR. En conséquence, la PCR de recombinaison a été revisitée en tant que technique de clonage moléculaire rapide et rentable et rebaptisée IVA 2,9,15,16. Avec une faisabilité accrue, l’IVA a été explorée plus avant et la méthode a été optimisée pour atteindre des efficacités de clonage allant jusqu’à 99 %¹⁶. Les optimisations ont permis d’identifier des caractéristiques de l’ADN homologue, telles que le nombre de paires de bases et la température de fusion, qui maximisent l’efficacité de la recombinaison in vivo ^2,16. Une analyse plus poussée a montré que jusqu’à 6 fragments d’ADN allant de 150 pb à 7 kbp pouvaient être assemblés efficacement par IVA¹⁵. De plus, notre groupe a récemment utilisé l’IVA pour assembler une série de plasmides avec différentes cassettes de résistance aux antibiotiques et les origines de la réplication¹⁷. Dans cette étude, le clonage IVA s’est avéré très efficace (71-100 %) avec un petit nombre de clones testés pour chaque plasmide (n = 2)¹⁷. Nous décrivons ici le protocole IVA utilisé par notre laboratoire.

Protocole

1. Concevez des amorces ou des fragments d’ADN avec des extrémités homologues

1. Utilisez un logiciel de traitement de texte ou un logiciel d’analyse d’ADN spécialisé pour assembler artificiellement le plasmide souhaité.
   REMARQUE : Il est souvent utile d’attribuer un code couleur aux fragments d’ADN provenant de différentes sources et de mettre en évidence les régions homologues qui seront utilisées dans les étapes d’assemblage en aval. De plus, il est également utile de coder par couleur l’ADN homologue pour assurer l’assemblage directionnel.
2. Concevez des amorces qui se lient à chaque fragment d’ADN et contiennent 15 à 50 pb de la séquence d’ADN homologue (Figure 1)^2,15.
   1. Pour une efficacité accrue de l’IVA, assurez-vous que les fragments d’ADN homologues ont des températures de fusion de 47 à 52 °C².
      REMARQUE : La température de fusion peut être déterminée à l’aide du logiciel en ligne¹⁸ ou de la formule : Température de fusion = 64,9 + 41 * (nG + nC - 16,4)/(nA + nT + nG + nC), où n = nombre de G, C, A ou T dans la séquence ^6,19.
   2. Évitez les amorces avec des séquences très répétitives comme CATCATCATCATCATCAT qui codent pour une balise HIS, car elles peuvent introduire une instabilité²⁰. Si une séquence finale répétitive d’acides aminés est nécessaire pour des applications telles que l’insertion d’une étiquette poly-HIS, utilisez des codons alternatifs comme CATCACCATCATCACCAC pour diminuer la répétition de la séquence d’acides nucléiques.
      REMARQUE : Les apprêts peuvent être commandés auprès de n’importe quel fournisseur préféré. Si des fragments d’ADN doivent être synthétisés, des extrémités homologues doivent être incorporées dans le fragment d’ADN synthétisé.

2. Amplification de produits d’ADN contenant des extrémités homologues

1. Isolez l’ADN plasmidique ou les matrices d’ADN génomique à l’aide de kits d’isolement d’ADN standard disponibles dans le commerce ou de lyse alcaline ^6,17.
2. Utilisez de l’ADN matrice (à l’étape 2.1) et des amorces contenant des régions homologues (étape 1.2) dans une réaction PCR avec une polymérase haute fidélité disponible dans le commerce. Pour limiter le transfert de la matrice d’ADN dans les réactions en aval, utilisez une faible quantité d’ADN matrice (20 pg-1 ng) dans chaque réaction. Reportez-vous aux recommandations du fabricant pour les composants du mélange de réaction PCR spécifiques aux enzymes et les conditions de cycle de PCR recommandées. Procédez à la réaction PCR.
   1. Configurez les réactions de PCR (50 μL) pour amplifier les fragments d’ADN montrant que la figure 2 contient 100 μM de dNTP, 0,2 μM de chaque amorce d’ADN, de l’ADN matrice (50 pg de pSU19 et 1 ng de pSU18mCherry), 1 mélange de tampon de réaction PCR contenant du Mg²⁺ (concentration finale de 2 mM) et 1 U d’ADN polymérase haute fidélité.
   2. Utilisez un programme de cycle PCR pour amplifier pSU19 et mCherry (Figure 2). Réglez l’étape initiale de dénaturation à 95 °C pendant 5 min, suivie de 10 cycles de 95 °C pendant 15 s, de 55 °C à 0,5 °C par cycle pendant 15 s et de 72 °C pendant 1 min, puis de 20 cycles supplémentaires de 95 °C pendant 15 s, 50 °C pendant 15 s et 72 °C pendant 1 min. Terminez le cycle de PCR par une dernière étape d’extension à 72 °C pendant 10 min.
      REMARQUE : Si un squelette plasmidique doit être amplifié, ajustez la quantité de matrice d’ADN en fonction du poids moléculaire : avec ~20 pg/1 kbp d’ADN plasmidique par 50 μL de réaction PCR (50 pg d’ADN pour pSU19 (illustré)). De plus, ajustez les cycles de PCR pour minimiser le nombre de mutations introduites lors de l’amplification : pour l’amplification des squelettes plasmidiques, aussi peu que 20 à 25 cycles de PCR suffisent.
3. Une fois la réaction de PCR terminée, prélever une aliquote (2 μL) de la réaction de PCR, combiner avec un colorant de charge (jusqu’à une concentration de 1x) et séparer les fragments d’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose²¹. Utilisez un transilluminateur ultraviolet (UV) ou LED pour visualiser les fragments d’ADN qui ont migré dans le gel d’agarose. Déterminez si les produits PCR sont uniques et comparez-les avec l’échelle d’ADN pour vérifier s’ils ont la masse moléculaire attendue (figure 2). Si aucun produit PCR de poids moléculaire correct n’est visualisé, reportez-vous aux recommandations du fabricant pour optimiser la réaction PCR.
   REMARQUE : Lorsque les produits de PCR ne sont pas uniques mais qu’il y a un fragment d’ADN abondant correspondant au poids moléculaire attendu, une réaction PCR supplémentaire peut être évitée.
4. S’il y a plusieurs fragments d’ADN présents dans le gel d’agarose, excisez le fragment d’ADN correspondant au poids moléculaire attendu du gel d’agarose et utilisez un kit d’extraction de gel d’agarose pour récupérer le fragment d’ADN.
5. Pour éliminer l’ADN matrice méthylé des réactions de PCR, ajoutez 1 μL de DpnI directement dans le tube de réaction. Incuber les réactions à 37°C pendant 15 min à toute la nuit.
   REMARQUE : Cette étape facultative est fortement recommandée pour limiter la quantité d’ADN matrice qui est transportée dans les réactions en aval. Cependant, cette étape peut être sautée si de très faibles concentrations d’ADN matrice sont utilisées dans la réaction PCR.
6. Utilisez un kit de purification d’acide nucléique pour éliminer les enzymes résiduelles, les sels, les dimères d’amorce et autres produits indésirables de faible poids moléculaire résultant d’essais enzymatiques.
   REMARQUE : Les étapes 2.1 à 2.6 peuvent être sautées si des fragments d’ADN sont synthétisés.
7. Quantifiez la concentration d’ADN des fragments d’ADN purifiés par spectrophotométrie ou estimation sur gel.

3. IVA (Figure 3)

1. Calculez la quantité d’ADN nécessaire pour chaque réaction IVA (25 à 50 ng d’ADN plasmidique sont recommandés). Utilisez des quantités plus élevées d’ADN plasmidique pour les plasmides de poids moléculaire plus élevé (par exemple, pour les plasmides de 2,3 kbp, utilisez 25 ng de plasmide, mais lorsque les plasmides sont de 9 kbp, utilisez 50 ng dans chaque réaction). Calculer le volume d’ADN d’insertion nécessaire à la réaction ; utilisez un rapport molaire de 1:3 ou 1:5 de l’ADN plasmide :insert.
   REMARQUE : Les calculateurs biographiques en ligne ou les formules fournies ci-dessous peuvent être utilisés pour calculer la quantité molaire d’un fragment d’ADN double brin et déterminer le rapport molaire de chaque fragment d’ADN.
   Nous utilisons la formule suivante pour calculer la quantité molaire d’un fragment d’ADN double brin : pmol = (poids en ng) × 1 000 / (paires de bases × 650 daltons). De plus, les rapports molaires peuvent être calculés comme suit : masse insert (g) = rapport insert/plasmide molaire souhaité × masse du plasmide (g) × rapport entre l’insert et les longueurs du plasmide⁶.
2. Combinez le volume calculé de plasmide et insérez l’ADN dans un tube de microcentrifugation prérefroidi de 1,5 ml et conservez-le sur de la glace.
3. Transvaser le plasmide et insérer le mélange d’ADN de l’étape 3.2 dans une aliquote (25-100 μL) d’E. coli ^chimiquement compétent (p. ex. E. coli DH5a ;²²).
   REMARQUE : Le volume de cellules compétentes utilisé dépend du volume du mélange de plasmide et d’ADN d’insert ; Ce mélange ne doit pas dépasser 10 % du volume des cellules compétentes.
4. Procéder à une transformation par choc thermique²³.
   1. Incuber le mélange d’E. coli chimiquement compétent et d’ADN sur de la glace pendant 30 min.
   2. Transvasez dans un bain-marie à 42 °C pendant 1 min, puis transférez le tube sur de la glace pendant 2 min.
   3. Transférer aseptiquement LB dans le tube pour porter le volume à 1 mL.
   4. Transvaser le volume de 1 mL dans un tube de culture en verre et le placer dans un incubateur à agitation réglé à 37 °C, 220 tr/min ou à la température recommandée pour que la souche bactérienne et/ou le plasmide se rétablisse (plage typique de 25 °C à 37 °C) et permettre la production du marqueur de sélection d’antibiotiques codé par le plasmide.
5. Une fois que les cellules ont récupéré pendant 30 min à 1 h, déposer une aliquote (100 μL de 1 000 μL) de la réaction de transformation sur un milieu de sélection solide et utiliser un épandeur de cellules stériles pour disperser l’aliquote sur la plaque de culture gélosée. Recueillir le reste des cellules transformées par centrifugation (13 000 × g pendant 1 min), jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL de milieu stérile et déposer sur un milieu de sélection solide comme ci-dessus. Laisser le liquide absorber dans un milieu solide pendant 30 min, retourner les plaques de culture. et placez-les dans un incubateur pendant la nuit à la température recommandée pour la souche bactérienne et/ou le plasmide.

4. Criblage pour un assemblage correct du plasmide

1. Après l’incubation (étape 3.5), retirer les plaques de culture de l’incubateur et dénombrer les colonies par comptage direct s’il y a plusieurs colonies bactériennes isolées sur chaque plaque de culture. Sélectionner plusieurs colonies (1 à 10) pour le criblage afin de déterminer si elles contiennent le plasmide assemblé souhaité.
   1. Transférez les milieux de croissance stériles complétés par des antibiotiques appropriés dans des tubes de culture stériles (verre ou plastique). Inoculer le milieu de culture en touchant 1 colonie avec une aiguille ou une boucle de transfert stérile et transférer les cellules dans le milieu du tube de culture avec l’aiguille de transfert. Placez les tubes de culture dans un incubateur agitateur et incubez pendant 16 à 18 h à la température recommandée pour la souche bactérienne et/ou le plasmide (plage typique de 25 °C à 37 °C).
2. Le lendemain, isolez l’ADN plasmidique des cultures bactériennes par lyse alcaline⁶ ou à l’aide d’un kit d’isolement de plasmide disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant.
3. Déterminez si les plasmides sont correctement assemblés.
   1. Quantifier la concentration en ADN des plasmides isolés par spectrophotométrie ou estimation sur gel.
   2. Utiliser une aliquote (50-150 ng) d’ADN plasmidique pour une réaction de digestion de restriction diagnostique (volume final de 10 μL). Sélectionnez les enzymes de restriction en fonction de l’endroit où elles sont censées cliver l’ADN plasmidique assemblé.
      REMARQUE : Nous recommandons deux réactions distinctes : (1) traiter l’ADN plasmidique avec une enzyme de restriction censée cliver le plasmide à un seul endroit et (2) traiter l’ADN plasmidique avec deux enzymes de restriction censées exciser tout ou partie du fragment d’ADN inséré. Les enzymes de restriction sont disponibles dans le commerce et doivent être utilisées conformément aux instructions du fabricant.
   3. Une fois la réaction enzymatique de restriction terminée, combinez avec un colorant de charge (à une concentration de 1x), chargez le mélange entier sur un gel d’agarose et séparez les fragments d’ADN par électrophorèse^{sur gel d’agarose 21}. Utilisez un transilluminateur UV ou LED pour visualiser les fragments d’ADN qui ont migré dans le gel d’agarose. Comparez les fragments d’ADN restreints avec l’échelle de masse moléculaire pour déterminer s’ils correspondent à la ou aux masses moléculaires attendues (figure 4). Prenez note des plasmides avec les modèles de restriction enzymatique attendus (appelés clones positifs) ; Jetez les tubes contenant des plasmides qui n’ont pas le motif de restriction attendu (appelés clones négatifs).
4. Pour vous assurer que les clones positifs ont la séquence nucléotidique attendue, envoyez une aliquote de clones de plasmides positifs pour le séquençage.
   REMARQUE : Le séquençage du plasmide entier est recommandé (par exemple, le séquençage à nanopores).

Résultats

Dans ce manuscrit, à titre d’exemple d’utilisation de l’IVA, nous avons suivi le flux de travail IVA fourni pour recloner le cadre de lecture ouvert mCherry dans le site de clonage multiple du plasmide pSU19 afin de générer un plasmide identique à pSU19mCherry (Figure 3)¹⁷. Les amorces adaptées à l’IVA ont été conçues sur la base des étapes de protocole 1.1 et 1.2. Ensuite, un kit d’isolement plasmidique a été ut...

Discussion

L’étape la plus critique pour un clonage IVA réussi est la conception du fragment d’ADN et de l’amorce. L’efficacité de l’IVA est considérablement améliorée lorsque les fragments homologues sont conçus pour avoir une longueur d’au moins 15 pb avec une température de fusion d’environ 47-52 °C. Une étude détaillée explorant l’optimisation de la conception des fragments d’IVA a été publiée¹⁶. Une autre étape importante pour avoir un...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015-R500	DNA molecular weight marker
AccuReady M Single Channel 0.5-10 µL	Bulldog Bio	BPP020	Pipettes for transferring liquid
AccuReady M Single Channel Pipettor Kit	Bulldog Bio	BPK100	Pipettes for transferring liquid
Agar	BioShop Canada	AGR003.1	Solidifying agent for growth medium
Agarose	Biobasic	D0012	Make agarose gels for DNA electrophoresis
Biometra TOne	Analytikjena	846-2-070-301	Thermocycler
Caps for glass culture tubes	Fisher Scientific	14-957-91	Reusable caps for glass culture tubes
DNA primers	Integrated DNA Technologies	N/A	Bind and amplify template DNA in PCR reaction
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Cleave methylated template DNA following PCR amplification
EcoRI	New England Biolabs	R3101L	Restriction enzyme, comes with appropriate buffer
Eppendorf microtubes 1.5 mL	Sarstedt	72.690.300	Microtube, 1.5 mL, conical base, PP, attached flat cap, molded graduations and frosted writing space
Ethidium bromide	Fisher Scientific	AAL0748203	DNA visualization/intercalating agent, toxic
EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Miniprep Kit	Biobasic	BS614	Isolate plasmid DNA from overnight bacterial cultures
GelDoc Go-Gel system	Bio-Rad	12009077	Imaging DNA gels
Glass culture tubes	Fisher Scientific	14-925E	Glass culture tubes
myGel Mini Electrophoresis System	Sigma-Aldrich	Z742288	System used for gel electrophoresis
NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	Determine DNA concentration
PCR Clean Up for DNA Sequencing	Biobasic	BT5100	Purify PCR products
Petri dish	Sarstedt	82.1473.011	Petri dish 92 x 16 mm, PS, transparent, with ventilation cams
Pipette tip, 1000 µL	Sarstedt	70.305	Pipette tips for 100-1000 µL
Pipette tip, 2.5 µL	Sarstedt	70.3010.265	Pipette tips for up to 2.5 µL
Pipette tip, 20 µL	Sarstedt	70.3020.200	Pipette tips for up to 20 µL
Pipette tip, 200 µL	Sarstedt	70.3030.020	Pipette tips for 1-200 µL
Salt (NaCl)	Fisher Scientific	S271-10	Component of bacterial growth medium (10 g/L)
Single 0.2 mL PCR tubes with flat cap	FroggaBio	TF-1000	PCR tubes
Tryptone (Bacteriological)	BioShop Canada	TRP402.5	Component of bacterial growth medium (10 g/L)
VeriFi DNA polymerase	PCR Biosystems	PB10.42-01	High fidelity polymerase, the PCR buffer containing Mg2+ and dNTPs is provided with purchase
Xba I	New England Biolabs	R0145S	Restriction enzyme, comes with appropriate buffer
Yeast extract	BioShop Canada	YEX401.205	Component of bacterial growth medium (5 g/L)